Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học và tác dụng sinh học của một số loài tầm gửi, họ tầm gửi (loranthaceae)

BỘ G IÁO DỤC V À ĐÀO TẠO BỘ Y TÊ TRƯ ỜNG ĐẠI HỌC Dược H À NỘ I NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐẶC • ĐIể M THựC • v ậ• t ,' THÀNH PHẦN HỐ HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI Tầ M g i, h ọ t ầ m g i (.LORANTHACEAE ) CHUYÊN NGÀNH -Dược LIỆU- Dược HỌC c ổ TRUYỀN Mã số: 03.02.03 LU ẬN V ă n T H Ạ C s ĩ Dư ợ C HỌC • • • • HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS PHẠM THANH KỲ TS NGUYỄN VIẾT THÂN HÀ NỘI- 2002 M Ồ & & c M ( t i l Luận ván thực môn Dược liệu- Trường Đại học Dược Hà nội Với lòng biết ơn kính trọng, tơi xin chân thành cảm ơn: Gs Ts Phạm Thanh Kỳ; Ts Nguyễn Viết Thân trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình cho tơi suốt q trình nghiên cứu khoa học Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: - Pgs Ts Phạm Quang Tùng - Phòng sau Đại học- Trường Đại học Dược Hà nội - Gs Vũ Văn Chuyên- Bộ môn Thực vật- Trường Đại học Dược Hà nội - Ts Đ ỗ Ngọc Thanh- Phòng thí nghiệm trung tâm- Trường Đại học Dược Hà nội - Pgs Ts Chu Đình Kính -Viện hố học- TTKHTN CNQG - TS Nguyễn Thị Vinh- Trưởng phòng Dược lý -Viện kiểm nghiệm -Ts Trần Vân Hiên - Trưởng phòng Đơng y thực nghiệm- Viện Y học cổ truyền Việt nam Đ ã đóng góp ý kiến q báu cho tơi thực luận văn Nhân dịp xin trán trọng cảm ơn thầy cô giáo, kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu, môn Thực vật, mơn Dược học cổ truyền, Viện hố học, Viện kiểm nghiệm, Viện Dược liệu, Viện Y học cổ truyền, Ban giám hiệu Trường Đại học dược Hà nội, Thầy giáo phòng sau đại học Trường Đại học Dược Hà nội Đ ã tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian thực luận văn Hà nội, ngày 02tháng 12 năm 2002 Ds Nguyễn thị M Hương MỤC LỤC ĐẶT VẤN Đề TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.1 Đặc điểm chung ký sinh họ Tầm gửi (Loranthaceae) 1.1.2 Phân loại thực vật 1.1.3 Đặc điểm thực vật số loài thuộc chi Macrosolen 1.1.4 Đặc điểm thực vật số loài thuộc chi Scurrula 1.1.5 Đặc điểm thực vật số loài thuộc chi Taxillus 1.2 Những nghiên cứu thành phần hố học 10 1.3 Tác dụng cơng dụng Tầm gửi 12 N G U Y Ê N LIỆU, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 15 2.2 Phương tiện nghiên cứu 15 2.2.1 Động vật nghiên cứu 15 2.2.2 Các máy móc thiết bị dùng nghiên cứu 15 2.2.3 Hoá chất 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Nghiên cứu thực vật 16 2.3.2 Nghiên cứu hoá học 16 2.3.3 Nghiên cứu số tác dụng sinh học 17 Phần THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 20 3.1 Nghiên cứu thực vật 20 3.1.