Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây lược vàng callisia fragrans (lindl ) woodson

Trên thế giới có rất ít công bố khoa học về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây lược vàng, ở Nga đã có một số kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học nhưn

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO B ộ Y TẼ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC • • Dược • HÀ NỘI •

HOÀNG THỊ DIỆU HƯƠNG

THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT Số

CALLISIA FRAGRANS (LINDL.) WOODSON

LUẶN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC • • • •

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các chuyên gia trong nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp, bạn bè và gia đình

Trước hết, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới TS T rịn h Thị Điệp, người đã tận tình hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo, luôn quan tâm và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tiếp theo tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các cô chú, anh chị

em ở K hoa H óa thực v ật - Viện Dược liệu, nơi đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS C hu Đ ình K ính - Viện

Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam; PGS.TS Nguyễn Trọng

Thông - Bộ môn Dược lý, Trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu để tôi thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng Sau Đại học, các thầy cô giáo, các kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu, Dược học cổ truyền và Thực vật Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, là lời cảm ơn sâu sắc nhất, tôi muốn gửi tới gia đình, bạn

bè, những người luôn ủng hộ và động viên tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống

Một lần nữa, tôi xin cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!

Hà Nội, tháng 12 năm 2010

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẤT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, Đ ồ THỊ

ĐẶT VẤN Đ Ề 1

CHƯƠNG 1 TỔNG Q U A N 3

1.1 v ề đăc điểm thưc v â t 3• • •

1.1.1 Vài nét về chi Callỉsia L oefling ; 3

1.1.2 Loài Callỉsia fragrans (Lindl.) Woodson 3

1.2 v ề thành phần hóa học 4

1.2.1 Các hợp chất phen o l 5

1.2.2 Saponin 6

1.2.3 Các acid hữu c ơ 7

1.2.4 Dầu béo 7

1.2.5 Carbohydrat 8

1.2.6 Các acid am in 8

1.2.7 Các nguyên tố vô c ơ 8

1.3 v ề tác dụng sinh học 9

1.3.1 Sử dụng chi Caỉlisia trong dân gian 9

1.3.2 Tác dụng chống oxy hóa 9

1.3.3 Tác dụng bảo vệ khả năng hoạt động 10

1.3.4 Tác dụng chống stress 10

1.3.5 Tác dụng trên hệ miễn d ịc h 11

1.3.6 Tác dụng chống v iru s 11

1.4 Tác dụng sinh học của một số chất có trong cây lược vàng Callisia fragrans (Lindl.) W oodson 11

1.5 Một số chế phẩm có chứa lược vàn g 13

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 14

2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 14

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 14

2.1.2 Động vật thí nghiệm 14

2.1.3 Các hóa chất dùng trong nghiên c ứ u 14

2.2 Phương pháp nghiên cứ u 15

2.2.1 Nghiên cứu về thực v ật 15

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa h ọ c 15

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng sinh h ọ c 17

2.2.3.1 Phương pháp thử độc tính c ấ p 17

2.2.3.2 Phương pháp thử tác dụng tăng cường miễn d ịch 18

2.2.3.3 Phương pháp thử tác dụng chống oxy hóa ỉn vivo 22

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u 25

3.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật 25

3.1.1 Mô tả đặc điểm thực vật và thẩm định tên khoa học 25

3.1.2 Xác định đặc điểm vi h ọ c 26

3.1.2.1 Đặc điểm vi p h ẫu 26

3.1.2.2 Đặc điểm b ộ t 27

3.2 Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học 29

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá và thân phụ lược v à n g 29

3.2.2 Chiết xuất và phân lập các họp chất từ thân phụ lược vàng 30

3.2.3 Xác định cấu trúc các chất phân lập được từ thân phụ lược vàng 33

3.2.3.1 Chất LV H 53-56 33

3.2.3.2 C h ấ tL V E ló 36

3.2.4 Định lượng hợp chất phenol toàn phần trong lược vàng 41

3.3 Ket quả nghiên cứu về tác dụng sinh học 43

3.3.1 Kết quả thử độc tính cấp 43

3.3.2 Kết quả thử tác dụng tăng cường miễn dịch 45

3.3.2.1 Nghiên cứu đánh giá tình trạng chung hệ miễn dịch 45

3.3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của LVL và LVT lên đáp ứng miễn dịch dịch thể với kháng nguyên 49

3.3.2.3 Nghiên cứu đánh giá đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế b à o 52 3.3.3 Ket quả thử tác dụng chống oxy hóa in vivo 55

CHƯƠNG 4 BÀN L U Ậ N 57

4.1 v ề thực vật 57

4.2 v ề thành phần hóa học 57

4.3 v ề tác dụng sinh học 60

KẾT LUẬN VÀ KIÉN N G H Ị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Phổ cộng hưỏng từ hạt nhân cacbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

Carbon tetraclorua Cộng sự

CyclophosphamidDoublet

Doublet o f doubletDistortionless Enhancement by Polarisation Transfer

1,1 -diphenyl-2-picrylhydrazylPhổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (Two-Dimensional NMR) Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry)

Hồng cầu cừuHeteronuclear Multiple Bond CoherencePhổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear MagneticResonance Spectroscopy)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)

Heteronuclear Single Quantum Coherence Interleukin

Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)Cao đông khô dịch ép lá lược vàng

QuartetSingletSắc ký cột (Column Chromatography)Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) Triplet

Tế bào lympho lách tạo quầng dung huyết Yếu tố hoại tử khối u

Thuốc thử

Độ dịch chuyển hóa học (parts per milion)

Bảng 1.1 Tổng hợp tác dụng sinh học của một số chất có trong cây lược vàng

Callisia fragrans 11

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây lược vàng 29

Bảng 3.2 Các dữ liệu phổ NMR của chất L V H 53-56 33

Bảng 3.3 Các dữ liệu phổ NM R của chất A 37

Bảng 3.4 Các dữ liệu phổ NM R của chất B 39

Bảng 3.5 Độ hấp thụ của các dung dịch acid gallic tại bước sóng 760nm 41

Bảng 3.6 Kết quả định lượng họp chất phenol toàn phần trong l á 42

Bảng 3.7 Kết quả định lượng hợp chất phenol toàn phần trong thân p h ụ 43 Bảng 3.8 Số liệu thử độc tính cấp của cao đông khô lá lược vàng L V L 43

