Qua các đặc điểm hình thái trên, kết hợp so sánh đối chiếu với khóa phân loại, tài liệu chuyên sâu về thực vật, cùng với sự giúp đỡ của TS. Nguyễn Quốc Huy đã kết luận mẫu nghiên cứ thu hái ở xã Tam Cường, huyện Vĩnh Bảo, thành phố Hải Phòng có tên khoa học là Diospyros decandra Lour, thuộc họ thị
Ebenaceae.
3.1.3. Đặc điểm vi phẫu lá cây thị
Tiến hành:
Cắt vi phẫu lá Thị bằng máy cắt cầm tay, tẩy và nhuộm theo phương pháp nhộm kép với các thuốc nhuộm xanh methylen, đỏ son phèn. Chọn mặt cắt ngang của lá mang đầy đủ đặc điểm dược liệu, vị trí cắt cách cuống lá 1/3 chiều dài của lá. Quan sát dưới kính hiển vi để mô tả đặc điểm vi phẫu và chụp lại bằng máy ảnh kĩ thuật số.
Phần gân lá
Gân lá lồi cả 2 mặt trên và dưới, gân dưới lồi nhiều hơn. Biểu bì trên (8) và biểu bì dưới (1) cấu tạo là một lớp tế bào tròn, tương đối nhỏ, xếp đều đặn. Sát lớp biểu bì trên và dưới là lớp mô dày (2) gồm 4-5 hàng tế bào hình tròn, thành dày. Mô mềm (3) gồm những tế bào hình trứng, thành mỏng, kích thước lớn, không đều nhau, xếp lộn xộn. Nằm rải rác trong mô mềm có các tinh thể calci oxalat hình đa giác (7). Ở giữa gân lá là một bó libe-gỗ to hình cung bao bọc bởi vòng sợi (4). Libe (5) xếp thành vòng bao quanh gỗ, gỗ (6) cấu tạo bởi những mạch gỗ lớn xếp tập trung thành bó.
Phần phiến lá
Biểu bì trên (8') và biểu bì dưới (1') là một hàng tế bào nhỏ hình chữ nhật xếp đều đặn. Dưới lớp biểu bì là hàng mô giậu (9) cấu tạo bởi một lớp tế bào hình chữ nhật xếp thẳng đứng vuông góc với bề mặt lá, mô mềm (3') là các tế bào thành mỏng, kích thước lớn.
Hình 6: Vi phẫu lá Thị
1, 1': Biểu bì dưới 6: Gỗ
2: Mô dày 7: tinh thể calci oxalat 3, 3': Mô mềm 8, 8': Biểu bì trên
4: Sợi 9: Mô giậu
5: Libe
3.1.2. Đặc điểm bột lá
Tiến hành:
Nghiên cứu đặc điểm bột: Lá cây thị được sấy khô, đem tán thành bột mịn bằng máy xay đã được làm sạch và sấy khô, rây qua rây tạo bột mịn, lên tiêu bản. Soi tìm đặc điểm của bột qua kính hiển vi và chụp lại bằng máy ảnh kĩ thuật số.
Bột màu xanh nhạt. Soi dưới kính hiển vi thấy các đặc điểm: mảnh mô mềm (1), lông che chở đơn bào (8), mảnh biểu bì mang lỗ khí và các mảnh mang màu (2), mảnh mạch xoắn (7), mảng mạch chứa mạch dẫn (5), tinh thể calci oxalat hình đa giác (4), mảnh mạch (1), mảnh mang màu (6), sợi (3), mảnh mô mềm chứa tinh thể calcioxalat (9).
Hình 8: Đặc điểm bột lá Thị
1: Mô mềm 6: Mảnh mang màu
2 Mảnh biểu bì mang lỗ khí 7: Mảnh mạch xoắn 3: sợi 8: Lông che chở đơn bào 4: Tinh thể calci oxalat 9: Mô mềm
3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học lá cây Thị
3.2.1. Định tính các nhóm chất
Định tính Glycosid tim
Cân 10g dược liệu đã tán nhỏ cho vào một bình nón dung tích 250ml. Thêm 100ml EtOH 25% rồi ngâm trong 24 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100ml. Thêm vào dịch chiết 3ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào 1 cốc có mỏ dung tích 100ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat.
Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml. Chiết glycosid tim bằng cách lắc với chloroform - EtOH (4:1) 2 lần, mỗi lần 8ml. Gạn lớp chloroform vào một cốc có mỏ đã được sấy khô. Gộp các dịch chiết chloroform và loại nước bằng natri sulfat khan.
Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô. Đặt các ống nghiệm lên giá và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô. Cắn thu được đem tiến hành làm các phản ứng định tính.
Phản ứng Liebermann - Burdchardat
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 45o. Cho từ từ thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng không xuất hiện vòng màu tím đỏ (Phản ứng âm tính)
Phản ứng Baljet
Pha thuốc thử Baljet: cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%, lắc đều.
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 0,5ml EtOH 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet cho đến khi xuất hiện màu đỏ da cam. So sánh màu với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim.
Kết quả: Ống thử có màu đỏ cam không đậm hơn ống chứng (phản ứng âm tính).
