3.2.2.1. Xác định độ ẩm dược liệu
Lấy khoảng 1 g bột dược liệu để xác định độ ẩm. Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 1100C. Đổ dược liệu lên đĩa cân và trải lên mặt đĩa, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiện kết quả lên màn hình, sau 10 phút đọc kết quả. Độ ẩm của dược liệu là 8,72%.
3.2.2.2 Chiết xuất
Chuẩn bị bột dược liệu: lá được sấy khô ở 600C, tán thành bột thô đồng thời xác định hàm ẩm. Cân 100,0g bột dược liệu.
Dụng cụ chiết: Dùng bình gạn 500ml có khóa kín, được rửa sạch, sấy khô.
Dung môi chiết: ethanol 70%, n-hexan, chloroform, ethylacetat.
Chiết bằng ethanol 70% theo phương pháp ngâm lạnh. Làm ẩm dược liệu, để dược liệu trương nở trong 2 - 3 giờ, thêm dung môi cho ngập dược liệu, ngâm dược liệu trong 24 giờ. Rút dịch chiết và bổ sung dịch mới. Chiết cho đến khi dịch không còn màu xanh. Gộp các dịch chiết lại, cất thu hồi dung môi, dịch chiết nước còn lại để lạnh 12 giờ, đem li tâm loại bỏ tủa. Dịch sau li tâm được chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần.
Chiết phân đoạn n-hexan: Cho dịch chiết vào bình gạn, thêm n-hexan với lượng bằng 2/3 dịch chiết, lắc kĩ, để phân lớp, gạn lấy lớp n-hexan, thêm dung môi vào chiết tiếp, chiết nhiều lần cho đến khi lớp n-hexan không có màu. Gộp dịch chiết n-hexan, thu hồi dung môi để được cắn. Đem cắn đi sấy đến khi khối lượng không đổi. Cân cắn thu được.
Chiết các phân đoạn chloroform và ethylacetat tương tự như phân đoạn n- hexan, thu được cắn chlorform và ethylacetat.
Cắn thu được để tính hàm lượng các chất trong phân đoạn và định tính bằng sắc kí lớp mỏng. Công thức tính hàm lượng các chất trong phân đoạn:
=
× (100 − ) × 10
Trong đó: X: là hàm lượng chất (%) a: khối lượng cắn (g)
M: khối lượng dược liệu đem cân (g) x: độ ẩm của dược liệu (%)
Quy trình chiết xuất các phân đoạn được tóm tắt ở sơ đồ hình 9. Hàm lượng cắn các phân đoạn được ghi ở bảng 3.
Hình9: Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn
Chloroform
Dịch chiết chloroform Dịch chiết nước
Chloroform thu hồi
Cắn CHCl3
Ethyl acetat
Dịch chiết Ethyl acetat Dịch chiết nước
Erthyl acetat thu hồi
Cắn EtOAc
Dịch chiết ethanol
Dịch chiết nước
Dịch chiết N-hexan
Ethanol 70%
Ethanol thu hồi
n-hexan
Dịch chiết nước
n-hexan thu hồi
Bột dược liệu
Cắn n-hexan
- Để tủ lạnh qua đêm - Li tâm loại bỏ cắn
Bảng3: Hàm lượng cắn các phân đoạn theo dược liệu khô tuyệt đối
STT Phân đoạn Khối lượng cắn (g) % so với nguyên liệu khô
1 n-hexan 0,1676 0,18
2 Chloroform 1.1652 1,28
3 Ethyl acetat 2.0688 2,27
Nhận xét: Trong các phân đoạn dịch chiết là cây Thị, khối lượng kết tủa Ethyl acetat cao nhất (2,27%). Khối lượng phân đoạn n-hexan là ít nhất (0,18%).
3.2.2.3. Định tính cắn các phân đoạn bằng phản ứng hóa học.
Xác định sự có mặt của một số nhóm chất trong phân đoạn n-hexan, chloroform, ethyl acetat bằng phản ứng hóa học. Kết quả thể hiện ở bảng sau:
Bảng 4: Kết quả định tính một số nhóm chất trong 3 phân đoạn n-hexan, chloroform, ethylacetat STT Nhóm chất định tính Phản ứng định tính Cắn n- hexan Cắn chloroform Cắn ethylacetat 1 Flavonoid -P.ư Cyanidin -P.ư với NaOH -P.ư với dd FeCl35%
- - - + + + + + + 2 Tanin
-P.ư với dd FeCl3 5% -P.ư với dd chì acetat 10%
-P.ư với dd gelatin 1%
- - - + + + + + + 3 Đường
khử -P.ư với TT Fehling - + +
4 Alcaloid
-P.ư với TT Mayer -P.ư với TT
Bouchardat
-P.ư với Dragendroff
- - - + + + + + +
3.2.2.4. Định tính cắn các phân đoạn bằng SKLM
Chuẩn bị dịch chiết chấm sắc kí: Cắn thu được ở mỗi phân đoạn đem hòa tan với methanol để chấm sắc kí.