Bảng 3.9 Số liệu thử độc tính cấp của cao chiết bằng cồn 50% thân phụ lược vàng LVT 44

Bảng 3.10 Trọng lượng lách tương đối ở các lô thí nghiệm 45

Bảng 3.11 Trọng lượng tuyến ức tương đối ở các lô thí nghiệm 46

Bảng 3.12 Số lượng bạch cầu trong máu ngoại vi chuột ở các lô thí nghiệm 47 Bảng 3.13 Số lượng bạch cầu tuyệt đối ở máu ngoại v i 48

Bảng 3.14 Tỷ lệ tế bào lympho lách tạo HHMC với HCC ở các lô thí nghiệm 49

Bảng 3.15 Tỷ lệ tế bào lympho lách tạo QDH ở các lô thí nghiệm 50

Bảng 3.16 Tỷ lệ tế bào lympho BcDi9 trong lách phân lập ở các lô thí nghiệm 51

Bảng 3.17 Chỉ số phản ứng bì với kháng nguyên OA của các lô thí nghiệm 52 Bảng 3.18 Tỷ lệ tế bào lympho TcD 3 trong lách chuột ở các lô thí nghiệm 53 Bảng 3.19 Nồng độ IL-2 trong tế bào lympho lách nuôi cấy của các lô thí nghiệm 54

Bảng 3.20 Nồng độ TN F-a trong tế bào lympho lách nuôi cấy của các lô thí nghiệm 54

Bảng 3.21 Hàm lượng MDA trong gan chuột và tỷ lệ % giảm so với đối chứng gây bệnh ở các lô thí nghiệm 56

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIẺƯ

Hình 2.1 Ảnh lá cây lược vàng 14

Hình 2.2 Ảnh thân phụ cây lược vàng 14

Hình 3.1 Ảnh cây lược vàng 25

Hình 3.2 Ảnh hoa lược vàng 25

Hình 3.3 Ảnh vi phẫu lá lược vàng 26

Hình 3.4 Ảnh vi phẫu thân phụ lược v à n g 27

Hình 3.5 Ảnh bột lá lược v à n g 28

Hình 3.6 Ảnh bột thân phụ lược v à n g 28

Hình 3.7 Sơ đồ chiết xuất và phân lập các chất từ thân phụ lược v à n g 32 Hình 3.8 Cấu trúc hóa học của chất LVH53-56 36

Hình 3.9 Cấu trúc hóa học của chất A 39

Hình 3.10 Cấu trúc hóa học của chất B 41

Hinh 3.11 Đường chuẩn acid gallic 42

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐÒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐÈ •

Cây lược vàng có nguồn gốc ở Mexico, mới được du nhập vào nước ta trong những năm gần đây Lược vàng còn có các tên gọi khác là cây lan vòi, địa lan vòi, lan rũ, bạch tuộc thường được người dân trồng làm cây cảnh Nhưng thời gian gần đây, cây lược vàng đang được dư luận trong nước rất quan tâm về tác dụng chữa bệnh của nó Theo kinh nghiệm dân gian ở Nga, lược vàng đã được sử dụng để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau thấy có hiệu quả như: viêm đường hô hấp, viêm đường tiết niệu, viêm răng lợi, bệnh dạ dày, đau xương khóp đến các bệnh về tim mạch, huyết áp, thậm chí cả u bướu

ở Việt Nam, lược vàng là đối tưọng hoàn toàn mới chưa từng có tên trong bất kỳ một tài liệu về cây thuốc nào, thậm chí chưa có tài liệu về thực vật học nào đề cập đến Việc sử dụng lược vàng để chữa bệnh của người dân chủ yếu là theo kinh nghiệm dân gian

Trên thế giới có rất ít công bố khoa học về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây lược vàng, ở Nga đã có một số kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học nhưng nghiên cứu về tác dụng sinh học của lược vàng còn rất ít Mặc dù vậy, cây lược vàng hiện vẫn đang được ứng dụng rất rộng rãi để chữa các bệnh dạ dày - ruột, bệnh túi mật, lá lách; các bệnh đường hô hấp như ho, viêm họng, viêm phế quản, hen phế quản; các bệnh đường tiết niệu; các bệnh ngoài da như viêm da, zona, chàm, làm thuốc giảm đau, chống nóng rát, giúp vết thương chóng lành Các sách báo về lược vàng, các loại thuốc chữa bệnh, thực phẩm chức năng trong đó lược vàng là dược liệu chính đang xuất hiện ngày càng nhiều [101], [102], [105\

Nhìn chung, lược vàng hầu như mới chỉ được dùng theo kinh nghiệm dân gian, chưa được nghiên cứu đầy đủ về mặt dược liệu học Đe góp phần

tạo cơ sở khoa học cho việc giải thích cách sử dụng cây lược vàng theo kinh nghiệm dân gian của người dân, và để có thể sử dụng lược vàng làm thuốc một cách hiệu quả và an toàn, đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành

phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây lược vàng Callisia

fragrans (Lindl.) W oodson” ở Việt Nam đấ được thực hiện với ba mục tiêu:

1 Xác định đặc điểm thực vật và thẩm định tên khoa học

2 Nghiên cứu thành phần hóa học

3 Thử một số tác dụng sinh học của dược liệu nghiên cứu

Đe đạt được ba mục tiêu trên, đề tài được tiến hành với những nội dung sau:

> Nghiên cứu về đặc điểm thực vật:

o Mô tả đặc điểm hình thái, thẩm định tên khoa học của cây nghiên cứu

o Xác định đặc điểm vi học gồm đặc điểm vi phẫu và đặc điểm bột

> Nghiên cứu về thành phần hóa học:

o Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong dược liệu

o Chiết xuất và phân lập một số chất chính

o Xác định cấu trúc các chất phân lập được

o Định lượng họp chất phenol toàn phần

> Nghiên cứu về tác dụng sinh học:

o Thử độc tính cấp của dược liệu

o Thử tác dụng tăng cường miễn dịch

o Thử tác dụng chống oxy hóa ỉn vỉvo

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 VÈ ĐẶC ĐIỂM T H ựC VẬT

1.1.1 Vài nét về chi Callisia Loefling

Chi Callỉsia Loefling là một chi nhỏ thuộc họ Commelinaceae (Thài

lài) Chi này có khoảng 20 loài tập trung ở châu Mỹ với trung tâm phân bố là Mexico

