3.2.2.1. Chiết xuất phân đoạn
Chuẩn bị bột dược liệu:
Lá tươi được rửa sạch, sấy khô ở 60oC, xay thành bột thô.
Xác định độ ẩm của bột dược liệu bằng máy đo độ ẩm Precisa XM120 cho kết quả: Độ ẩm dược liệu: 10,15%.
Dung môi và phương pháp chiết:
Lựa chọn dung môi chiết là ethanol 70%. Chiết theo phương pháp ngâm lạnh, 24 giờ rút dịch chiết 1 lần.
Chuẩn bị dụng cụ chiết:
Bình gạn 500 ml có nút mài kín, được rửa sạch, sấy khô, lót bông ở đáy. Chiết xuất cao lỏng toàn phần:
Cân chính xác 100,74 g bột dược liệu, làm ẩm bằng dung môi chiết để 30 phút. Cho bột vào bình gạn, thêm ethanol 70% ngập trên dược liệu 2 – 3 cm, mở khóa rút khoảng 10 ml dung môi, đổ trở lại, đậy kín bình chiết. Ngâm ở nhiệt độ phòng, cứ 24 giờ rút dịch chiết 1 lần, rút dịch chiết 3 lần. Gộp các dịch chiết (700 ml), cất thu hồi dung môi thu được 200 ml dịch chiết. Để lắng dịch chiết trong tủ lạnh 24 giờ, lọc bỏ tủa, ly tâm thu được cao lỏng nước.
Chiết xuất phân đoạn:
Chiết lần lượt với các dung môi theo thứ tự tăng dần độ phân cực: n-hexan, chloroform, ethyl acetat.
- Chiết phân đoạn n-hexan: Cho dịch chiết toàn phần vào bình gạn, thêm n- hexan (khoảng 100 ml), lắc kỹ, để phân lớp, gạn lấy lớp n-hexan (lớp trên). Thêm n- hexan vào dịch chiết toàn phần để chiết tiếp. Chiết nhiều lần đến khi lớp n-hexan không có màu (khoảng 500 ml), gộp dịch chiết n-hexan, thu hồi dung môi thu được cắn.
- Chiết phân đoạn chloroform và ethyl acetat: tiến hành tương tự phân đoạn n- hexan, thu được 2 cắn tương ứng.
Cắn các phân đoạn n-hexan, chloroform, ethyl acetat được kí hiệu lần lượt là H, C, E.
Hình 3.6. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá cây Hồng
3.2.2.2. Định lượng các phân đoạn
Các cắn H, C, E được đem đi cân để xác định khối lượng (m).
Hàm lượng cắn của các phân đoạn (so với dược liệu khô tuyệt đối) được tính theo công thức:
Bột thô lá Hồng (100,74g) EtOH 70%
Dịch chiết EtOH
Cao lỏng nước Thu hồi ethanol
EtOH
Cao nước toàn phần
Ngâm ở nhiệt độ phòng, 24h/lần x 3 lần Để lắng, lọc, ly tâm Lớp nước n-hexan Lớp n- hexan Cắn H chloroform Cắn C Lớp nước Lớp Lớp EtOAc Lớp nước Cắn E EtOAc
H(%) = m
M. (1 − h) .100
Trong đó:
H là hàm lượng cắn (%) m là khối lượng cắn (g)
M là khối lượng bột dược liệu (M = 100,74 g) h là độ ẩm của dược liệu (h = 10,15% = 0,1015)
Kết quả xác định hàm lượng cắn của các phân đoạn được trình bày trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hàm lượng cắn các phân đoạn dịch chiết lá Hồng
Khối lượng dược liệu (g) Độ ẩm dược liệu (%) Phân đoạn dịch chiết Khối lượng cắn (g) Hàm lượng cắn (%) 100,74 g 10,15% n-hexan 0,25 g 0,28% chloroform 0,76 g 0,84% EtOAc 3,21 g 3,55%
Nhận xét: Phân đoạn ethyl acetat có hàm lượng cắn cao hơn nhiều lần so với
phân đoạn n-hexan và chloroform.
3.2.2.3. Định tính cắn các phân đoạn bằng phản ứng hóa học
Tiến hành định tính một số nhóm chất chính trong cắn của các phân đoạn như sau:
Định tính flavonoid: Hòa tan cắn từng phân đoạn trong ethanol 90% trên bếp cách thủy, lọc qua giấy lọc. Tiến hành các phản ứng đã ghi trong mục 3.2.1.2. Định tính saponin: Sử dụng cắn từng phân đoạn để tiến hành các phản ứng đã
ghi trong mục 3.2.1.3.
