NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA VỊ THUỐC LÁ CÂY THỊ

Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết lá cây Thị.... formic: acid formic NC: Nghiên cứu DANH MỤC CÁC BẢNG 1 Một số loài thuộc chi Diospyros 3 2 Kết quả định tính các nhóm ch

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 Đặc điểm chung của họ Thị (Ebenaceae) 2

1.2 Tổng quan về chi Diospyros 2

1.2.1 Vị trí phân loại của chi Diospyros 2

1.2.2 Đặc điểm chung của chi Diospyros 2

1.2.3 Một số loài thuộc chi Diospyros 3

1.3 Đặc điểm của loài Diospyros decadra Lour 6

1.3.1 Đặc điểm thực vật 6

1.3.2 Phân bố, sinh thái 6

1.3.3 Bộ phận dùng 6

1.3.4 Thành phần hóa học 6

1.3.5 Tác dụng dược lí 10

1.3.6 Tính vị, công năng 11

1.3.7 Công dụng và liều dùng 11

1.3.8 Các bài thuốc có thị 11

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13

2.1.1 Nguyên liệu 13

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ 13

2.1.3 Thiết bị, máy móc 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật 14

2.2.2 Nghiên cứu về hóa học 15

2.2.3 Nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật 15

2.3.2 Nghiên cứu về hóa học 15

2.3.3 Nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn 16

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 17

3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 17

3.1.1 Đặc điểm lá thị 17

3.1.2 Xác đinh tên khoa học của mẫu nghiên cứu 18

3.2.1 Định tính các nhóm chất 21

3.2.2 Chiết xuất, định lương, định tính cắn một số phân đoạn 28

3.3 Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết lá cây Thị 36

3.3.1 Chuẩn bị 36

3.3.2 Kết quả 38

3.4 Bàn luận 39

3.4.1 Về thực vật 39

3.4.2 Về hóa học 39

3.4.3 Về tác dụng kháng khuẩn 40

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

4.1 Kết luận 41

4.1.1 Về thực vật 41

4.1.2 Về hóa học 41

4.1.3 Về tác dụng kháng khuẩn 41

4.2 Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO

3

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

EtOH: ethanol

EtOAC: ethylacetat

TT: Thuốc thử

A formic: acid formic

NC: Nghiên cứu

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Một số loài thuộc chi Diospyros 3

2 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá Thị 27

3 Hàm lượng cắn các phân đoạn theo dược liệu khô tuyệt đối 31

4 Kết quả định tính một số nhóm chất trong 3 phân đoạn n-hexan,

11 Sắc kí đồ cắn dịch chiết Chloroform dưới AST, UV254, UV366 33

12 Sắc kí đồ cắn dịch chiết Chloroform dưới AST, UV366, UV366 33

13 Sắc kí đồ cắn dịch chiết Ethylacetat UV254 với hệ dung môi

Toluen - Ethyl acetat - A.formic 34

14 Sắc kí đồ cắn dịch chiết Ethylacetat UV254 với hệ dung môi

Toluen - Ethyl acetat - A.formic 34

15

Hệ sắc kí của 3 cắn n-hexan, ethylaceta, chloroform trong cùng

một điều kiện với cùng một hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat -

A.formic

35

16 Sơ đồ đặt mẫu nghiên cứu thử tác dụng kháng khuẩn 37

nhiều sự quan tâm giúp đỡ từ các thầy, cô giáo, gia đình và bạn bè đồng nghiệp

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:

PGS.TS.Vũ Văn Điền, người đã tận tình chỉ bảo, tạo mọi điều kiện, trực tiếp

hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Cao Văn Thu và các anh chị kĩ

thuật viên bộ môn Vi sinh - Sinh học đã giúp đỡ tôi trong nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của lá thị

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Quốc Huy đã giúp đỡ tôi giám

định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi tới lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô, các kĩ thuật viên ở Bộ môn Dược Học Cổ Truyền đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quãng thời gian tôi thực hiện nghiên cứu tại bộ môn