Những loài thuộc chi này có dạng thân thảo, sống nhiều năm hiếm khi

là cây một năm Rễ mảnh, vài loài có dạng củ Thân trườn hoặc bò sát đất Lá lưỡng phân hoặc xếp xoắn ở ngọn, không cuống Cụm hoa dạng xim, như tán, xếp xít, không cuống, được bao bởi lá bắc; phát hoa ở ngọn hoặc nách lá, thưòmg gồm nhiều chùy hoặc gié, đơn vị được tạo thành bởi các cặp xim Lá bắc khó nhận, nhỏ hơn Icm; không có mo; có các lá dạng lá bắc tồn tại Hoa

lưỡng tính (cả lưỡng tính và có hoa đực ở c repens), đối xứng tỏa tròn; đài

rời, gần bằng nhau; cánh hoa rời, trắng hoặc hồng (hiếm khi có màu xanh), dài bằng nhau, có dạng vuốt; nhị (1-3) hoặc 6, hữu thụ, bằng nhau; chỉ nhị trơn hoặc có rãnh; bầu 2-3 ô, lá noãn (1 )2 mỗi ô Quả nang, 2-3 mảnh Hạt(1 )2 hoặc 3 mỗi mảnh, có dạng hình trụ ngắn, rốn hạt dạng điểm [36]

Đa số các loài thuộc chi Callisia được trồng làm cảnh như Callisia

repens (Jacquin) Linnaeus, Callisỉa elegans Alexander ex H E Moore ở

Trung Quốc chỉ có 1 loài là Callisia repens (Jacquin) Linnaeus được nhập

trồng làm cảnh ở Hồng Kông [35'

ở Việt Nam, chưa phát hiện thấy các loài thuộc chi này phân bố trong

tự nhiên Trong vài năm trở lại đây loài Callỉsỉa fragrans (Lindl.) Woodson,

được nhập trồng vào nước ta với tên gọi là lan vòi hay lược vàng

1.1.2 Loài Callisia fragrans (Lindl.) Woodson

Đặc điểm thực vật của Callisỉa fragrans (Lindl.) Woodson: là cây thảo

nhiều năm, thân mọng nước có thể dài tói lOOcm hoặc hơn, phân nhánh với thân bò ở gốc Lá mọc tập trung ở ngọn thân; rải rác ở phía dưới, dạng mác thuôn, dài 18-25cm, rộng 3,5-4cm, cuống lá có gân rõ, ôm thân, có lông mịn

và thường có sọc tía Hoa mọc thành cụm 2-3 hoa dạng xim trên phát hoa hình chuỳ dài tới 60cm, mỗi cặp xim được ôm bởi các lá bắc dạng răng cưa (3 răng) dài 10-15mm; lá đài trong suốt, màu trắng, khô xác, dạng mác, dài 5-

Cây ra hoa vào mùa xuân [36],

Cây ưa những nơi đất màu mỡ, ẩm, thoát nước tốt và che bóng một phần Nếu trồng ở nơi nhiều ánh sáng, lá thường chuyển sang màu tía và thân mọc thấp Cây được nhân trồng bằng hạt và cành giâm

Callisỉa fragrans được trồng làm cảnh ở nhiều nước bởi có thân bò khá

đẹp và dễ trồng Người ta thường trồng Callisia fragrans trong các chậu treo

để thân buông rủ tạo dáng hoặc phủ kín mặt đất tạo thảm xanh trong vườn nhà Do khả năng phát triển nhanh, ở Florida - Mỹ, loài cây này được xếp vào danh sách “Các loài thực vật nhập trồng xâm lấn” [103]

1.2 VÈ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Trong các loài thuộc chi Callisia có một số loài như c elegans, c

fragrans, c ỉnsignỉs, c macdougallii, c repens, c soconusensis đã được

Maria A và cs khảo sát sơ bộ bằng sắc ký giấy và sắc ký lóp mỏng cho thấy đều có chứa flavon C-glycosid, một nhóm chất thường gặp trong các cây

thuộc họ Commelinaceae [65] Lá của các loài c elegans, c ỉnsignis, c

macdougallii được xác định có cyanidin 3,7,3’-triglucosid acyl hóa [44].

Từ năm 2007, các tác giả Nga và Việt Nam bắt đầu nghiên cứu sâu về

nhóm chất khác nhau như chất béo, carotenoid, terpenoid, acid hữu cơ, họp chất phenol, flavonoid, dẫn chất anthocyan, acid amin, đường tự do và

polysaccharid [28], [74], [75], [98] Dưới đây là tổng hợp các kết quả nghiên cứu hóa học về loài cây này.

1.2.1 Các hợp chất phenol

Bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp sắc ký lớp mỏng điều chế, Olennikov D.N và cs đã phân lập được từ dịch ép thân phụ lược vàng 7 họp chất phenol là aloe-emodin, umbelliferon, scopoletin, quercetin, acid gallic, acid caffeic và acid chicoric [74‘

Khi phân tích dịch ép này bằng HPLC, đối chiếu với các chất chuẩn đã biết, đã xác định ngoài 7 chất nói trên còn có kaempferol, acid femlic [75].