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật mẫu 20 3.1.1.1 Mô tả hình thái định tên khoa học 20 3.1.1.2 Đặc điểm giải phẫu loài Taxillus chinensis 20 3.1.1.3 Đặc điểm bột 21 3.1.2 Nghiên cứu đặc điểm thực vật mẫu 24 3.1.2.1 Mơ tả hình thái định tên khoa học 24 3.1.2.2 Đặc điểm giải phẫu loài Macrosolen tricolor 24 3.1.2.3 Đặc điểm bột 25 3.1.3 Nghiên cứu đặc điểm thực vật mẫu 28 3.1.3.1 Mơ tả hình thái định tên khoa học 28 3.1.3.2 Đặc điểm giải phẫu loài Macrosolen affinis 28 robosonii 3.1.3.3 Đặc điểm bột 29 3.1.4 Nghiên cứu đặc điểm thực vật mẫu 4a 4b 32 3.1.4.1 Mơ tả hình thái định tên khoa học 32 3.1.4.2 Đặc điểm giải phẫu loài Scurula gracilifolia 33 3.1.4.3 Đặc điểm bột 34 3.2 Nghiên cứu thành phần hố học 37 3.2.1 Định tính nhóm chất hữu dược liệu 37 3.2.2 Định tính flavonoid mẫu dược liệu SKLM 44 3.2.3 Định lượng flavonoid toàn phần mẫu dược liệu 45 3.2.4 Chiết xuất phân lập flavonoid loài Tầm gửi Macrosolen tricolor Scurrula gracilifolia ký sinh Bưởi 49 3.2.4.1 Chiết xuất flavonoid tồn phần 49 3.2.4.2 Định tính flavonoid tồn phần SKLM 51 3.2.4.3 Phân lập flavonoid loài Tầm gửi Macrosolen 52 tricolor sắc ký cột 3.2.4.4 Phân lập flavonoid loài Tầm gửi Scurrula 53 gracilifolia sắc ký cột 3.2.5 Sơ nhận dạng chất H5, H2, Vj, v 56 3.2.5.1 Nhận dạng chất H5 56 3.2.5.2 Nhận dạng chất H2 59 3.2.5.3 Nhận dạng chất Vj( TG-Vj) 63 3.2.5.4 Nhận dạng chất v 65 3.3 Kết thử số tác dụng sinh học 67 3.3.1 Kết thử độc tính cấp 67 3.3.2 Thử tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan TG2 68 3.3.3 Thử tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào não chế 70 phẩm TG2 3.3.4 Xác định hoạt tính dọn gốc tự anion superoxide 71 TG2 Phần 3.3.5 Thử tác dụng bảo vệ gan TG2 73 3.3.6 Thử tác dụng kháng khuẩn chế phẩm TG2 74 bàn luận kết 75 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 PHỤ LỤC STT TÊN BẢNG T rang Bảng 3.1 Kết định nhóm chất mẫu dược liệu 43 Bẳng 3.2 Kết SKLM flavonoid mấu Tầm gửi hệ dung môi III 45 Bảng 3.3 Hàm lượng flavonoid toàn phần mẫu dược liệu 48 Bảng 3.4 Kết SKLM flavonoid toàn phần loài Tầm gửi Macrosoỉen tricolor 51 Bảng 3.5 Kết SKLM flavonoid toàn phần loài Tầm gửi Scurula gracilifolia 52 Bảng 3.6 Số liệu cộng hưởng từ hạt nhân H2 61 Bảng 3.7 Số liệu cộng hưởng từ hạt nhân V, (TG-V,) 64 Bảng 3.8 Kết thử độc tính cấp loài tầm gửi Scurrula gracilifolia ký sinh Trúc đào Bảng 3.9 Kết thử độc tính cấp lồi Tầm gửi Scurruỉa gracilifolia