Trong phạm vi hạn chế của khóa luận, những kết quả thu được mới chỉ

là bước đầu và trong quá trình làm việc khó tránh khỏi những thiếu xót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô giáo và bạn bè đồng nghiệp

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Đinh Thị Xuân

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với địa hình đa dạng, kéo dài trên nhiều vĩ độ Vì vậy Việt Nam là một trong 16 quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất thế giới với khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao gồm 485 loài cây có tinh dầu, 473 loài có dầu béo, 800 loài có tanin, 113 loài có nhựa thơm Trong số đó hơn

4000 loài thực vật được xác định có hoạt tính sinh học và được sử dụng để chữa bệnh Mặt khác, nhân dân ta có truyền thống lâu đời sử dụng cây cỏ làm thuốc chữa bệnh và bảo vệ sức khỏe, do đó đã tích lũy được kho tàng tri thức quý giá về những dược liệu có nguồn gốc tự nhiên Những điều kiện trên đã đưa Việt Nam trở thành một quốc gia có nguồn tài nguyên dược liệu vô cùng phong phú [2]

Trong số đó, nhiều cây thuốc đã được nghiên cứu và xây dựng tiêu chuẩn đưa vào Dược Điển Việt Nam Tuy nhiên vẫn còn có những cây thuốc hiện nay đang được nhân dân sử dụng theo kinh nghiệm dân gian mà chưa được nghiên cứu hoặc nghiên cứu chưa đầy đủ Vì vậy việc nghiên cứu cây thuốc nhằm làm sáng tỏ kinh nghiệm dân gian và nâng cao giá trị sử dụng của dược liệu là rất cần thiết

Cây thị có tên khoa học là Diospyros decandra Lour, thuộc họ thị

Ebenaceae rất gần gũi với chúng ta được trồng rải rác trong các vườn gia đình,

đình, chùa, miếu mạo để lấy quả Theo kinh nghiệm dân gian, hầu hết các bộ phận của cây thị đều được dùng làm thuốc chữa bệnh như chữa giun kim ở trẻ nhỏ, chữa đầy bụng, táo bón, viêm tinh hoàn, mụn nhọn Cây thị có nhiều bộ phận dùng làm thuốc như quả, hạt, vỏ thân, vỏ rễ và lá, trong đó mới có công trình nước ngoài nghiên cứu thành phần hóa học của vỏ cây Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam có ít công trình nghiên cứu về cây thị Với mục tiêu tìm hiểu khả năng sử dụng dược liệu

này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:" Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành

phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của vị thuốc lá cây thị" với một số nội

dung sau:

1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật lá thị

2 Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá thị

3 Thử tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết lá thị

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm chung của họ Thị (Ebenaceae)

Lá đơn thường mọc cách, không có lá kèm Hoa thường đơn tính khác gốc, mẫu 3 hoặc 4 - 5, nhị rời nhau, đẳng số và xen kẽ với thùy tràng hoặc gấp đôi số cánh nhưng xếp thành hai vòng, bao phấn đôi khi mở bằng lỗ ở đỉnh, bầu thượng, 2

- 16 ô đầy đủ Họ thị đặc trưng bởi đài bền, đồng trưởng theo quả: cánh hoa xếp vặn, xếp lợp hay xếp van; quả mọng; hạt có nội nhũ sừng và thường nhăn nheo [1] Phân bố rộng ở nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, châu Phi và châu Mỹ [1]

1.2 Tổng quan về chi Diospyros

1.2.1 Vị trí phân loại của chi Diospyros

Chi Diospyros có vị trí phân loại như sau: [7]

1.2.2 Đặc điểm chung của chi Diospyros

Cây gỗ hay cây bụi Lá sớm rụng, mọc so le, lá nguyên

Hoa đa tính hay khác gốc, 4 lá đài tồn tại, 4 cánh hoa hợp ở gốc, nhị 10 - 15 đôi, bầu 4 - 5 ô Quả mọng có khi ăn được [6]

