3.2.1.1. Định tính glycosid tim
Cho 10 g bột dược liệu vào bình nón, thêm 100 ml ethanol 25%, ngâm trong 24 giờ. Gạn lấy dịch chiết, loại tạp bằng chì acetat dư, lọc qua giấy lọc gấp nếp. Chuyển dịch chiết vào bình gạn, lắc với hỗn hợp chloroform - ethanol (4:1) 3 lần, mỗi lần 10 ml. Gạn lấy lớp chloroform, gộp các dịch chiết chloroform và loại nước bằng natri sulfat khan. Chia đều dịch chiết vào 5 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô. Bốc hơi dịch chiết trên bếp cách thủy đến cắn. Dùng cắn này để tiến hành các phản ứng sau:
Phản ứng xác định khung steroid:
Phản ứng Liebermann – Burchardt
Hòa tan cắn với 1 ml anhydrid acetic, 1 ml chloroform. Nghiêng ống 45o. Cho từ từ theo thành ống 1 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu đỏ tím (phản ứng dương tính).
Phản ứng xác định vòng lacton 5 cạnh:
Phản ứng Baljet
Pha thuốc thử Baljet: Cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%. Lắc đều.
Hòa tan cắn với 1 ml ethanol 90%. Thêm 1 ml thuốc thử Baljet mới pha. Quan sát màu ngay sau khi nhỏ thuốc thử. So sánh màu sắc với ống chứng (chỉ chứa thuốc thử Baljet).
Kết quả: Ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng (phản ứng dương tính).
Phản ứng Legal
Hòa tan cắn với 1 ml ethanol 90%. Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều. Quan sát màu ngay sau khi nhỏ thuốc thử. So sánh màu sắc với ống chứng (ống không có cắn).
Kết quả: Ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng (phản ứng dương tính).
Phản ứng xác định phần đường 2-desoxy:
Phản ứng Keller - Kiliani
Hòa tan cắn với 1 ml ethanol 90%. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 45o. Cho từ từ theo thành ống 1 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện 1 vòng màu cam, lớp chất lỏng phía trên có màu vàng, không có màu xanh lá (phản ứng âm tính).
Phản ứng với acid phosphoric đậm đặc
Hòa tan cắn với 1 ml aceton. Thêm 5 ml acid phosphoric đậm đặc, lắc đều, đặt trên bếp cách thủy 15 phút, sau đó làm nguội.
Kết quả: Dung dịch trong ống không chuyển màu (phản ứng âm tính).
Nhận xét: lá Hồng không chứa glycosid tim.
3.2.1.2. Định tính flavonoid
Chiết 10 g bột dược liệu với ethanol 70% bằng cách đun hồi lưu trong 1 giờ. Lọc dịch chiết qua giấy lọc gấp nếp, bốc hơi trên bếp cách thủy đến khô. Loại tạp bằng ether dầu hỏa. Hòa tan lại cắn trong 10 ml ethanol 90%. Chia đều dịch chiết vào 5 ống nghiệm nhỏ, đem tiến hành các phản ứng sau:
Phản ứng Cyanidin
Thêm vào ống nghiệm chứa dịch chiết một ít bột magnesi kim loại. Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (5 – 10 giọt). Để yên một vài phút.
Kết quả: Dung dịch màu vàng chuyển sang màu hồng (phản ứng dương tính). Phản ứng với kiềm
Phản ứng với dung dịch NaOH
Thêm vào ống nghiệm chứa dịch chiết vài giọt dung dịch NaOH 10%. Kết quả: Dung dịch chuyển sang màu đỏ cam (phản ứng dương tính). Phản ứng với hơi amoniac
Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Sấy khô rồi hơ trên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nắp. Quan sát màu của vết dịch chiết. So sánh với mẫu chứng là một giọt dịch chiết khác không được hơ trên lọ amoniac.
Kết quả: Màu vàng của vết dịch chiết thử đậm hơn so với mẫu chứng (phản ứng dương tính).
Phản ứng với FeCl3
Thêm vào ống nghiệm chứa dịch chiết vài giọt FeCl3 5%.
Kết quả: Dung dịch xuất hiện màu xanh đen (phản ứng dương tính). Phản ứng diazo hóa
Kiềm hóa dịch chiết bằng dung dịch NaOH, thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều. Đun nóng trên nồi cách thủy vài phút.
Kết quả: Dung dịch chuyển thành màu đỏ (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Lá Hồng có chứa flavonoid.
3.2.1.3. Định tính saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt
Cho vào ống nghiệm lớn 0,1 g bột dược liệu, thêm 5 ml nước. Lắc mạnh theo chiều dọc trong 5 phút. Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt.