Chấm sắc kí trên bản mỏng Silicagel F254 (Merck), hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ.
Tiến hành SKLM trên các hệ dung môi thăm dò: Hệ I: Chloroform - Methanol (9:1)
Hệ II: Chloroform - Methanol (4:1) Hệ III: Chloroform - Ether (3:7) Hệ IV: Ether - Ethyl acetat (7:3)
Hệ V: Toluen - Ethyl acetat- Acid formic (6:2:1) Hệ VI: Toluen - Ethyl acetat- Acid formic (5:4:1)
Quan sát vết ở ánh sáng tử ngoại (UV254, UV366) và phun thuốc thử hiện màu. Kết quả cho thấy hệ V tách tốt nhất với cả dịch chiết 3 phân đoạn.
Cắn phân đoạn n - hexan
A B
Hình 10: Sắc kí đồ cắn dịch chiết n - hexan dưới UV254, UV366 với hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat - A.formic (6:2:1)
Nhận xét:
Tại UV254 quan sát được 7 vết, trong đó vết thứ 7 (Rf = 0,88) có màu rõ nhất Tại UV366 quan sát được 13 vết, trong đó các vết thứ 3, 5 có Rf lần lượt là
0,14; 0,26 cho huỳnh quang sáng rõ nhất.
Cắn phân đoạn Chloroform
Hình 11: Sắc kí đồ cắn dịch chiết Chloroform dưới UV254 với hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat - A.formic (6:2:1)
Nhận xét:
Tại UV254 các vết tách rõ, ta quan sát được 12 vết. Trong đó vết thứ 3, 6, 8, 12 có giá trị Rf lần lượt là 0,16; 0,42; 0,59; 0,88 có màu rõ nhất.
Hình 12: Sắc kí đồ cắn dịch chiết Chloroform dưới UV366 với hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat - A.formic (6:2:1)
Nhận xét:
Tại UV366: Quan sát được 13 vết, trong đó vết thứ 4, 6, 7, 8, 11 có giá trị Rf
lần lượt là 0,20; 0,31; 0,35; 0,39; 0,68 cho huỳnh quang sáng rõ nhất.
Cắn phân đoạn Ethylacetat
Hình 13: Sắc kí đồ cắn dịch chiết Ethylacetat UV254 với hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat - A.formic (6:2:1)
Nhận xét: Tại UV254 quan sát được 9 vết, trong đó vết thứ 1, 4, 6, 9 có giá trị Rf lần lượt là 0,05; 0,29; 0,42; 0,88 có màu rõ nhất.
Hình 14: Sắc kí đồ cắn dịch chiết Ethylacetat UV254 với hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat - A.formic (6:2:1)
Nhận xét: Tại UV366 quan sát được 11 vết, trong đó vết thứ 3, 5, 9 có giá trị Rf lần lượt là 0,18; 0,32; 0,67 cho huỳnh quang sáng rõ nhất.
Khai triển hệ sắc kí của 3 cắn trong cùng một điều kiện với cùng một hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat - A.formic (6:2:1)
Hình 15: Hệ sắc kí của 3 cắn n-hexan, ethylaceta, chloroform trong cùng một điều kiện với cùng một hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat - A.formic (6:2:1)
A: Sau khi nhúng thuốc thử vanilin/H2SO4 H: Cắn N-hexan B: Sắc kí đồ ở UV254 C: Cắn chloroform C: Sắc kí đồ ở UV366 E: Cắn ethylacetat Nhận xét:
Ở UV254 sắc kí đồ của cả 3 cắn có 3 vết tương đương với độ đậm nhạt khác nhau.
Ở UV366 sắc kí đồ của cả 3 cắn có 6 vết tương đương nhau. Sắc kí đồ ở cắn C và E có 10 vết tương đương.
Sau khi phun thuốc thử hiện màu sắc kí đồ của cả 3 cắn có 6 vết tương đương.