Gồm khoảng 475 loài phân bố ở các vùng nhiệt đới, ở châu Á có tới 2000 loài Ở nước ta đã thống kê được 70 loài [6] Trong đó đáng chú ý có những loài

cho gỗ quý như Mun (Diospyros mun A.Chev.), quả ăn được như hồng (Diospyros

kaki L.f) và cây thị (Diospyros decandra Lour.) [12]

Các thành phần chính được phân lập từ các loài thuộc chi Diospyros gồm

naphthaquinones, triterpenoids và steroid có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, antiprotozoal, antimolluscocidal, chống viêm và độc tế bào [13]

1.2.3 Một số loài thuộc chi Diospyros

Bảng 1: Một số loài thuộc chi Diospyros [13]

Tên thường gọi

Bộ phận

Isodiospyrin b-amyrin Olean-12-en-3-on Bi-naphthoquinone

Độc tế bào

3 D.leucomelas Lá

Betuline Acid Betuline Acid ursolic

Chống viêm

4 D.usambarensis Vỏ rễ

7-methyljuglone Mamegakinone Isodiospyrin Diosindigo A 7-methyluglone Diosindigo B

Molluscocidal Kháng nấm

5 - D.Mollis Griff

- Mặcnưa [8] Quả

Lupeol a-amyrine b-sitosterol Diospyrol 1,8-dihydroxynaphthalene

Hạ đường huyết Kháng khuẩn

Rễ

Dihydroflavonol glycoside 5,7,3,5'- Tetra hydroxyl-3'- methoxy flavone

Betulin acid Betulinic 2-methyl-5-methoxy-1,4 naphthaquinone

1,9,naphthaquinone 2-methyl-3-hydroxy-5-methoxy-1,4-

3-methyl-8-methoxy-naphthaquinone 2-methyl-5,6-di methoxy-1,4-

naphthaquinone

Lá

β-sitosterol monohydroxy monocarboxylic acid monohydroxy triterpene Bauererys acetat

ursolic

Betulinic acid Baurenol Diospyric acid Íobanerenol Methyl betulinate

8 D ismailli Ng Gỗ tươi

coumarin Ismallin 4-hydroxy-5-methyl coumarins

10 D canaculata De

Wild

Coumarin Ismailin Canaculation

11 D.chloroxlon

7-methyljuglone Diospyrin Isodiospyrin Xylospyrin 2-methyl-3,6-dihydroxy-4,5-dimethoxy

naphthalenes 2-methyl-3,4,5,6-tetra methoxy-naphthalene

1.3 Đặc điểm của loài Diospyros decadra Lour

1.3.1 Đặc điểm thực vật

Tên khoa học: Diospyros decandra Lour

Tên Việt Nam: Thị, Thị muộn, Thị sáp [12] Thị rừng, Thị mười nhị [9] Cây to, cao 7-10 m, phân cành nhiều Cành non có lông tơ mềm màu hung

Lá mọc so le, cuống ngắn, hình trái xoan - thuôn, gốc hình nêm, đầu tù hơi nhọn, hai mặt gần như cùng màu [12], gân phụ 6 cặp, mảnh [8]

Cụm hoa mọc thành xim ở kẽ lá, ngắn hơn lá nhiều; hoa màu trắng; hoa đực

có ống dài ngắn, có lông; hoa tạp tính gồm những hoa sinh sản ở giữa, hoa không sinh sản ở mặt ngoài, tất cả đều phủ nhiều lông mềm, bầu nhiều noãn [12]

Qủa mọng, hình cầu, đít tròn, to bằng quả cam, khi chín mà vàng, rất thơm, đài tồn tại nhỏ gồm 4 thùy cong lên và có lông; hạt cứng, dẹt [12]

Mùa ra quả tháng 6 – 9 [12]