Ket quả định lượng cho thấy hàm lượng các nhóm hợp chất phenol chính trong dịch ép này (so với cắn khô kiệt) là: coumarin (umbelliferon, scopoletin) 0,14%, anthraquinon (aloe-emodin) 0,008%, acid phenolic (acid gallic, caffeic và chicoric) 0,37%, flavonoid (kaempferol, quercetin) 0,05% [75]

Năm 2009, Châu Văn Minh và cs đã công bố phân lập được 1 hợp chất flavon C-glycosid là isoorientin từ dịch chiết methanol toàn cây lược vàng 161

1.2.2 Saponỉn

Ginsenosid R gl đã được Phan Văn Kiệm và cs phân lập từ cây lược vàng trồng tại Việt Nam [15'

Ginsenosid R gl

1.2.3 Các acid hữu cơ

Ngoài các acid phenolic nói trên, trong thân và lá cây lược vàng có acid ascorbic [74], [75] Hàm lượng tổng các acid hữu cơ trong dịch ép thân phụ lược vàng là 37,05% so với cắn khô kiệt [75]

1.2.4 Dầu béo

Phân tích dầu béo trong thân và lá c fragrans, Chemenco T v và cs

thấy có [28]:

- Phân đoạn trung tính: hydrocarbon parafmic, olefinic, aromatic;

triterpenol, sterol, acid triteipenic và chlorophyl

1.2.5 Carbohydrat

Trong dịch ép thân phụ lược vàng có chứa tới 25,13% đường tự do và 2,44% polysaccharid so với cắn khô kiệt [75] Thủy phân polysaccharid thì thu được các đường đơn là glucose, mannose, acid glucuronic, glucosamin và galactosamin [98], [73

1.2.6 Các acid amin

Phân tích, so sánh thời gian luTi với 24 acid amin chuẩn, Hikolaeva G

và cs đã xác định được 18 acid amin, trong đó 15 acid amin tự do và 14 acid amin liên kết trong dịch ép thân phụ lược vàng tươi; asparagin, acid aspartic, threonin, serin, glutamin, acid glutamic, glycin, alanin, valin, methionin, leucin, isoleucin, tyramin, phenylalanin, lysin, histamin, arginin và acid y- aminobutyric [7 ĩ

Từ cây lược vàng trồng tại Việt Nam, Phan Văn Kiệm và cs đã phân lập được L-tryptophan [15

OH

L-tiyptophan

1.2.7 Các nguyên tố vô cơ

Trong thân phụ cây lược vàng trồng ở Nga đã xác định được 11 nguyên

tố vô cơ, trong đó Ba, Mn và Cu có hàm lượng cao nhất [71]

Nhìn chung, chi Callisia còn ít loài được nghiên cứu về thành phần hóa

đầu nghiên cứu từ 2007, nhưng cho đến nay các tác giả Nga và Việt Nam đã

này với 10 chất đã được phân lập và xác định cấu trúc và những phân tích sâu

về thành phần các nhóm chất nliư carbohydrat, lipid, acid amin

1.3 VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC

1.3.1 Sử dụng chi Callisia trong dân gian

Các loài thuộc chi Calỉisỉa chủ yếu được trồng làm cảnh Một số loài

sau đây đã được dùng làm thuốc theo kinh nghiệm dân gian của một số nước châu Mỹ:

- c grasilỉs: làm đẹp tóc, chữa cao huyết áp, thấp khớp, chữa mụn cơm

[20], [89],

- c repens: chữa cảm cúm, hoại thư, viêm dạ dày, cao huyết áp, nhiễm

trùng, thấp khớp, làm thuốc thư giãn [89

Loài c fragrans được dùng như một cây thuốc dân gian ở Nga để

chữa các bệnh dạ dày - ruột, bệnh túi mật, lá lách; các bệnh đường hô hấp như ho, viêm họng, viêm phế quản, hen phế quản; các bệnh đường tiết niệu; các bệnh ngoài da như viêm da, zona, chàm, bỏng, dị ứng, hắc lào, vết thương ngoài da và cả ung th ư [102],[105]

v ề kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học của các loài Callisỉa, chúng

tôi tìm thấy một số công bố trong 2 năm gần đây của các tác giả Nga về c

fra g m n s và một bài báo nói đến tác dụng chống herpes vims của dịch chiết

cồn c grasilis Những kết quả cụ thể được trình bày dưới đây.

1.3.2 Tác dụng chống oxy hóa

Dịch ép thân phụ của loài c fragrans có tác dụng chống oxy hóa ỉn

đoạn có tác dụng mạnh nhất lần lượt là phân đoạn chiết ethyl acetat (IC50

0,79mg/ml), với O2’’ (IC50 0,36mg/ml), gây bất hoạt H2O2 (IC50 0,57mg/ml)

l,28mg/ml) [75],

1.3.3 Tác dụng bảo vệ khả năng hoạt động

với liều 5ml/kg một lần/ngày đã làm tăng thời gian bơi của chuột từ 8,8 phút lên 11,5 phút nhưng chưa có ý nghĩa thống kê Tuy nhiên, khi tăng liều lên lOml/kg thể trọng/ngày dịch ép này đã làm tăng thời gian bơi của chuột có ý nghĩa gấp hơn 2 lần so với nhóm chứng (23,7 phút so với 11,3 phút) Phân tích sinh hóa cho thấy tác dụng bảo vệ khả năng hoạt động này là do dịch ép thân lược vàng đã hoạt hóa quá trình tổng hợp ATP trong cơ xương và cơ tim, làm tăng hàm lượng glycogen trong gan và giảm nồng độ acid pyruvic và acid lactic trong máu Ngoài ra, dịch ép này đã giúp làm giảm stress oxy hóa của chuột bị cưỡng bức chạy, thể hiện ở việc làm giảm nồng độ MDA trong huyết thanh, trong cơ xưong và cơ tim chuột thí nghiệm cũng như làm tăng hoạt độ enzym catalase [99]

1.3.4 Tác dụng chống stress

Trên mô hình gây stress ở chuột bằng cách giữ tình trạng không hoạt

ngày trước khi gây stress không có ảnh hưởng có ý nghĩa lên trọng lượng của tuyến ức, tuyến tụy, nhưng đã gây tăng có ý nghĩa số lượng tế bào có nhân của tuyến ức và tuyến tụy lên tương ứng là 36 và 49% ở chuột được uống dịch ép thân lược vàng, tình trạng loét dạ dày do stress giảm còn 25% so với

lược vàng trong khi nhóm đối chứng bị u 100% Tác dụng chống stress này cũng được cho là do tác dụng chống oxy hóa của dịch ép này, biểu hiện ở việc

làm giảm 40% nồng độ MDA trong huyết thanh và làm tăng nồng độ glutation 3 lần, tăng hoạt độ các enzym catalase (54%) và superoxid dismutase (20%) [100'.