Định tính tanin: Hòa tan cắn từng phân đoạn trong nước cất trên bếp cách thủy, lọc qua giấy lọc. Tiến hành các phản ứng đã ghi trong mục 3.2.1.5.
Bảng 3.3. Kết quả định tính cắn các phân đoạn dịch chiết lá Hồng STT Phản ứng định tính Kết quả Cắn H Cắn C Cắn E 1 Flavonoid: Phản ứng Cyanidin
Phản ứng với dung dịch NaOH Phản ứng với hơi amoniac
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% Phản ứng diazo hóa - + - - - + ++ + ++ + ++ ++ + ++ ++ Kết luận Không có Có Có 2 Saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt Phản ứng Salkowski Phản ứng Liebermann – Burchardt - - - + ++ + + + + Kết luận Không có Có Có 3 Tanin
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% Phản ứng với chì acetat
Phản ứng với dung dịch gelatin 1%
- - - ++ + + ++ + + Kết luận Không có Có Có Chú thích: (-) Phản ứng âm tính (++) Phản ứng dương tính rõ (+) Phản ứng dương tính Nhận xét:
- Phân đoạn n-hexan không chứa các nhóm chất chính của lá Hồng.
- Phân đoạn chloroform và ethyl acetat chứa cả 3 nhóm chất flavonoid, saponin, tanin.
3.2.2.4. Định tính cắn các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng
- Bản mỏng sắc ký: Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 (MERCK), hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ, bảo quản trong bình hút ẩm.
- Hệ dung môi khai triển: chuẩn bị và khảo sát một số hệ dung môi đối với từng cắn để lựa chọn hệ dung môi tách tốt nhất.
- Tiến hành: chấm dịch chiết methanol đã chuẩn bị ở trên lên bản mỏng. Sấy nhẹ cho khô, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi. Sau khi khai triển sắc ký, lấy bản mỏng ra khỏi bình, sấy nhẹ 5 phút cho bay hơi hết dung môi. Quan sát sắc ký đồ thu được dưới ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại và nhúng thuốc thử hiện màu vanilin trong ethanol 96%.
Phân đoạn n-hexan (cắn H)
- Hệ dung môi khai triển:
Hệ I: Chloroform : MeOH (9:1)
Hệ II: n-hexan : EtOAc : Acid formic (4:4:1) Hệ III: Toluen : EtOAc : Acid formic (8:3:1) Hệ IV: Chloroform : EtOAc : Acid formic (8:3:1) Hệ V: n-hexan : Aceton (9:2)
- Kết quả: Sau khi khai triển, quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm, 366 nm, nhúng thuốc thử hiện màu vanilin trong ethanol 96% thấy hệ III cho kết quả tách tốt nhất, thu được sắc ký đồ Hình 3.7.
Hình 3.7. Sắc ký đồ phân đoạn n-hexan dịch chiết lá Hồng với hệ dung môi khai triển Toluen: EtOAc: Acid formic (8:3:1). Chú thích:
IIIa. Sắc ký đồ quan sát ở AST
IIIb. Sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 254nm IIIc. Sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 366nm
IIId. Sắc ký đồ sau khi nhúng TT vanilin/ethanol 96%, quan sát ở AST
Sắc ký đồ được chụp bởi phần mềm winCATS có định dạng .cna, sau đó được chuyển thành hình ảnh có định dạng .cpf để phân tích bằng phần mềm VideoScan, cho đồ thị và bảng biểu diễn kết quả sắc ký đồ tương ứng. Đồ thị và bảng biểu diễn kết quả sắc ký đồ phân đoạn n-hexan ở bước sóng 366 nm được trình bày trong Hình 3.8.
Hình 3.8. Kết quả sắc ký đồ phân đoạn n-hexan dịch chiết lá Hồng quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm.
Nhận xét:
Sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 254 nm thấy 6 vết, các vết tách xa nhau, tuy nhiên các vết màu nhạt, khá mờ.
Sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 366 nm thấy 14 vết, các vết tách đều, nhiều màu sắc khác nhau, trong đó các vết 7, 8, 13 đậm và sáng nhất.
Sắc ký đồ sau khi nhúng thuốc thử vanilin trong ethanol 96%, quan sát dưới ánh sáng thường thấy 12 vết, các vết đều bắt màu xanh đen, độ đậm nhạt khác nhau. Trong đó có 4 vết màu đậm, dễ quan sát, các vết còn lại mờ hoặc rất mờ.