1.3.2 Phân bố, sinh thái

Thị có nguồn gốc ở vùng Đông Á (Lê Trần Chấn et al,1999); có tài liệu cho rằng thị là đặc hữu của Việt Nam, Lào, Campuchia (Võ Văn Chi, 1997), hoặc vừa thấy mọc hoang dại vừa được trồng ở những nước này và Thái Lan (Vidal,J.E., Martel, G.& Lewitz, S.,1969) Ở Việt Nam, thị là cây trồng quen thuộc, đã đi vào các câu chuyện cổ tích từ xa xưa Cây có nhiều ở vườn gia đình, đình, chùa các tỉnh đồng bằng, trung du và vùng núi thấp ở miền Bắc [12]

Thị lúc nhỏ chịu bóng, sau trở lên ưa sáng; ra chồi và lá non trong mùa xuân

- hè; quả chín giữa mùa thu, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt [12]

Thịt quả thị: Theo kết quả phân tích của Peirier (1932) có 86,20% nước, 0,16% chất béo, 0,67% chất protit, 12% gluxit, 0,33% tanin, 0,47% xenluloza, 0,50% tro [9]

Tanin trong thị thuộc loại tanin pyrocatechic, khi bị oxy hóa thì cho chất màu

đỏ nâu Peirier cho đó là hoạt chất chính [9]

 Các thành phần từ vỏ cây

Tiến hành sắc kí cột dịch chiết chloroform vỏ cây D.decandra thu được 5

hợp chất mới, cùng với hợp chất đã biết trước đó là acid betulinic[14]

- Hợp chất 1: acid diospyric A, có công thức hóa học là 2-oxo-3β,

19α-dihydroxy-24-nor-urs-12-en-28-oic acid [14]

(1a) R=R"=H, R'=COCH3 oic acid)

(1b) R=H, R'=COCH3, R"=CH3 en-28-oic acid methyl ester)

(2-oxo-3β-O-acetyl-19α-hydroxy-24-nor-urs-12 Hợp chất 2: acid diospyric B, có công thức cấu tạo là 2(2-oxo-3β-O-acetyl-19α-hydroxy-24-nor-urs-12 oxo(2-oxo-3β-O-acetyl-19α-hydroxy-24-nor-urs-12 3β, 19α, 22α(2-oxo-3β-O-acetyl-19α-hydroxy-24-nor-urs-12

(4) R=H

(4a) R=CH3 (4-oxo-19α, 22α-dihydroxy-3, 24-dinor-2,4-seco-urs-12-en-2,28-dioic acid dimethyl ester)

- Hợp chất 5: acid diospyric E, công thức cấu tạo là 19α,

22α-dihydroxy-24-nor-2,3-seco-urs-12-en-2,3,28-trioic acid trimethyl ester [14]

Các hợp chất của acid betulinic 1-4 được thử nghiệm cho thấy tác dụng kháng vi khuẩn lao, kháng nấm Acid betulinic và hợp chất 1 cho thấy khả năng kháng vi khuẩn lao trung bình và yếu với MIC25, tương ứng 200mg/ml Acid

betulinic và hợp chất 2 cho thấy khả năng kháng nấm Candida albicans với giá trị

IC50 là 27,2 tương ứng với 42,6mg/ml Trong đó có hợp chất 1,3 có khả năng gây độc tế bào chống lại bênh ung thư vú (BC), ung thư mũi họng (KB) và dòng tế bào phổi ở người NCI-H187 ở mức độ yếu, khả năng chống lại dòng tế bào NCI-H187 với IC50 là 12,6mg/ml, trong khi chất 1 và 2 không có tác dụng trên dòng tế bào này

ở 20mg/ml [14]

1.3.5 Tác dụng dược lí

 Tác dụng trên giun đất invitro: dùng 20g bột thịt quả thị phơi khô, tán nhỏ,

chiết bằng 200ml nước Kết quả cho thấy liều vừa phải làm giun bị tê liệt, liều cao làm chết giun và liều càng cao, giun chết càng nhanh, có tác giả cho rằng tác dụng này do tanin glucosidic, dẫn chất pyrocatechic phlobaphen

[12]

