a. Chủng vi sinh vật kiểm định do bộ môn Vi sinh - Sinh học Trường đại học Dược
Hà Nội cung cấp:
b. Môi trường thử nghiệm
- Môi trường canh thang nuôi cấy vi khuẩn kiểm định. - Môi trường thạch thường.
c. Tiến hành
Chuẩn bị mẫu thử:
Mẫu thử dạng cao lỏng 1:1 được đánh số 1
Mẫu thử dạng cao lỏng 1:2 được đánh số 2
Mẫu thử dạng cao lỏng 1:3 được đánh số 3
Kháng sinh chuẩn đối với vi khuẩn Gr(+) thì sử dụng dung dịch Benzathin Penicillin G: 28,8 IU/ml, với các vi khuẩn Gr(-) thì sử dụng ding dịch Gentamicin 20 µg Gentamicin base/ml.
Các khoanh giấy vô trùng và đã được sấy khô được tẩm 3 lần với dung dịch mẫu thử, sau mỗi lần tẩm các khoanh giấy lọc có chứa mẫu thử đều được sấy ở nhiệt độ 500C đến khô hết dung môi.
Chuẩn bị môi trường và cấy vi sinh vật kiểm định.
Vi sinh vật kiểm định được cấy vào môi trường canh thang, rồi được nuôi cấy và cho phát triển trong tủ ấm 370C trong thời gian từ 18-24 giờ đến nồng độ 107 tế bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn).
Môi trường thạch thường vô trùng (tiệt trùng 1180C/30 phút được làm nguội 40-500C và được cấy giống vi sinh vật kiểm định với tỷ lệ 2,5 ml/100ml lắc tròn để vi sinh vật kiểm định phân tán đều trong môi
trường thạch thường, rồi đổ vào đĩa petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa và để cho thạch đông lại.
Thử tính kháng khuẩn
Mỗi vi khuẩn làm trên 5 đĩa petri
Đặt khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc đã được tẩm chất thử và xử lí như trên, được đặt trên bề mặt môi trường thạch thường, chứa vi sinh vật kiểm định theo sơ đồ sau:
Hình 16: Sơ đồ đặt mẫu nghiên cứu thử tác dụng kháng khuẩn
Trong đó:
K: Khoanh giấy tẩm kháng sinh
1: Khoanh giấy tẩm dịch chiết cao lỏng 1:1 lá Thị 2: Khoanh giấy tẩm dịch chiết cao lỏng 1:2 lá Thị 3: Khoanh giấy tẩm dịch chiết cao lỏng 1:3 lá Thị
Sau khi cấy, ủ các đĩa petri có mẫu thử được đặt như trên trong tủ ấm có nhiệt độ 370C trong 18-24 giờ, khi đủ thời gian lấy ra đọc kết quả, đo đường kính vòng vô khuẩn nếu có ( thước kẹp panmer đo độ chính xác 0,02mm).
Đánh giá kết quả:
Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Panmer có độ chính xác đến 0,02 mm. Đánh giá đường kính vòng vô khuẩn được xử lí theo công thức:
1
1
3 2
2 3
=∑ s= ∑ ( )
D: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn Di: Đường kính vòng vô khuẩn thứ i
s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n: Số thí nghiệm làm song song
3.3.2. Kết quả
Bảng 5: Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết cao lỏng lá Thị
STT
Mẫu kiểm định
Vi sinh vật kiểm định- Đường kính vòng vô khuẩn [mm] (D,s) EC Pro Shi Sal Pseu SA Bp Bs Bc Sar
1 Pen - - - 11.90 0.10 11.55 0.55 12.05 0.05 11.49 0.09 23.05 0.05 2 Gen 15.90 0.10 14.80 0.30 14.9 0.10 11.30 0.10 10.75 0.25 - - - - - 3 Cao lỏng 1:1 - 6.49 0.07 7.12 0.11 10.94 1.05 9.75 0.31 - - - - - 4 Cao lỏng 1:2 - - - 8.53 0.24 5 Cao lỏng 1:3 - - - - Chú thích Gr (-) Gr (+)
EC: Escherichia coli ATCC25922 Sta: Staphylococcus aureus ATCC 1128
Shi: Shigella flexneri DT 112 Bs: Bacillus subtilis ATCC 6633
Sal: Salmonella typhi DT 220 Bc: Bacillus cereus ATCC 9946
Pseu: Pseudomonas aeruginosa VM201 Sar: Sarcina lutea ATCC 1128
Nhận xét:
Trong 3 mẫu thử, chỉ có mẫu 1 có khả năng kháng khuẩn và chỉ tác dụng trên vi khuẩn Gr(-), trong đó có Pseudomonas aeruginosa.