Định tính phân đoạn chloroform (cắn C):
- Hệ dung môi khai triển:
Hệ I: Chloroform : MeOH (19:1)
Hệ II: n-hexan : EtOAc : Acid formic (4:4:1) Hệ III: Toluen : EtOAc : Acid formic (8:3:1)
Hệ IV: Chloroform : EtOAc : Acid formic (7,5:3:1) Hệ V: Chloroform : Aceton : Acid formic (7:2,5:0,5) Hệ VI: EtOAc : MeOH : H2O (8:1:1)
- Kết quả: Sau khi khai triển, quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm và 366 nm, nhúng thuốc thử vanilin trong ethanol 96% thấy hệ III cho kết quả tách tốt nhất, thu được sắc ký đồ trong Hình 3.9.
Hình 3.9 Sắc ký đồ phân đoạn chloroform dịch chiết lá Hồng với hệ dung môi khai triển Toluen: EtOAc: Acid formic (8:3:1) Chú thích:
IIIa. Sắc ký đồ quan sát ở AST
IIIb. Sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 254nm IIIc. Sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 366nm
IIId. Sắc ký đồ sau khi nhúng TT vanilin/ethanol 96%, quan sát ở AST
Kết quả sắc ký đồ sau khi phân tích bằng phần mềm VideoScan được trình bày trong hình 3.9.
Hình 3.10. Kết quả sắc ký đồ phân đoạn chloroform dịch chiết lá Hồng quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm.
Sắc ký đồ quan sát dưới ánh sáng thường: thấy 1 vết màu vàng, rõ, tương ứng với vết 11 trong sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 366 nm.
Sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 254 nm: thấy 11 vết, các vết tách đều, đậm, rõ, có 2 vết màu xanh lam.
Sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 366 nm: có 14 vết, trong đó các vết 5, 6, 7 đậm và sáng nhất.
Sắc ký đồ sau khi nhúng thuốc thử vanilin/ethanol 96%, quan sát dưới ánh sáng thường: thấy 8 vết, tuy nhiên các vết tách nhau không rõ. Đa số các vết màu nâu, có 1 vết màu xanh đậm, rõ.
Định tính phân đoạn ethyl acetat (cắn E):
- Hệ dung môi khai triển:
Hệ I: Chloroform: MeOH (9:1)
Hệ II: Chloroform: EtOAc: Acid formic (8:3:1) Hệ III: Toluen: EtOAc: Acid formic (6:2:1) Hệ IV: Toluen: EtOAc: Acid formic (9:6:1)
Hệ V: EtOAc: Acid acetic băng: Acid formic: H2O (100:11:11:26) Hệ VI: EtOAc: MeOH: H2O (8:1:1)
Hệ VII: EtOAc: Butanon: Acid formic: H2O (5:3:1:1) Hệ VIII: EtOAc: Acid formic: H2O (8:1:1)
- Kết quả: Sau khi khai triển, quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, 366 nm và nhúng thuốc thử vanilin trong ethanol 96%, thấy hệ IV cho kết quả tách tốt nhất, thu được sắc ký đồ trong Hình 3.11.
Hình 3.11. Sắc ký đồ phân đoạn ethyl acetat với hệ dung môi khai triển Toluen : EtOAc : Acid formic (9:6:1)
Chú thích:
IVa. Sắc ký đồ quan sát dưới AST
IVb. Sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 254 nm IVc. Sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 366 nm
IVd. Sắc ký đồ sau khi nhúng TT vanilin/ethanol 96%, quan sát dưới AST.
Kết quả sắc ký đồ sau khi phân tích bằng phần mềm VideoScan được trình bày trong hình 3.12.
Hình 3.12. Kết quả sắc ký đồ phân đoạn ethyl acetat quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm.
Nhận xét:
Sắc ký đồ quan sát ở AST thấy 6 vết, trong đó có 2 vết đậm, quan sát rõ, tương ứng với vết 7, 11 trên sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 366 nm.
Sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 254 nm thấy 5 vết, các vết đều đậm, quan sát rõ. Sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 366 nm phát hiện được 19 vết, độ đậm của các
vết tương đối đồng đều, trong đó vết 11 sáng nhất.
Sắc ký đồ sau khi nhúng thuốc thử vanilin/ethanol 96%, quan sát dưới AST thấy 11 vết, trong đó có vết màu tím rất đậm.
Đồ thị và bảng biểu diễn kết quả sắc ký đồ các phân đoạn phân tích ở AST, bước sóng 254 nm và sau khi nhúng TT hiện màu được trình bày trong Phụ lục 2.