 Tác dụng trên ruột thỏ tại chỗ: mổ bụng thỏ, bộc lộ ruột để quan sát sự co

bóp ruột bằng mắt thường Nước sắc lá thị 1:1 (cứ 1g lá thị khô sắc rồi cô còn 1ml) tiêm vào tĩnh mạch vành tai liều 2, 3 và 5 ml/kg thấy ruột tăng co bóp, nhất là tá tràng, trực tràng, đặc biệt ở trực tràng, có hiện tượng căng phồng lên, nhu động đều và tống phân ra ngoài [12]

 Tác dụng trên ruột thỏ cô lập: một đoạn hồi tràng thỏ cô lập theo phương

pháp Magnus, được nuôi bằng dung dịch Tyrode Nhỏ 5, 8, 10 giọt nước sắc

lá thị 1:1 vào dịch nuôi sẽ làm tăng co bóp cả về tần số lẫn biên độ [12]

 Tác dụng trên tim mạch, hô hấp: liều nhỏ dịch chiết lá thị sẽ làm tăng biên

độ tim, liều cao làm yếu tim, loạn nhịp tim và ngừng tim, liều nhỏ ít ảnh hưởng tới huyết áp, nhưng liều cao gây giãn mạch, hạ huyết áp, hô hấp hơi tăng cả về tần số lẫn biên độ [12]

 Tác dụng trên cơ vận của bộ xương: dùng cơ năng chân ếch cô lập và

phương pháp Claude bernard trên cơ thể toàn vẹn thì đều thấy lá thị đã làm cho cơ phản ứng nhạy hơn đối với các kích thích điện trực tiếp trên cơ và dây thần kinh hông ếch Tác dụng này cũng giống tác dụng của prostigmin [12]

 Độc tính: dùng nước sắc lá thị khô cho khỉ, thỏ, chuột lang, chuột nhắt trắng,

ếch uống, tiêm dưới da, tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm vào túi bạch huyết cho ếch đều thấy ít độc, trừ khi dùng liều cao Ví dụ ở thỏ, liều nước sắc tính theo dược liệu khô là 16 g/kg tiêm tĩnh mạch mới thấy biểu hiện độc, trong khi liều có tác dụng kích thích làm tăng biên độ tim là 0,4 g/kg [12]

 Thử lâm sàng ở bệnh viện Phú Thọ: nước sắc lá thị 1:1 mỗi ngày cho uống

10, 20, 30 ml, đồng thời lấy bông tẩm nước sắc này đắp vào rốn để gây trung

tiện sau khi mổ, kết quả rất tốt, thời gian trung tiện nhanh hơn so với lô chứng [12]

1.3.6 Tính vị, công năng

 Vỏ rễ cây thị có vị đắng, tính hơi lạnh, có tác dụng giải nhiệt độc, trừ giun Thịt quả thị có tác dụng trừ giun, an thần Vỏ quả tiêu độc, tiêu viêm, lá hạ khí, gây trung tiện, tiêu viêm, giảm đau [12]

1.3.7 Công dụng và liều dùng

 Thịt quả thi được dùng an thần và tẩy giun (nhất là giun kim) ở trẻ em, hằng ngày ăn 2-3 quả Vỏ quả phơi khô, đốt thành than tán bột mịn, hòa với dầu vừng hoặc mỡ lợn, bôi chữa rộp da cho con giời leo, rắn cắn, hoặc trộn với

than chiếu cói và đinh hương chữa lỗ rò hậu môn [12]

 Vỏ rễ thị, chỉ lấy lớp mỏng trắng ở trong (40g), sắc uống chữa trẻ nôn ói, đầu mình nóng [12]

 Vỏ thân cây thị, cạo lấy lớp tơ trắng ở trong, giã với muối, đắp vào vết thương làm giảm đau và rút gai, dằm [12]

 Lá thị để thông hơi, gây trung tiện, chữa phù thũng, ngày 30 - 50 g Dùng ngoài, lấy lá tươi giã đắp, chữa mụn nhọt, vết thương, vết bỏng lửa [12]

 Ở Campuchia, người ta dùng quả Thị để trị bệnh mất ngủ và dùng chế thuốc điều kinh [7]