Kết quả: Bọt còn bền sau 15 phút (phản ứng dương tính). Các phản ứng màu
Chiết 10 g bột dược liệu với ethanol 70% bằng cách đun hồi lưu trong 30 phút. Lọc dịch chiết qua giấy lọc gấp nếp, bốc hơi trên bếp cách thủy đến khô. Loại tạp bằng ether dầu hỏa. Dùng cắn để làm các phản ứng sau:
Phản ứng Salkowski:
Hòa tan cắn với 1 ml ethanol 90%. Nghiêng ống nghiệm 45o. Cho từ từ theo thành ống 1 ml acid sulfuric đặc.
Kết quả: Ở mặt ngăn cách giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu nâu đỏ (phản ứng dương tính).
Phản ứng Liebermann – Burchardt
Hòa tan cắn với 1 ml anhydrid acetic, 1 ml chloroform. Nghiêng ống 45o. Cho từ từ theo thành ống 1 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Kết quả: Vòng ngăn cách giữa 2 lớp chất lỏng có màu đỏ tím (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Lá Hồng có chứa saponin.
3.2.1.4. Định tính coumarin
Chiết 10 g bột dược liệu bằng ethanol 90% bằng cách đun hồi lưu trong 1 giờ. Lọc nóng qua giấy lọc. Dịch chiết thu được đem tiến hành các phản ứng sau: Phản ứng mở đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết. Ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Ống 2 để nguyên.
Đun cả 2 ống nghiệm trên bếp cách thủy trong vài phút. Để nguội.
Kết quả: Ống 1 có màu đỏ cam, ống 2 trong. Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất. Không có hiện tượng gì xảy ra (phản ứng âm tính).
Phản ứng diazo hóa
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết. Thêm 1 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy trong 5 phút. Làm lạnh dưới vòi nước rồi thêm từng giọt thuốc thử diazo.
Kết quả: Dung dịch xuất hiện màu đỏ (phản ứng dương tính). Quan sát huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên 1 tờ giấy lọc, chờ khô dung môi và lặp lại như trên 4 lần. Nhỏ chồng lên đó 1 giọt NaOH 5%, sấy khô. Che ½ vết bằng 1 miếng kim loại rồi đem soi đèn UV trong vài phút. Lấy miêng kim loại ra và quan sát vết dịch chiết dưới ánh sáng tử ngoại.
Kết quả: Vết dịch chiết sáng đồng đều ở cả nửa bị che và không bị che (phản ứng âm tính).
3.2.1.5. Định tính tanin
Chiết 10 g bột dược liệu bằng nước trên bếp cách thủy trong 15 phút. Để nguội, lọc qua giấy lọc. Dịch lọc đem tiến hành các phản ứng sau:
Phản ứng với FeCl3
Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5%.
Kết quả: Dung dịch xuất hiện màu xanh đen (phản ứng dương tính). Phản ứng với chì acetat
Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch chì acetat 10%.
Kết quả: Trong ống nghiệm xuất hiện tủa bông (phản ứng dương tính). Phản ứng với dung dịch gelatin
Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%. So sánh ống thử với ống chứng chỉ chứa thuốc thử và nước cất.
Kết quả: Trong ống nghiệm xuất hiện tủa bông trắng (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Lá Hồng có chứa tanin.
3.2.1.6. Định tính anthranoid
Chiết nóng 10 g bột dượcliệu bằng dung dịch H2SO4 20% trong 1 giờ. Lọc dịch chiết còn nóng qua bông. Làm nguội dịch lọc. Lắc dịch lọc với ether (2 lần, mỗi lần 8 ml). Lớp ether thu được tiến hành các phản ứng như sau:
Phản ứng Borntraeger
Lấy 1 ml dịch chiết, thêm 1 ml dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Kết quả: Lớp nước không có màu đỏ sim (phản ứng âm tính). Thử nghiệm vi thăng hoa
Trải bột dược liệu thành lớp mỏng trong một nắp nhôm, đốt nhẹ để loại nước. Sau đó đậy lên nắp nhôm một miếng lam kính, bên trên có miếng bông đã thấm nước, tiếp tục đun nóng trong khoảng 5 – 10 phút. Lấy lam kính ra để nguội, soi kính hiển vi.
Kết quả: Không quan sát thấy các tinh thể hình kim màu vàng (phản ứng âm tính).
3.2.1.7. Định tính alcaloid
Làm ẩm 10 g bột dược liệu bằng NH4OH 25% trong 20 phút. Chiết dược liệu với chloroform bằng Soxhlet trong 2 giờ. Dịch chiết thu được lắc với dung dịch acid sulfuric 2%. Dich acid được dùng để định tính alcaloid bằng các phản ứng sau: Phản ứng với thuốc thử Mayer
Lấy 2 ml dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử Mayer.
Kết quả: Trong ống nghiệm không xuất hiện tủa (phản ứng âm tính). Phản ứng với thuốc thử Bouchardat
Lấy 2 ml dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử Bouchardat.