3.4. Bàn luận
3.4.1. Về thực vật
Mẫu nghiên cứu là lá cây Thị được thu hái tại huyện Vĩnh Bảo- Hải Phòng, được TS. Nguyễn Quốc Huy xác nhận tên khoa học là Diospyros decandra Lour, họ thị Ebenaceae. Đề tài đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm bột và vi phẫu lá cây Thị. Lá thị khi còn non có lông màu hung ở cả 2 mặt lá và gân chính, nhưng lông mảnh và rất dễ rụng khi vuốt nhẹ, khi lá trưởng thành thì lông không còn nữa, chúng tôi tiến hành cắt vi phẫu trên lá cây đã trưởng thành nên không thấy lông ở vi phẫu. Tuy nhiên cuống lá thị trưởng thành có lông nên trong bột lá thị vẫn chứa lông che chở đơn bào.
3.4.2. Về hóa học
Cắn phân đoạn n-hexan có màu xanh nhạt, khối lượng rất nhỏ. Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học đều cho kết quả âm tính với các nhóm chất. Kết quả sắc kí lớp mỏng cho thấy phân đoạn này có nhiều chlorophyll (có huỳnh quang đỏ ở bước sóng tử ngoại λ=366 nm), các vết còn lại rất mờ. Có thể hàm lượng các thành phần khác trong dịch chiết n-hexan rất thấp nên có kết quả âm tính với các phản ứng hóa học hoặc do chlorophyll làm che mờ các phản ứng hóa học. Hơn nữa, flavonoid trong dược liệu tồn tại ở cả hai dạng tự do và kết hợp. Dạng tự do tan trong dung môi kém phân cực, dạng kết hợp tan trong dung môi phân cực. Kết quả định tính cắn n-hexan có thể giải thích là dạng tự do trong dược liệu thấp nên lượng flavonoid trong cắn n-hexan rất thấp nên cho kết quả âm tính.
Cắn phân đoạn chloroform có màu hơi vàng. Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học đều dương tính với các nhóm chất đã được khảo sát trong dịch chiết toàn phần. Sắc kí lớp mỏng cho kết quả tách tốt với hệ dụng môi Toluen-
Ethylacetat-Acid formic (6:2:1). Các vết tách nhau và cho màu rõ và đậm. Hiện màu bằng thuốc thử valinin/H2SO4 cho dải nhiều màu.
Cắn phân đoạn ethylacetat có màu vàng đậm, khối lượng cắn lớn nhất. Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học đều dương tính với các nhóm chất đã được khảo sát trong dịch chiết toàn phần. Đặc biệt cho hiện tượng rất rõ với phản ứng Cyanidin (phản ứng đặc trưng của nhóm chất Flavonoid). Sắc kí lớp mỏng cho kết quả tách tốt, các vết tách nhau và cho màu khá rõ. Hiện màu bằng thuốc thử dd KOH cho các vệt màu vàng đậm (có thể là của flavonoid). Có thể trong phân đoạn này chứa nhiều flavonoid.