1.3.8 Các bài thuốc có thị

 Chữa lở loét, sâu quảng: Vỏ rễ thị sắc lấy nước hoặc lá thị sắc đặc rồi rửa

Kết hợp lấy vỏ thân đốt thành than tán mịn, rắc lên vết loét [12]

 Thuốc gây trung tiện chữa trướng bụng đầy hơi [12]

- Lá thị, thái nhỏ, phơi khô, cuộn vào giấy như điếu thuốc lá, ngày hút 3 lần

- Lá thị tươi khoảng 100g, giã nát, đắp một nửa vào rốn và một nửa vào hậu môn

- Lá thị khô 100g, sắc còn lại 100ml, cho bệnh nhân sau khi mổ uống mỗi lần

20 - 30 ml, ngày 2 lần Kết hợp lấy bông thấm nước sắc này đắp vào rốn

 Chữa viêm tinh hoàn (Thiên trụy), mụn nhọt mới phát:

Lá thị tươi, giã nát, thêm ít rượu, chắt uống và bã đắp [12]

 Chữa dị ứng: Lá thị 100 g, thân rễ cây ráy 50 g, thái nhỏ, phơi khô, nấu với

nước, rồi xông [12]

 Chữa phù thũng: Lá thị, lá đu dủ, lá trầu không và lá lộc mại mỗi vị 50g, phơi khô, sắc uống Kết hợp lấy lá tươi của 4 thứ với lượng như trên, giã nát,

gói bằng lá chuối, nướng chín rồi rịt vào rốn, băng lại [12]

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

- Lá cây thị được thu hái tại xã Tam Cường, huyện Vĩnh Bảo, t.p Hải Phòng

- Thời gian lấy mẫu: Tháng 12 năm 2013

- Xử lí mẫu: Lá thị rửa sạch, loại bỏ cành, sấy khô ở 60oC Nghiền thành bột thô và được bảo quản trong túi ni lông kín, để nơi khô ráo để nghiên cứu

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ

 Thuốc thử, hóa chất, dung môi dùng trong nghiên cứu thực vật:

Javen, cloralhydrat, acid acetic 5%, xanh methylen, đỏ son phèn

 Thuốc thử, hóa chất, dung môi dùng trong nghiên cứu thành phần hóa học:

- Mg, HCl, TT Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat, TT diazo mới pha,

FeCl3 5%, genlatin 1%, TT Lugol, TT ninhydrin 3%

- Ethylacetat, n-hexan, cloroform, ethanol, methanol, toluen, acid formic

- Vi khuẩn Gram âm:

Pseudomonas aeruginosa VM201 (Pseu)

Escherichia coli ATCC25922 (EC)

Proteus mirabilis BV108 (Pro)

Shigella flexneri DT112 (Shi)

Salmonella typhi DT220 (Sal)

- Vi khuẩn Gram dương:

Staphylococcus aureus ATCC 1128 (Sta)

Bacillus pumilus ATCC 10241 (Bp)

Bacillus subtilis ATCC 6633 (Bs)

Bacillus cereus ATCC 9946 (Bc)

Sarcina lutea ATCC 1128 (Sar)

 Môi trường thử nghiệm

- Môi trường canh thang:

 Nồi cách thủy, bếp điện

 Máy cất quay thu hồi dung môi

 Đèn tử ngoại

 Cân kĩ thuật, cân phân tích

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật

 Mô tả đặc điểm hình thái lá và xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

 Mô tả đặc điểm bột và vi phẫu lá của cây thị

2.2.2 Nghiên cứu về hóa học

 Định tính sơ bộ các nhóm chất chính trong lá cây thị bằng các phản ứng hóa

học

 Chiết xuất, định lượng, định tính một số phân đoạn chính của lá cây thị

2.2.3 Nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn

 Thử tính kháng khuẩn của cao lỏng lá Thị chiết bằng Ethanol 70% ở 3 nồng

2.3.2 Nghiên cứu về hóa học

2.3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá cây Thị bằng các phản ứng hóa học