Phản ứng Legal
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 0,5ml EtOH 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều sẽ xuất hiện màu đỏ cam. So sánh màu với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim.
Kết quả: Ống thử có màu đỏ cam không đậm hơn ống chứng (Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Lá cây thị không chứa Glycosid tim.
Định tính Flavonoid
Cho 2g bột dược liệu vào bình nón có dung tích 50ml, thêm 20ml EtOH 90%. Đun cách thủy sôi 5 phút. Lọc nóng, dịch lọc thu được dùng để làm các phản ứng.
Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda)
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm một ít bột Magnesi kim loại (khoảng 10mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-5 giọt). Để yên một vài phút. Kết quả: Dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ (Phản ứng dương
tính). Phản ứng với kiềm
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%. Kết quả: xuất hiện kết tủa vàng.
Thêm 1ml nước cất
Kết quả: Tủa tan và màu vàng của dung dịch tăng lên (Phản ứng dương tính). Phản ứng với FeCl3
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết EtOH 90%. Thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5%
Kết quả: Xuất hiện kết tủa xanh đen (Phản ứng dương tính).
Nhận xét: Lá cây Thị có chứa Flavonoid.
Định tính Coumarin
Cho 2g bột dược liệu vào bình nón có dung tích 50ml, thêm 20ml EtOH 90%. Đun cách thủy sôi 5 phút. Lọc nóng, dịch lọc thu được dùng để làm các phản ứng.
Phản ứng mở đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết.
Ống 1: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, Ống 2: để nguyên.
Đun 2 ống nghiệm đến sôi. Để nguội rồi quan sát.
Ống 1: có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng Ống 2: trong
Thêm vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều rồi quan sát. Ống 1: trong suốt
Ống 2: có tủa đục
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại đục như ống 2 Kết quả: phản ứng âm tính.
Phản ứng diazo hóa
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm vào đó 2ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội. Nhỏ vài giọt thuốc thử Diazo Kết quả: Không có tủa màu đỏ gạch (phản ứng âm tính)
Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm (phản ứng chuyển từ đồng phân dạng cis sang đồng phân dạng trans dưới tác dụng của tia tử ngoại).
Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm. Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5%. Sấy nhẹ, che một phần diện tích dịch chiết lên giấy lọc bằng một đồng xu
kim loại rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát huỳnh quang dưới đèn tử ngoại trong một vài phút.
Kết quả: phần không bị che không sáng hơn phần bị che (phản ứng âm tính). Nhận xét: Lá cây Thị không chứa Coumarin.
Định tính tannin
Lấy khoảng 1g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc, dịch lọc dùng để định tính. Phản ứng với gelatin 1%
Lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%
Kết quả: thấy xuất hiện kết tủa bông trắng (phản ứng dương tính). Phản ứng với chì acetat 10%
Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% (TT).
Kết quả: thấy xuất hiện kết tủa bông (phản ứng dương tính) Phản ứng với FeCl3 5%
Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% (TT) Kết quả: Thấy xuất hiện tủa xanh đen (phản ứng dương tính)
Nhận xét: Lá cây Thị chứa tannin.
Định tính Saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt
Cho 0,5g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất. Lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc ống nghiệm, để yên.
Kết quả: Cột bọt không bền sau khi ngưng lắc trong 15 phút (phản ứng âm tính).
Phản ứng Salkowski:
Cho vào ống nghiệm to 2g dược liệu, thêm vào 20ml EtOH 90%, đun sôi cách thủy. Lọc lấy dịch lọc cho vào ống nghiệm khác, để nghiêng ống nghiệm 450, cho từ từ theo thành ống nghiệm 1 - 2 giọt H2SO4 đặc.
Kết quả: Ở mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng không xuất hiện vòng đỏ nâu (phản ứng âm tính).
Nhận xét: Lá cây thị không chứa Saponin.
Định tính Alcaloid
Cân 0,5g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 15ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun đến sôi, để nguội, lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 125ml. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đệm pH=9 - 10. Chiết alcaloid base bằng cloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5ml). Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng Natrisulfat khan, dịch chiết chloroform đem làm phản ứng định tính. Lấy một phần dịch chiết chloroform đã được chuẩn bị ở trên đem lắc với acid sulfuric 1N hai lần, mỗi lần 5ml. Gộp các dịch chiết nước. Chia đều vào 4 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:
Ống 1: thuốc thử Mayer
Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng (phản ứng dương tính)
Ống 2: thuốc thử Bouchardat
Kết quả: Xuất hiện tủa nâu (phản ứng dương tính).
Ống 3: thuốc thử Dragendorff
Kết quả: Xuất hiện tủa vàng (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Lá cây Thị có chứa Alcaloid
Định tính Anthranoid
Phản ứng Borntrager: Định tính anthranoid toàn phần
Lấy 3 g bột dược liệu cho vào bình nón 100ml. Thêm 40ml dung dịch H2SO4 1N. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến soi khoảng 15 phút. Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc vào bình gạn dung tích 125ml. Làm nguội dịch lọc, thêm 5ml chloroform, lắc nhẹ. Gạn bỏ lớp nước, giữ lớp chloroform để làm phản ứng.