ký sinh Bưởi 10 14 71 Bảng 3.12 Tác dụng chế phẩm TG2 tạo thành anion superoxide hệ XT/XOD (nồng độ dung dịch thử lmg/ml) 13 70 Bảng 3.11 Tác dụng bảo vệ chế phẩm TG, tế bào não điều kiện oxy hoá khác 12 68 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nồng độ khác chất TG2 đến phản ứng oxy hoá lipid dịch đồng thể tế bào gan chuột nhắt trắng 11 67 72 Bảng 3.13 Kết định lượng GPT, Bilirubin huyết chuột 73 Bảng 3.14 Kết thí nghiệm thử tác dụng kháng khuẩn TG2 74 STT T rang TÊN HÌNH 22 Hình 3.1 Ảnh Tầm gửi Taxillus chinensis 22 Hình 3.2 Ảnh cành mang hoa Tầm gửi Taxillus chinensis Hình 3.3 Ảnh chùm hoa, phận hoa Tầm gửi 22 Taxillus chỉnensis 23 Hình 3.4 Ảnh phần vi phẫu Tầm gửi Taxillus chinensis 23 Hình 3.5 Ảnh phần vi phẫu thân Tầm gửi Taxillus chinensis 23 Hình 3.6 Ảnh số đặc điểm bột Tầm gửi Taxillus chinensis 26 Hình 3.7 Ảnh Tầm gửi Macrosolen tricolor (Lee.) Dans 26 Hìmh 3.8 Ảnh cành mang hoa Tầm gửi Macrosolen tricolor (Lee.) Dans 26 Hình 3.9 Ảnh phận hoa Tầm gửi Macrosolen tricolor (Lee.) Dans 27 10 Hình 3.10 Ảnh phần vi phẫu Tầm gửi Macrosolen tricolor (Lee.) Dans 27 11 Hình 3.11 Ảnh phần vi phẫu thân Macrosolen tricolor^Lee.) Dans 27 12 Hình 3.12 Ảnh số đặc điểm bột Tầm gửi Macrosolen tricolor^Lee.) Dans 30 13 Hình 3.13 Ảnh cành Tầm gửi Macrosolen robinsonii 30 14 Hình 3.14 Ảnh cụm hoa Tầm gửi Macrosolen robinsonii 15 19 Hình 3.15 Ảnh phận hoa Tầm gửi Macrosolen ajfinis robinsoniỉ (Gramble.) Dans Hình 3.16 Ảnh phần vi phẫu Tầm gửi Macrosolen affinis robinsonỉi (Gramble.) Dans Hình 3.17 Ảnh phần vi phẫu thân Tầm gửi Macrosolen affinis robinsonii (Gramble.) Dans Hình 3.18 Ảnh số đặc điểm bột Tầm gửi Macrosolen affinis robinsonii (Gramble.) Dans Hình 3.19 Ảnh cành Tầm gửi Scurrula gracilifolia (Schult.) Dans 20 Hình 3.20 Ảnh cành mang hoa Tầm gửi Scurrula gracilifolia 35 21 Hình 3.21 Ảnh phận hoa Tầm gửi Scurrula gracilifolia (Schult.) Dans 35 16 17 18 30 31 31 31 35 22 36 26 Hình 3.22 Ảnh phần vi phẫu Tầm gửi Scurrula gracilifolia (Schult.) Dans Hình 3.23 Ảnh phần vi phầu thân Scurruỉa gracilifolia (Schult.) Dans Hình 3.24 Ảnh số đặc điểm bột Tầm gửi Scurrula gracilifolia (Schult.) Dans Hình 3.25 Ảnh SKLM flavonoid tồn phần 05 mẫu Tầm gửi với III Hình 3.26 Sơ đồ chiết xuất flavonoid tồn phần 27 Hình 3.27 Ảnh SKLM chất Vị hệ dung môi 55 28 Hình 3.28 Ảnh SKLM chất V3 hệ dung mơi 55 29 Hình 3.29 Ảnh SKLM chất H2 hệ dung môi 55 30 Hình 3.30 Ảnh SKLM so sánh H5 quercetin chuẩn với hệ III 58 31 Hình 3.31 Ảnh SKLM so sánh H5 quercetin chuẩn với hệ IX 58 32 Hình 3.32 Ảnh SKLM