3.4.3. Về tác dụng kháng khuẩn
Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn cho thấy dịch chiết cao lỏng 1:1 của lá Thị có khả năng kháng khuẩn đối với một số vi khuẩn, tuy nhiên tác dụng kháng khuẩn còn yếu. Dịch chiết cao lỏng 1:2 và 1:4 thì không cho kết quả kháng khuẩn với bất kì chủng vi khuẩn thử nghiệm nào. Điều này có thể là do hàm lượng các chất có tác dụng kháng khuẩn trong dịch chiết cao lỏng quá ít nên chưa tạo ra các vòng kháng khuẩn. Kiến nghị nên thử tác dụng kháng khuẩn với dịch chiết từng phân đoạn chloroform và ethylacetat.
Các kết quả của đề tài chỉ là kết quả bước đầu, tạo cơ sở cho nhiều nghiên cứu sâu hơn về lá cây Thị, phục vụ cho lĩnh vực kiểm nghiệm sau này.
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
Sau khi thực hiện đề tài "Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa
học và tác dụng kháng khuẩn của vị thuốc lá cây thị" chúng tôi có các kết luận
sau:
4.1.1. Về thực vật
Đã mô tả hình thái của mẫu nghiên cứu và xác định tên khoa học của cây là
Diospyros decandra Lour, họ Thị (Ebenaceae).
Đã mô tả được đặc điểm vi phẫu và bột lá cây Thị.
4.1.2. Về hóa học
Định lượng cắn các phân đoạn theo dược liệu khô tuyệt đối.
Bằng các phản ứng hóa học đã xác định được lá cây Thị có chứa các thành phần là Flavonoid, Tanin, alcaloid, đường khử. Trong phân đoạn Chloroform và ethylacetat của lá cây Thị có chứa Flavonoid, tanin, alcaloid, đường khử.
Bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng đã xác định được cả 3 phân đoạn dịch chiết n-hexan, chloroform, ethylacetat đều cho kết quả tách tốt với hệ dung môi Toluen-ethylacetat-acid formic (6:2:1).
Phân đoạn n-hexan cho 7 vết ở UV254, 13 vết ở UV366.
Phân đoạn chloroform cho 12 vết ở UV254, 13 vết ở UV366.
Phân đoạn ethylacetat cho 9 vết ở UV254, 11 vết ở UV366.
4.1.3. Về tác dụng kháng khuẩn
Dịch chiết cao 1:1 có tác dụng kháng khuẩn trên một số chủng vi khuẩn Gr-.
4.2. Kiến nghị.
Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để khẳng định khả năng sử dụng của lá thị như:
Thử một số tác dụng sinh học liên quan đến công dụng dùng trong dân gian của lá thị.
Xác định thành phần, hàm lượng và phân lập các flavonoid trong lá thị để có hướng khai thác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1. Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật hạt
kín ở Việt Nam. NXB Nông Nghiệp, trang 28.
2. Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, NXB Y học.
3. Bộ môn dược liệu (2005), Thực tập dược liệu, Trung tâm thông tin thư viện trường Đại học Dược Hà Nội.
4. Bộ môn Dược liệu - Trường đại học Dược Hà Nội (2006), Bài giảng dược
liệu tập I, II, NXB Y học.
5. Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội (2012). Thực tập thực vật
và nhận biết cây thuốc, Trung tâm thông tin - Thư viện trường đại học Dược
Hà Nội.
6. Võ Văn Chi , Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học và kĩ thuật, tập I, trang 974.
7. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc việt nam, NXBY học.
8. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB trẻ, Thành phố Hồ Chí Minh, quyển I, trang 641.
9. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, trang 424.
10.Nguyễn Viết Thân (2003), Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi, NXB Khoa học & Kĩ thuật Hà Nội.
11.Hợp Trần, Bội Quỳnh Nguyễn (1993), Cây gỗ kinh tế ở Việt Nam, NXB Nông Nghiệp, trang 168.
12.Viện dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và kĩ thuật, tập II. trang 8852.
Tiếng anh
13.M.Maridass (2008), "Phytochemicals From Genus Diospyros (L.) and their Biological Activities", Ethnobotanical Leaflets,(12: 231-244), 1-9.
14.Parichat et al (2006), " Novel 24-nor-, 24-nor-2,3-seco-, and 3,24-dinor-2,4- seco-ursane triterpenes from Diospyros decandra: evidences for ring A