 Định tính sơ bộ các nhóm chất bằng các thuốc thử và phản ứng đặc hiệu của từng nhóm chất được ghi trong các tài liệu [3], [4]

2.3.2.2 Chiết xuất, định tính và định lượng cắn các phân đoạn

 Xác định hàm ẩm bột dược liệu

 Chiết xuất dược liệu bằng dung môi EtOH, thu hồi EtOH, dung môi còn lại được lắc với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-Hexan, Chloroform, Ethylacetat Thu hồi dung môi, sấy cắn đến khối lượng không đổi, cân cắn và tính hàm lượng theo dược liệu khô tuyệt đối

 Định tính cắn phân đoạn bằng các phản ứng đặc hiệu của các nhóm chất chính có trong dược liệu

 Phân tích cắn bằng SKLM: Khảo sát trên một số hệ dung môi, chọn hệ dung môi cho kết quả tách tốt nhất Dùng phần mềm videoscan và wincats để phân tích pic và tính Rf

2.3.3 Nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn

 Nguyên tắc: Thử tác dụng kháng khuẩn tiến hành theo phương pháp khuếch tán trên thạch Mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành các vòng

vô khuẩn Hoạt lực của chất thử được so sánh với chất chuẩn theo phương pháp thống kê

 Thuốc thử gồm cao lỏng chiết bằng dung môi ethanol 70% với 3 nồng độ 1:1, 1:2, 1:4

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

Hình1: Cây Thị ở Xã Tam Cường Hình2: Lá và cành mang lá Thị

Hình 3: Hạt Thị Hình 4: Quả Thị Hình 5: Dược liệu khô

3.1.1 Đặc điểm lá thị

Dược liệu tươi: Lá mọc so le, cuống ngắn có lông Phiến lá hình bầu dục, gốc

tù, đầu hơi nhọn, mép lá nguyên Gân phụ có 6 cặp, mảnh Cành và lá non có lông màu hung cả 2 mặt, lông mảnh và rụng khi lá già

Dược liệu khô: màu nâu đậm, nhăn nheo, phiến lá hình bầu dục, mép nguyên, dài 7 - 9 cm, cuống ngắn Dược liệu dai và nhiều xơ

3.1.2 Xác đinh tên khoa học của mẫu nghiên cứu

Qua các đặc điểm hình thái trên, kết hợp so sánh đối chiếu với khóa phân

loại, tài liệu chuyên sâu về thực vật, cùng với sự giúp đỡ của TS Nguyễn Quốc

Huy đã kết luận mẫu nghiên cứ thu hái ở xã Tam Cường, huyện Vĩnh Bảo, thành

phố Hải Phòng có tên khoa học là Diospyros decandra Lour, thuộc họ thị

chụp lại bằng máy ảnh kĩ thuật số

 Phần gân lá

Gân lá lồi cả 2 mặt trên và dưới, gân dưới lồi nhiều hơn Biểu bì trên (8) và biểu bì dưới (1) cấu tạo là một lớp tế bào tròn, tương đối nhỏ, xếp đều đặn Sát lớp biểu bì trên và dưới là lớp mô dày (2) gồm 4-5 hàng tế bào hình tròn, thành dày Mô mềm (3) gồm những tế bào hình trứng, thành mỏng, kích thước lớn, không đều nhau, xếp lộn xộn Nằm rải rác trong mô mềm có các tinh thể calci oxalat hình đa giác (7) Ở giữa gân lá là một bó libe-gỗ to hình cung bao bọc bởi vòng sợi (4) Libe (5) xếp thành vòng bao quanh gỗ, gỗ (6) cấu tạo bởi những mạch gỗ lớn xếp tập trung thành bó

 Phần phiến lá

Biểu bì trên (8') và biểu bì dưới (1') là một hàng tế bào nhỏ hình chữ nhật xếp đều đặn Dưới lớp biểu bì là hàng mô giậu (9) cấu tạo bởi một lớp tế bào hình chữ nhật xếp thẳng đứng vuông góc với bề mặt lá, mô mềm (3') là các tế bào thành mỏng, kích thước lớn