1.3.5 Tác dụng trên hệ miễn dịch

Thử nghiệm trên mô hình gây ức chế miễn dịch ở chuột bằng azathioprin, dịch ép thân phụ lược vàng đã thể hiện tác dụng tăng cường miễn dịch, làm tăng trọng lượng tuyến ức (12%) và lách (27%) bị suy giảm do azathioprin, tăng 25% số lượng tế bào có nhân của hai cơ quan này Dịch ép này cũng làm tăng chỉ số thực bào 1,5 lần so với nhóm chứng bệnh và đưa các

1.3.6 Tác dụng chống virus

Dịch chiết ethanol của c gracilis thể hiện hoạt tính chống herpes virus trên thử nghiệm in vitro với herpes simplex vims type 2 (HSV-2) với trị số

EC5o = 10,5 |ig/ml [20]

1.4 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT s ố CHẤT c ó TRONG CÂY

LƯỢC VÀNG CalUsia fragrans (Lindl.) Woodson.

Các chất đã được biết có trong cây lược vàng đều là những chất quen biết đã được phân lập từ nhiều cây thuốc khác và đã được nghiên cứu chứng minh có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý Sau đây là tổng họp một số kết

Bảng 1.1 Tổng họp tác dụng sinh học của một số chất có trong

cây lược vàng Callỉsỉa fragrans

- Chông oxy hóa

- Hạ đường huyết, chống đái tháo đưcmg, chống tăng lipid máu

- Chông oxy hóa, bảo vệ gan

- Tác dụng gây chết tế bào theo chưong trình trên nhiều dòng tế bào ung thư, phòng chống ung thư

[39],[43],[53],[86] [39], [43], [53], [63], [96]

[46], [95]

[97]

[80]

[47]

1.5 MỘT SỚ CHẾ PHẨM c ó CHỨA LƯỢC VÀNG

1.5.1 Kem bôi Callìsia fragrans với nọc ong

• Dạng bào chế: tuýp kem 75 ml

• Nơi sản xuất: Nga - ưcraina

• Thành phần: nước với ion bạc, sáp ong, nọc ong, dịch chiết lược vàng,

mềm dẻo hơn Hỗ trợ điều trị

viêm đầu dây thần kinh, đau thần

kinh tọa, gout [102]

1.5.2 Trà túi lọc Tâm Lan

• Dạng bào chế: trà túi lọc 120g/ hộp (30 túi X 4g)

• Nơi sản xuất: Cơ sở Võ Thị Lan, Tây Ninh

• Thành phần: Cây hoàn ngọc (rễ, thân, lá) 40%, cúc hoa 20%, kim ngân

• Chức năng: Hỗ trợ điều trị rối loạn tiêu hóa, thanh nhiệt giải độc cho cơ

thể

• Cách sử dụng: Mỗi lần cho túi lọc vào cốc nước sôi, sau 3-5 phút là

uống được, có thể uống nhiều lần, dùng thay nước uống hằng ngày [104],

v > L A N *'

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ

Hình 2 ! Ảnh lá cây lược vàng

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN c ứ u

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cún

Nguyên liệu nghiên cứu là lá và

thân phụ của cây lược vàng, được thu

hái tại huyện Yên Dũng, tỉnh Bắc

Giang vào tháng 7-8/2009 và tháng 3-

4/2010

Tiêu bản mẫu cây

được lưu giữ tại Phòng

tiêu bản, Bộ môn Thực

vật, Trường Đại học Dược

Hà Nội, sổ hiệu mẫu

HNIP/17702/10

2.1.2 Động vật thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng đực và cái (chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng

lượng trung bình 22 g ± 2 g) được Viện Vệ sinh dịch tễ Hà Nội cung cấp

2.1.3 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

- Các hóa chất và thuốc thử dùng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược điển Việt Nam IV

- Các dung môi chiết xuất dùng trong công nghiệp như: ethanol, cloroform, ethyl acetat, methanol, «-hexan

- Chất chuẩn: acid gallic chuẩn được Viện Kiểm nghiệm Trung ương,

Bộ Y tế cung cấp

Hình 2.2 Ảnh thân phụ cây lược vàng

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ủ u

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật

- Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật, điều kiện sinh trưởng

và phát triển của cây tại thực địa

- Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây và lưu giữ tiêu bản

- Trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái, so sánh với tiêu bản lưu trữ

và các tài liệu phân loại thực vật, với sự giúp đỡ của các chuyên gia phân loại thực vật để thẩm định tên khoa học của mẫu cây nghiên cứu [35], [36]

- Nghiên cứu cấu tạo vi học: cắt, nhuộm và làm tiêu bản vi phẫu, soi bột lá và thân phụ lược vàng, quan sát các đặc điểm, mô tả và chụp ảnh tiêu bản dưới kính hiển vi [14

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

- Chiết xuất, phân tích sơ bộ các nhóm chất theo phương pháp phân tích sàng lọc các nhóm họp chất thiên nhiên có trong cây bằng phản ứng hóa học đặc trưng và bằng SKLM [2] [10

- Chiết xuất dược liệu bằng các dung môi thích hợp với độ phân cực tăng dần

- Phân lập các hợp chất bằng SKC pha thưòng, pha đảo Theo dõi các phân đoạn bằng SKLM

+ SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý và các phương pháp phổ bao gồm: điểm chảy, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều [12],[17]:

+ Điểm chảy được đo trên máy Stvart tại Khoa Hóa thực vât, Viện Dược liệu

LTQ Orbitrap (Hãng Thermo) tại Khoa Hóa, trường Đại học Khoa học

Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và phổ khối phân giải cao được đo trên máy FT-ICR-MS (Hãng Varian) tại Viện Hóa học, Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (ID và 2D-NMR) được đo trên máy Bm ker Avance AM500 FT-NMR tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Định lượng hợp chất phenol toàn phần theo phương pháp đo độ hấp thụ dựa vào đường chuẩn [7] Tiến hành định lượng trong điều kiện tránh ánh sáng:

+ Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50mg acid gallic

chuẩn vào một bình định mức 1 OOml màu nâu, thêm nước để hòa tan và vừa

đủ đến vạch Hút chính xác 5ml dung dịch trên vào bình định mức 50ml màu nâu, thêm nước vừa đủ, lắc đều (dung dịch có nồng độ acid gallic khoảng 0,05mg/ml)

+ X ây dựng đường chuẩn: Hút chính xác lần lượt l,Oml; 2,0ml; 3,0ml;

4,0ml; 5,0ml dung dịch chuẩn vào các bình định mức 25ml riêng biệt màu nâu, thêm vào mỗi bình Iml dung dịch phosphotungstomolybdic acid (TT),

ứng, thêm dung dịch natri carbonat 29% đến vạch, lắc đều Đo độ hấp thụ của các dung dịch thu được ở bước sóng 760nm, chuẩn bị song song một mẫu

trắng Xây dựng đường chuẩn với độ hấp thụ là trục tung và nồng độ dung dịch là trục hoành.

+ Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác 2g dược liệu cho vào bình

định mức lOOml màu nâu, thêm 80ml nước, để qua đêm, sau đó lắc siêu âm trong 10 phút, để nguội, thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều, để lắng Lọc bỏ khoảng 20ml dịch lọc đầu, phần dịch lọc còn lại để tiến hành phản ứng Hút chính xác 2,0ml dung dịch thử vào bình định mức 25ml màu nâu Tiến hành theo như phần xây dựng đường chuẩn bắt đầu từ “thêm Iml dung dịch phosphotungstomolybdic acid”, thêm lOml nước Đo độ hấp thụ của dung dịch thu được như trên và tính toán hàm lượng họp chất phenol toàn phần theo acid gallic trong dung dịch thử dựa trên đường chuẩn đã xây dựng

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học

Behrens Công thức tính: LD50= L D ioo - [ Z (d ^ z)] X 1/n

z là số chuột chết trung bình giữa 2 liều kế tiếp

2.2.3.2 Phương pháp thử tác dụng tăng cường miễn dịch

"^Nguyên vật liệu:

+ Mầu thử: Cao đông khô lá lược vàng LVL và cao chiết cồn 50% thân phụ lược vàng LVT

+ Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng trưởng thành, trọng lượng

+ Cyclophosphamid: dạng thuốc bột, biệt dược Endoxan lọ 200 mg của hãng ASTA Medica, Đức

+ Levamisol dạng bột trắng, hàm lượng 98,6% do phòng Hoá lý I, Viện Kiểm nghiệm Trung ương, Bộ Y tế cung cấp

mẫn cảm cho chuột

+ Dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin): nồng độ 1%, dùng làm kháng nguyên đối chứng để kiểm tra mức độ của phản ứng quá mẫn chậm của chuột với kháng nguyên OA đã mẫn cảm

+ Hồng cầu cừu (HCC): máu tĩnh mạch cừu được lấy trong điều kiện

vô trùng, bảo quản trong dung dịch alsever (glucose 24,6g, natricitrat 9,6g,

trong thời hạn 2 tuần

+ Hoá chất và máy huyết học tự động ABC (Animal Blood Counter) của hãng Ugo- Basile, Italy

+ Kit định lượng IL-2, TN F-a, kháng CD3, kháng CD 19 của Hãng Invitrogen, 542 Flynn- Camarillo, CA 93012 Mỹ

*Phươngpháp nghiên cứu:

Thí nghiệm được tiến hành trên mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng hoá chất [1], [13] Tiêm màng bụng cyclophosphamid (CY), liều duy nhất

Chuột thí nghiệm được chia thànli 7 lô, mỗi lô 10 con:

- Lô 1 (chứng sinh lý): chuột không bị tác động gì

- Lô 2 (chứng bệnh lý): chuột được tiêm CY, không điều trị

- Lô 5: chuột được tiêm CY, được uống LVL liều 0,4g cao khô/kg thể trọng

- Lô 7: chuột được tiêm CY, được uống LVT liều 0,092g cao khô/kg thể trọng

Sau khi tiêm màng bụng cyclophosphamid liều 200mg/kg ở các lô 2, 3,

tục trong 5 ngày Ngày thứ 6, giết chuột, lấy máu và các tổ chức lympho để làm xét nghiệm

Mô hình nghiên cứu này trải qua ba giai đoạn: ức chế miễn dịch, mẫn cảm kháng nguyên và điều trị thuốc thử

+ ứ c chế miễn dịch:

Dùng tác nhân kinh điển gây tổn thương hệ miễn dịch, tạo máu là tiêm

CY Tiêm CY : gây suy giảm miễn dịch dịch thể nhiều hơn miễn dịch tế bào, đặc biệt thuốc làm ức chế khả năng tiết kháng thể đặc hiệu của các tế bào lympho B mẫn cảm, liều duy nhất 200 mg/kg thể trọng chuột, tiêm màng bụng

+ Mần cảm kháng nguyên:

- Kháng nguyên OA tiêm mũi duy nhất dọc sống lưng chuột liều 0,1 ml/chuột và HCC dung dịch 5%, tiêm màng bụng, thể tích duy nhất 0,5 ml/ chuột (nhóm chứng dương)

- Tiêm phát hiện: Kháng nguyên OA và dung dịch làm chứng BSA được tiêm vào hai gan bàn chân chuột với thể tích 0,05ml một ngày trước khi giết chuột làm xét nghiệm

+ Điều tri thuốc thử:

- Chuột ở lô 3 được uống levamisol liều 1 OOmg/kg thể trọng chuột

- Chuột ở các lô 4, 5, 6, 7 được uống th u ố c thử

- Thời gian uống thuốc thử; 5 ngày

Tách tế bào lympho từ tổ chức lách:

Rửa ba lần hỗn dịch tế bào lách bằng dung dịch Hanks Đếm tế bào lách Nuôi cấy tế bào Ix 10^ tế bào/ Iml môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy là F2

+ 10% FCS (Fetal Calf Sera) Thêm vào môi trưòng nuôi cấy tế bào 3 ịiì

PH A /1 ml môi trường nuôi cấy ủ ở 37°c trong 48h, ly tâm bỏ dịch nổi, lấy cặn tế bào

Xét nghiệm chức năng miễn dịch:

Chuột ở tất cả các lô được đánh giá thông qua các chỉ số:

+ Các chỉ số chung:

- Trọng lưọng lách, tuyến ức tương đối: được tính là trọng lượng lách, tuyến ức tương ứng với thể trọng chuột

Chuột được giết bằng cách kéo đứt đốt sống cổ, mổ bụng để bộc lộ lách, tuyến ức Bóc tách lấy toàn bộ lách và tuyến ức và ngâm ngay vào dung dịch nuôi tế bào Lọc sạch các tổ chức xung quanh, dùng gạc thấm khô rồi đem cân Ghi lại trọng lượng lách, tuyến ức của từng chuột Trọng lượng lách, tuyến ức tương đối bằng tỷ lệ trọng lượng các cơ quan này so với trọng lưọng của từng chuột tương ứng