Lấy 1ml dịch chiết chloroform, cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1 ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ.
Kết quả: Lớp nước không xuất hiện màu đỏ. (Phản ứng âm tính). Vi thăng hoa:
Rắc một ít bột dược liệu thành lớp mỏng trong một nắp chia bằng nhôm, đốt nhẹ trên đèn cồn để loại nước. Sau đó đậy nắp nhôm bằng một lam kính, bên trên có miếng bông đã thấm nước, tiếp tục đun nóng trong khoảng 5 - 10 phút. Lấy lam kính ra để nguội, soi dưới kính hiển vi.
Kết quả: không thấy tinh thể hình kim (Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Lá cây Thị không chứa Anthranoid.
Định tính acid hữu cơ, acid amin, đường khử, polysaccarid
Cho 10g bột dược liệu vào bình nón, thêm 50ml nước cất. Đun sôi 10 phút trên ngọn lửa đèn cồn, lọc bằng giấy lọc gấp nếp, dịch lọc để làm các phản ứng:
Định tính acid hữu cơ
Lấy khoảng 2ml dịch chiết, thêm vào dịch lọc một ít tinh thể Na2CO3
Kết quả: Không thấy có bọt khí bay lên (phản ứng âm tính)
Nhận xét: Lá cây Thị không chứa acid hữu cơ
Định tính acid amin
Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm khác, thêm vào 3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun sôi cách thủy 10 phút.
Kết quả: không thấy dung dịch chuyển sang màu tím. (phản ứng âm tính)
Nhận xét: Lá cây Thi không chứa acid amin
Định tính đường khử
Cho 2ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 3 giọt thuốc thử Fehling A và 3 giọt thuốc thử Fehling B. Đun sôi cách thủy 10 phút.
Kết quả: Có tủa đỏ gạch ở dưới đáy ống nghiệm.(phản ứng dương tính)
Nhận xét: Lá cây Thị có chứa đường khử.
Định tính Polysaccharid
Lấy 10 ml dịch chiết cho vào 2 ống nghiệm: Ống 1: 2ml dịch chiết + 5 giọt dung dịch Lugol Ống 2: 2m nước cất + 5 giọt dung dịch Lugol
Nhận xét: Lá cây Thị không chứa Polysaccharid
Định tính sterol, chất béo, caroten
Ngâm 10g bột dược liệu trong bình nón bằng ether dầu hỏa, để qua đêm. Lọc thu được dịch lọc để làm các phản ứng.
Định tính chất béo
Nhỏ 2 giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hết dung môi.
Kết quả: Không có vết đục mờ trên giấy lọc (phản ứng âm tính)
Nhận xét: Lá cây Thị không chứa chất béo
Định tính sterol (Phản ứng Liberman)
Lấy 1ml dịch chiết ether dầu hỏa, cho vào ống nghiệm, bốc hơi dung môi đến khô. Thêm vào ống nghiệm 1ml anhydridacetic, lắc kĩ. Để nghiêng 45o, Nhỏ từ từ acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm.
Kết quả: không thấy xuất hiện vòng màu tím đỏ ở mặt phân cách
Nhận xét: Lá cây thị không chứa Sterol.
Định tính caroten
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết ether dầu hỏa, bốc hơi cách thủy đến cắn. Thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn.
Kết quả: không thấy xuất hiện màu xanh.
Nhận xét: Lá cây thị không chứa caroten.
Kết quả định tính các nhóm chất trong lá cây Thị được trình bày ở bảng:
Bảng 2: Kết quả định tính các nhóm chất trong lá Thị
STT Nhóm chất Tên phản ứng Kết quả Kết luận
1 Alcaloid Phản ứng với TT Mayer (+) Không có Phản ứng với TT Dragendorff (+) Phản ứng với TT Bouchadart (+) 2 Glycosid tim Phản ứng Liebermann- Budchardt (-) Không có Phản ứng Legal (-)
Phản ứng Baljet (-)
3 Flavonoid
Phản ứng với dung dịch kiềm (+)
Có Phản ứng với dd FeCl3 5% (+)
Phản ứng Cyanidin (+)
4 Anthranoid Phản ứng Borntraeger (-) Không có
5 Courmarin
Phản ứng mở, đóng vòng Lacton (-) Không Có
Quan sát huỳnh quang (-)
6 Saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt (-) Không có
7 Tanin
Phản ứng với dd FeCl3 5% (+ )
Có Phản ứng với dd Gelatin 1% (+)
Phản ứng với dd chì acetat 10% (+)
8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 (-) Không có
9 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin (-) Không có
10 Đường khử Phản ứng với TT Fehling (+) Có
11 Polysaccharid Phản ứng với TT Lugol (-) Không có
12 Chất béo Tạo vết mờ trên giấy (-) Không có
13 Sterol Phản ứng Liebermann (-) Không có
14 Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc (-) Không có
Từ kết quả định tính sơ bộ bằng phản ứng hóa học trình bày ở bảng cho thấy lá cây Thi chứa các nhóm chất: Flavonoid, alcaloid, tanin, đường khử.