Kết quả: Trong ống nghiệm không xuất hiện tủa (phản ứng âm tính). Phản ứng với thuốc thử Dragendorff
Lấy 2 ml dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử Dragendorff.
Kết quả: Trong ống nghiệm không xuất hiện tủa (phản ứng âm tính).
Nhận xét: Lá Hồng không chứa alcaloid.
3.2.1.8. Định tính polysaccharid, đường khử, acid hữu cơ, acid amin
Chiết 10 g bột dược liệu với nước trên bếp cách thủy trong 15 phút. Lọc dịch chiết qua giấy lọc gấp nếp. Dùng dịch lọc để tiến hành các phản ứng sau:
Định tính polysaccharid
Chuẩn bị 2 ống nghiệm:
Ống 1: 4 ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol. Ống 2: 4 ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol. Quan sát màu dung dịch trong 2 ống nghiệm.
Kết quả: Màu dịch chiết trong 2 ống như nhau (phản ứng âm tính).
Nhận xét: Lá Hồng không chứa polysaccharid.
Định tính đường khử
Lấy 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 1ml thuốc thử Fehling A và 1 ml thuốc thử Fehling B. Đun cách thủy trong vài phút.
Kết quả: Trong ống nghiệm xuất hiện tủa đỏ gạch (phản ứng dương tính).
Định tính acid hữu cơ
Lấy 5 ml dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm vào dịch chiết một ít tinh thể Na2CO3.
Kết quả: Trong ống nghiệm xuất hiện bọt khí bay lên (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Lá Hồng có chứa acid hữu cơ.
Định tính acid amin
Lấy 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm vào dịch chiết vài giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thủy vài phút.
Kết quả: Dung dịch trong ống chuyển sang màu tím (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Lá Hồng có chứa acid amin. 3.2.1.9. Định tính chất béo, caroten, sterol
Chiết 10 g bột dược liệu với ether dầu hỏa bằng cách ngâm qua đêm. Lọc dịch chiết qua bông. Dịch lọc đem tiến hành các phản ứng sau:
Định tính chất béo
Nhỏ vài giọt dịch chiết lên 1 tờ giấy lọc. Sấy nhẹ cho bay hơi hết dung môi. Kết quả: Trên tờ giấy lọc không có vết mờ (phản ứng âm tính).
Nhận xét: Lá Hồng không chứa chất béo.
Định tính caroten
Lấy 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm, bốc hơi trên bếp cách thủy đến khô. Thêm vào cắn vài giọt H2SO4 đặc.
Kết quả: Trong ống nghiệm xuất hiện màu xanh lá (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Lá Hồng có chứa caroten.
Định tính sterol
Lấy 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm, bốc hơi trên bếp cách thủy đến khô. Thêm vào cắn 1 ml anhydrid acetic, lắc kĩ cho tan hết cắn. Nghiêng ống nghiệm 45o. Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Kết quả: Vòng ngăn cách giữa 2 lớp chất lỏng có màu đỏ tím (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Lá Hồng có chứa sterol.
Kết quả định tính các nhóm chất trong dược liệu được tóm tắt ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất trong lá cây Hồng
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận 1 Glycosid tim Phản ứng Liebermann – Burchardt Phản ứng Baljet Phản ứng Legal Phản ứng Keller – Killiani Phản ứng với H3PO4 đậm đặc + + + - - Không có 2 Flavonoid Phản ứng Cyanidin
Phản ứng với dung dịch NaOH Phản ứng với hơi amoniac
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% Phản ứng diazo hóa + ++ + ++ + Có 3 Saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt Phản ứng Salkowski Phản ứng Liebermann – Burchardt + + + Có 4 Coumarin Phản ứng mở đóng vòng lacton Phản ứng diazo hóa
Quan sát huỳnh quang
- + -
Không có
5 Tanin
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% Phản ứng với chì acetat
Phản ứng với dung dịch gelatin 1%
++ ++ +
Có
6 Anthranoid Phản ứng Borntraeger Thử nghiệm vi thăng hoa
- - Không có 7 Alcaloid Phản ứng với TT Mayer Phản ứng với TT Bouchardat Phản ứng với TT Dragendorff - - - Không có
9 Đường khử Phản ứng với TT Fehling + Có 10 Acid hữu cơ Phản ứng với tinh thể Na2CO3 + Có 11 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin 3% + Có 12 Chất béo Phản ứng tạo vết mờ trên giấy lọc - Không có 13 Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc + Có 14 Sterol Phản ứng Liebermann – Burchardt + Có Chú thích: (-) Phản ứng âm tính (++) Phản ứng dương tính rõ
(+) Phản ứng dương tính
Nhận xét: Qua các phản ứng định tính trên, sơ bộ kết luận lá cây Hồng có
chứa flavonoid, saponin, tanin, đường khử, acid hữu cơ, acid amin, caroten và sterol.