- Số lượng bạch cầu chung, bạch cầu hạt trung tính, bạch cầu lympho, bạch cầu mônô và bạch cầu NK ở máu ngoại vi

+ Các thông số đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể:

- Tỷ lệ tế bào lympho lách tạo hoa hồng mẫn cảm với HCC (TBTHHMC):

ủ các tế bào lympho lách đã được mẫn cảm với kháng nguyên là HCC

từ trước với HCC ở điều kiện thích hợp, ở 4°c qua đêm Khi gặp kháng nguyên đặc hiệu các tế bào lympho đã được mẫn cảm có các kháng thể bề mặt đặc hiệu với HCC sẽ gắn với các HCC vào xung quanh nó tạo nên hình ảnh giống hoa hồng Đem số lượng tế bào lympho tạo hoa hồng với HCC trong tổng số 100 tế bào lympho lách dưới kính hiển vi có độ phóng đại 10 X 40 Từ

đó tínli được tỷ lệ phần trăm TBTHHMC trong các lô chuột thí nghiệm

- T ỷ lệ tế bào lympho của lách tạo quầng dung huyết:

Xác định tỷ lệ tế bào lympho lách tiết kháng thể kháng HCC theo kỹ thuật của Cunningham Trộn các lympho bào của lách chuột đã được mẫn cảm với kháng nguyên là HCC từ trước với HCC theo tỷ lệ thích họp kèm theo sự có mặt của bổ thể trong một buồng đếm gắn kín Khi gặp kháng nguyên đặc hiệu, các tế bào lympho B đã biệt hoá thành các tương bào sẽ tiết kháng thể hoà tan vào môi trường xung quanh và những kháng thể này sẽ kết hợp với các kháng nguyên là HCC Phức hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ hoạt hoá bổ thể làm tan các HCC xung quanh các tế bào B tiết kháng thể, tạo

ra vòng trắng không có HCC ở xung quanh các tế bào này Đây gọi là tế bào tạo quầng dung huyết (TBTQDH) Đếm các tế bào lympho tạo quầng dung

X 40 Từ đó tính được tỷ lệ phần trăm TBTQDH ở các lô chuột thí nghiệm

dịch huỳnh quang Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp với các chế phẩm của Hãng Invitrogen ở tế bào lách phân lập

+ Các thông số đánh giá miễn dịch qua trung gian tế bào:

- Đánh giá miễn dịch qua trung gian tế bào thông qua phản ứng quá mẫn chậm ở gan bàn chân chuột với kháng nguyên OA Trước khi đo kết quả phản ứng quá mẫn chậm với kháng nguyên OA, tiêm 50 |il kháng nguyên OA (liều phát hiện) vào một bên gan bàn chân chuột, bên còn lại tiêm thể tích tương tự dung dịch BSA Sau 24 giờ tiêm kháng nguyên phát hiện, đo bề dày hai gan bàn chân chuột bằng thước palmer Lấy hiệu số bề dày phản ứng quá mẫn chậm của chuột với kháng nguyên OA và BSA được chỉ số phản ứng với kháng nguyên OA

dịch huỳnh quang Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp với các chế phẩm của Hãng Caltag ở tế bào lách phân lập

- Định lượng các cytokin IL-2 và TN F-a trong các tế bào lympho lách nuôi cấy bằng phương pháp ELI SA

2.2.3.3 Phương pháp thử tác dụng chống oxy hóa in vivo

*Nguyên vật liệu

+ Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng trưởng thành, trọng lượng

+ Mầu thử: Cao đông khô lá lược vàng LVL và cao chiết cồn 50% thân phụ lược vàng LVT

+ Hoá chất tinh khiết: Tris-HCl, acid tricloroacetic (TCA), acid

Tác dụng chống oxy hóa in vivo được thử trên mô hình gây tổn thương

"^Nguyên tắc của phương pháp:

D ù n g C C I4 l à c h ấ t g â y t ổ n t h ư ơ n g g a n K h i v à o c ơ t h ể , C C I4 b i ế n đ ổ i

thành các gốc tự do CCI3* và c r , các gốc này thúc đẩy quá trình peroxy hoá lipid (POL) của màng tế bào gan, tạo ra sản phẩm trung gian là MDA (Malonyl dialdehyd) Do đó, có thể dựa vào lượng MDA tạo ra để đánh giá quá trình oxy hóa các tế bào gan chuột MDA có thể xác định bằng cách cho phản ứng với acid thiobarbituric tạo phức trimethin màu hồng bền vững, có đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 532 nm Độ hấp thụ ánh sáng ở 532 nm tỷ

lệ thuận với nồng độ phức chất tạo ra và do đó tỉ lệ thuận với lượng MDA sinh ra trong quá trình phản ứng Hàm lượng MDA ở mẫu thử giảm đi so với đối chứng gây bệnh cho biết khả năng ức chế quá trình peroxy hoá lipid của chất thử (được gọi là hoạt tính chống oxy hoá HTCO)

tả phương pháp:

Thí nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt trắng có trọng lượng 20 - 22g Chuột thí nghiệm sau khi đã nuôi ổn định trong điều kiện thí nghiệm 4 ngày được chia ngẫu nhiên thành 9 lô;

- Lô 1: Lô chứng sinh lý được uống nước

- Lô 2: Lô chứng gây bệnh không điều trị

- Lô 4: Lô uống LVL liều 0 ,lg cao khô /kg thể trọng chuộư ngày

- Lô 5: Lô uống LVL liều 0,2g cao khô /kg thể trọng chuột/ ngày

- Lô 7: Lô uống LVT liều 0,023 g cao khô/kg thể trọng chuột/ ngày

- Lô 9: Lô uống LVT liều 0,092 g cao khô/kg thể trọng chuột/ ngày

Chuột cho uống thuốc trước 4 ngày ở tất cả các lô Đen ngày thứ 5 chuột các lô thử thuốc và lô chứng gây bệnh được tiêm phúc mạc dung dịch