hai chiều H5 quercetin vói hệ III, VII 58 33 Hình 3.33 Ảnh tinh thể H2 kính hiển vi phân cực 62 34 Hình 3.34 Ảnh tinh thể H5 kính hiển vi phân cực 62 35 Hình 3.35 Ảnh tinh thể Vị dưói kính hiển vi 62 36 Hình 3.36 Ảnh SKLM so sánh Mị, M2, M4a, M4b, Vj, H2, H5 vói hệ III 66 23 24 25 36 36 47 50 CNQG : Công nghệ quốc gia COSY : Corelation spetrocopy Dd : Dung dịch DEPT : Distortionless enhancement by polarization transfer EDTA : Ethylen diamine tetra acetic sendizodic IR : Inphra Red HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Corelation HMQC : Heteronuclear Multiple Quantum Corelation MDA : Malonyl dialdehyd MS : Mass spectrum NOESY : Nuclear Overhouser effect Spectrocopy NBT : Nitro Blue Tetrazolinum NMR : Nuclear magnetic resonance 13C-NMR : Carbon (13) Nuclear magnetic resonance 'H-NMR : Proton Nuclear magnetic resonance PBS : Đệm phosphate p/ứ : Phản ứng TP : Toàn phần TT : Thuốc thử TTKHTN : Trung tâm khoa học tự nhiên SKLM : Sắc ký lớp mỏng uv : Ultra Violete XT/XOD : Xanthin/xanthinoxydase acid ĐẶT VẤN ĐỂ Việt nam nằm vùng khí hậu nhiệt đód có nguồn tài nguyên thuốc phong phú đa dạng Theo điều tra Viện Dược liệu sở y tế nước, cơng bố năm 2001 Việt Nam có khoảng 3400 loài thuốc Nhiều thuốc nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn đưa vào Dược điển Việt Nam Tuy nhiên, nhiều thuốc sử dụng theo kinh nghiệm dân gian mà chưa nghiên cứu nghiên cứu chưa kỹ đầy đủ Vì việc nghiên cứu thuốc nhằm sáng tỏ kinh nghiệm dân gian phương diện khoa học, nâng cao hiệu lực chữa bệnh cần thiết Tầm gửi nhỏ thường sống ký sinh khác chủ có nhiều loài Tầm gửi Như loài tầm gửi mọc ký sinh chủ khác có giống thành phần hố học tác dụng sinh học khơng? Thành phần hố học chủ độc có ảnh hưởng tới ký sinh khơng? Để góp phần trả lời câu hỏi chúng tơi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học tác dụng sinh học số loài Tầm gửi thuộc họ Tầm gửi ( Loranthaceae ) “ với nội dung sau : Nghiên cứu đặc điểm thực vật, định tên khoa học số loài Tầm gửi ký sinh Trúc đào, Bưởi, Dâu tằm mà nghiên cứu, đồng thời nghiên cứu đặc điểm vi phẫu, đặc điểm bột dược liệu để góp phần tiêu chuẩn hoá dược liệu Bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học số mẫu Tầm gửi thu hái Nghiên cứu độc tính cấp số tác dụng sinh học mẫu Tầm gửi nghiên cứu Phụ lục 3.2 Phổ IR chất V) File Operator Acquired Instrument Sample Name Misc Info Vial Number C:\HPCHEM\1\DATA\N-DIP927.D Phong Cau true, Vien Hoa hoc 31 Jul 102 11:38 am using AcqMethod N-DIP 5989B MS TG-V1 Solvent: CH30H Library Searched : C:\DATABASE\WILEY275.L Quality : 95 : 4H-1-Benzopyran-4-one, 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7- rihydroxy- (CAS) $$ F l a v o n e , $$ C.I 75670 $$ c.I N , ' , ' , , -pentahydroxy- o LT) ư~) 1—1 KO co m LD co CT> CN1 CM ro cn -sT 1—1 r o o co CT> CNl rH r* o LT) I—1 I—1 CM CM rH 1—1 ro co C\] t—1 (T i o cr> OD CD KD KQ o o a s o o cr> 00 co cr> ■^T CM CM in m CM CM CM CNJ r - r~ e'­ [■" LO in LD • 'X) KD KD un tn r—1 rõ rõ en o ■^r co 1—1 LO CTi CM CM rH o o ■^T r~ LT> r~ 00 cr> C\1 in V£> CM I—1 cr> oo VX) ■^r CM t—1 ■^r oo ["* ro CO ro ro m o o o (M CTt o VD i LT) LT) o o o o o ro rõ rõ ro 00 cô 0 ro ro ro ro rõ rõ 00 CsJ CNJ Csj C\J CN CN CN CNJ C\J Current Data Parameters NAME KY_V1 EXPNO PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20021029 14 56 Time INSTRUM av500 PR0BHD mm Multinucl PULPR0G zg30 TD 65536 SOLVENT Acetone 32 NS DS SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2769001 sec RG 181 DW 50.000 usee DE 6.00 usee TE 300.0 K 1.00000000 sec DI CHANNEL fl -1H 10.10 usee -3.00 dB 500.1328845 MHz NUC1 P1 PL1 SF01 F2 - Processing parameters SI 32768 SF 500.1300102 MHz WDW EM SSB 0 30 Hz LB GB PC 1.00 l ~rT T~ 12 11 10 ppm o (M -O LD ^ CM H o ro «—1 CO m r~i KD rH H CM o r-" o VD LO 0 CTí CN] ọ ợ im o ơì cn ƠI i£) o cr> m in ^ r- r* võ võ võ tH co ^ 00 ro rõ cn cr» CM o ơì OD co LO CNJ C\J ■^r r~ ["-•[■" Current Data Parameters NAME KY_V1 EXPN0 PR0CN0 F2 - Acquisition Parameters Date_ 20021029 Time 14.56 INSTRUM av500 PR0BHD mm Multinucl PULPR0G zg30 TD 65536 SOLVENT Acetone NS 32 DS SWH FIDRES AQ RG DW DE TE DI 45 40 ppm ppm Hz Hz see usec usec K see ======== CHANNEL f1 ======== NUC1 1H P1 10.10 usec PL1 -3.00 dB SF01 500.1328845 MHn I 7.50 10000.000 0.152588 3.2769001 181 50.000 6.00 300.0 1.00000000 F2 - Processing parameters SI 32768 SF 500.1300102 MHz WDW EM SSB LB 0.30 Hz GB PC 1.00 o o o n ơ> (Ti CNJ n ơ> LT) CO 0 r~ VO in U") 0^) cr» • 00 r in LT) I—1 I—1 ro co o CN ơ\ 00 cn LO < —1 rH VD CM oo CTt 00 o o Ch kO KT r ư-> r~ rH o 00 r* m ro I—1 CN] C\J CM CM rH 1—1 kõ 'X) I— 1—1 1—1 1—1 LD o 1—1 Csĩ o I—1 ro •^r LD co CN1 U-) Ờ\ OS ơ\ M1 Current Data Parameters NAME KY VI EXPNO PR0CN0 ro r-~ F2 - Acquisition Parameters Date • 20021029 Time 15.48 INSTRUM av500 PR0BHD mm Multinucl PULPROG zgpg TD 65536 SOLVENT CDC13 NS 1024 DS SWH 30030.029 Hz FIDRES 458222 Hz AQ 1.0912410 sec RG 11585.2 DW 16.650 usee DE 6.00 usee TE 300.0 K D1 2.00000000 sec dll 0.03000000 sec dl2 0.00002000 sec I I Iệ# l 73 I '""T7 18 175 170 165 • ■I ■' ■■I ■• ■■I ■T’ H ' ■' ' I ■■■I • I I I :55 5 141 130125120 I 115 110 I 1C 100 ppm 72 ppm NUC1 PI PL1 SF01 13C 6.20 usee -1.00 dB 125.7703143 MHz CPDPRG2 NUC2 PCPD2 PL2 PL12 P L13 SF02 Wdltzl6 1H 88.00 -3.00 15.80 120.00 500.1320005 usee dB dB dB MHz F2 - Processing parameters SI 32768 SF 125.7577390 MHz WDW EM SSB LB 1.00 Hz GB PC 1.40 DE PT90 I' 180 170 160 150 140 130 ■■I■• " I" 120 110 100 "T " 90 'T" 80 70 rrr ’’I" 60 50 ■■r ■ 40 ■■I ^ -p - , 30 20 10 ppm Phụ lục 3.6 Phổ DEPT chất Vị )EPT135 :h &c h - | *w Phụ lục 3.7 Phổ DEPT 135 chất V ị C H2 •-Ị ■■I•■ r L80 170 160 150 140 130 120 110 100 90 T” 80 " I■■ 70 ■■I■■ 60 50 ’"1’' 40 ■■I■■ 30 20 ■■I■■ 10 ppm :13C PD i m m ệm W L8 170 160 150 n ■■■I I I I I ‘ I I I I T " I I 140 130 120 110 30 90 80 70 63 pprr DEPT90 120 125 115 11 100 105 I I I 95 90 85 í 80 75 ppm DEPT135 CH&CH CH2 I 125 I ' 120 » I ' 115 ■ ' T I 110 • •;*; D *:ằ 7i z: Ul H: m *: m c.ô CO Cl " • Ơ'*'j!!» •I"' I'i- r o "•■•I 13 ' r jr I II 111 S!ô !£' ị:.Oii’.i u ÍS> cs> H File Operator Acquired Instrument Sample Name Misc Info Vial Number C:\HPCHEM\1\DATA\N-DIP953.D Phong Cau true, vien Hoa hoc 29 Aug 102 1:31 pm using AcqMethod N-DIP 5989B MS Huong Solvent: CH30H c : \DATABASE\WILEY275.L Library Searched Quality ID 95 1,2,3-Benzenetriol (CAS) $$ 1,2,3-Trihydroxybenzene $$ C.I 76515 $$ Pyrogallol $$ Fourrine 85 $$ Fourrine p G $$ Pyrogallic acid $$ 2000 II , , , , I , , P|ll|ll|^ll|IL|d|lj ^ , T V , m/z > 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 Abundance#17518 : 1,2,3-Benzenetriol (CAS) $$ 1,2,3-Trihydroxybenzene (*) 1Ì6 8000 6000 52 80 4000 - 108 97 2000 28 m/z- -> - ^ - Ị— T ^ I 20 68 fif II ^11 40 r I I*' * I I I I* f T 1 I 6080 I r n ~ T ^ T— Ị— |— r 100120 I Ị I ỉ I I' Ị " T '1 ~ T " r '| '~ I I I I I 140160 180 200 I I I OH HO \ I I 220 OH I I I I 'I 240 I I I I I 260 I t 280 ... điểm thực vật, thành phần hoá học tác dụng sinh học số loài Tầm gửi thuộc họ Tầm gửi ( Loranthaceae ) “ với nội dung sau : Nghiên cứu đặc điểm thực vật, định tên khoa học số loài Tầm gửi ký sinh. .. cứu thực vật 16 2.3.2 Nghiên cứu hoá học 16 2.3.3 Nghiên cứu số tác dụng sinh học 17 Phần THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 20 3.1 Nghiên cứu thực vật 20 3.1.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật mẫu 20 3.1.1.1 Mơ... QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.1 Đặc điểm chung ký sinh họ Tầm gửi (Loranthaceae) 1.1.2 Phân loại thực vật 1.1.3 Đặc điểm thực vật số loài thuộc chi Macrosolen 1.1.4 Đặc điểm thực vật số loài thuộc