CCI4 10% trong dầu oliu (0,1 ml/10 gam trọng lượng) Sau khi tiêm CCI4 24 giờ: giết chuột, lấy gan để định lượng MDA: Cân chính xác trọng lượng gan, đồng thể với đệm Tris (tỷ lệ 1:10) (làm lạnh bằng đá) Hỗn dịch thu được tủa bằng dung dịch acid tricloracetic 30%, tạo màu bằng cách cho phản ứng với dung dịch acid thiobarbituric (TBA) 0,25% ở 100 °c (đun cách thủy) trong 15 phút Đe nguội, ly tâm lấy phần dung dịch phía trên rồi đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 532 nm Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử được hiểu là mức

độ ức chế quá trình oxy hóa lipid và được tính toán kết quả thí nghiệm theo công thức sau:

Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp thống

kê sinh học, sử dụng công cụ Data analysis của Microsoft Excel [9]:

- Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ sai số chuẩn (M ± SE)

- Đánh giá, so sánh thống kê giữa các lô thí nghiệm bằng nghiệm pháp t-Student

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u

Hình 3.1 Ảnh cây lược vàng

3.1 KÉT QUẢ NGHIÊN cứu VỀ T H ựC VẬT

3.1.1 Mô tả đặc điểm thực vật và thẩm định tên khoa học

Mầu cây lược vàng được thu

hái tại huyện Yên Dũng, tỉnh Bắc

Giang vào tháng 4 năm 2010

Lược vàng là cây thảo, sống

nhiều năm Rễ mảnh, thân mọng

nước có thể dài tới lOOcm hoặc

hơn, phân nhánh với thân phụ ở

gốc Lá mọc tập trung ở ngọn thân;

rải rác ở phía dưới, dạng mác

thuôn, dài 18-25cm, rộng 3,5-4cm,

cuống lá có gân rõ, ôm thân, có

lông mịn và thường có sọc tía

Hoa mọc thành cụm 2-3 hoa dạng

xim trên phát hoa hình chuỳ dài tới 60cm,

mỗi cặp xim được ôm bởi các lá bắc dạng

răng cưa dài 10-15mm; lá đài trong suốt,

màu trắng, khô xác, dạng mác, dài 5-6mm;

cánh hoa bóng, trong suốt, màu trắng,

Mầu tiêu bản được TS Trần Văn ơ n (Bộ môn Thực vật Dược- Trường

Đại học Dược Hà Nội) giám định tên khoa học là Calỉỉsia fragrans (Lindl.)

Woodson, họ Thài lài (Commelinaceae)

Hình 3.2 Ảnh hoa lược vàng

là 1 lớp tế bào hình dạng giống mô mềm giậu (3) có thành mỏng, kích thước không đều Phía dưới mô mềm giậu là các tế bào mô mềm (4) có kích thước nhỏ, xếp sít nhau Tiếp theo là các bó libe gồ, có gỗ (5) và libe (6) ở phía trên lớp tế bào biểu bì dưới là 2-3 lớp mô dày lên ở các góc (7), có hình dạng

và kích thước không đều nhau (Hình 3.3.)

3.2 KÉT QUẦ NGHIÊN c ứ u VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá và thân phụ lược vàng

Định tính sơ bộ các nhóm chất có trong cây bằng các phản ứng hóa học đặc trưng Kết quả định tính các nhóm chất trong lá và thân phụ (TP) lược vàng được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây lược vàngs

A cid am in p /ứ với TT N inhydrin 3% + + Có Có

*Nhân xét:

Kết quả định tính ở bảng 3.1 cho thấy, trong lá và thân phụ lược vàng

flavonoid, carotenoid, phytosterol, acid hữu cơ, acid amin, chất béo, đường tự

do và polysaccharid

3.2.2 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ thân phụ lược vàng

Thân phụ lược vàng tươi (12,0 kg) được rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô và

chiết 3 lần ở nhiệt độ phòng, mỗi lần 24h với 3 lít ethanol 90% Gộp các dịch chiết (D/C), cất thu hồi đung môi dưới áp suất giảm thu được 85,8g cao đặc

Cao này được phân tán vào nước rồi chiết lần lưọt với «-hexan, ethyl acetat và methanol Các dịch «-hexan, ethyl acetat và methanol được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm rồi cô đến kiệt dung môi thu được các cắn

Cắn A (10,5g) được hòa tan vào một lượng cloroform tối thiểu và tẩm với 80g silica gel rồi được làm khô dung môi trên máy cất quay chân không Sau khi chuẩn bị cột nhồi silica gel bằng phương pháp nhồi cột ướt, lượng

silica gel đã tẩm chất được đưa lên cột Việc chiết tách được thực hiện trên cột silica gel pha thường cỡ hạt 0,040 - 0,063mm với hệ dung môi rửa giải là

(0:100) Theo dõi các phân đoạn thu được bằng SKLM, các phân đoạn giống nhau được gom chung, thu được 3 phân đoạn: H l, H2 và H3

Phân đoạn H3 được đưa lên cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ

d ư ớ i d ạ n g b ộ t v ô đ ị n h h ì n h , m à u t r ắ n g

Cắn B (10,4g) được hòa tan vào một lượng methanol tối thiểu vào tẩm với lOOg silica gel rồi được làm khô dung môi trên máy cất quay chân không Sau khi chuẩn bị cột nhồi silica gel bằng phương pháp nhồi cột ướt, lượng silica gel đã tẩm chất được đưa lên cột Việc chiết tách được thực hiện trên cột silica gel pha thưòng cỡ hạt 0,040 - 0,063mm, dùng hệ dung môi rửa giải với độ phân cực tăng dần từ tỷ lệ cloroform - methanol (100:0) đến (0:100) Theo dõi các phân đoạn thu được bằng SKLM, các phân đoạn giống nhau được gom chung, thu được 4 phân đoạn là E l, E2, E3 và E4

Phân đoạn E3 được đưa lên SKC silica gel pha thường với hệ dung môi cloroform - methanol (30:1) đến (1:1) và sau đó bằng cột silica gel pha đảo

YMC với hệ dung môi methanol - nước (30:1) thu được 23mg chất LVE16

d ư ớ i d ạ n g b ộ t vô đ ịn h h ìn h , m à u trắ n g

Quá trình phân lập các chất từ thân phụ lược vàng được tóm tắt ở hình3.7