Đậu thị thu hà nghiên cứu cải tiến quy trình chiết xuất apigenin từ cúc hoa vàng sử dụng dung môi eutectic khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI oOo ĐẬU THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT APIGENIN TỪ CÚC HOA VÀNG SỬ DỤNG DUNG MÔI EUTECTIC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI oOo ĐẬU THỊ THU HÀ Mã sinh viên: 1801157 NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT APIGENIN TỪ CÚC HOA VÀNG SỬ DỤNG DUNG MƠI EUTECTIC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thu Hằng ThS Nguyễn Văn Phương Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu Khoa Dược liệu - DHCT HÀ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Trước trình bày phần nội dung đề tài khóa luận mình, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người suốt thời gian qua hỗ trợ, động viên giúp đỡ tơi hồn thành cách tốt khóa luận tốt nghiệp Trước tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến với người thầy, người cô đáng kính tơi Với tất lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Thu Hằng - Trưởng môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu làm khóa luận môn Dược liệu Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Văn Phương - Giảng viên môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành khóa luận có dẫn hữu ích, kịp thời giúp tơi vượt qua lúc khó khăn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu tồn thể thầy giáo Trường Đại học Dược Hà Nội truyền đạt kiến thức quý báu suốt thời gian học tập trường Tơi xin cảm ơn hỗ trợ nhiệt tình từ thầy cô môn Dược liệu, anh chị, bạn, em sinh viên nghiên cứu khoa học môn Cuối xin gửi lời cảm ơn thân thương tới bố mẹ, gia đình, bạn bè người ln động viên, khích lệ chỗ dựa tinh thần vững cho sống suốt trình thực khóa luận Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân có hạn, khóa luận tốt nghiệp cịn nhiều điều thiếu sót Tơi mong nhận góp ý thầy cơ, bạn bè để khóa luận hồn thiện Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Đậu Thị Thu Hà MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Cúc hoa vàng 1.1.1 Thông tin chung 1.1.2 Thành phần hóa học 1.2 Tổng quan quy trình chiết xuất flavonoid từ Cúc hoa vàng 1.2.1 Quy trình tác giả Nguyễn Thu Hằng cộng 1.2.2 Quy trình tác giả Na Guo cộng 10 1.2.3 Quy trình tác giả Leqin Ke cộng 10 1.3 Phương pháp thủy phân flavonoid glycosid 10 1.3.1 Các phương pháp thủy phân flavonoid glycosid 10 1.3.2 Phương pháp sử dụng enzym dung môi eutectic 11 1.4 Tổng quan enzym 𝛃-glucosidase CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 12 16 16 2.1.1 Nguyên liệu 16 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Quy trình dự kiến 18 2.3.2 Phương pháp định lượng apigenin dịch chiết Cúc hoa vàng 19 2.3.3 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân apigenin glycosid từ Cúc hoa vàng 20 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Kết khảo sát lựa chọn hệ dung môi eutectic tham gia trình chiết xuất 23 3.2 Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất 23 3.2.1 Khảo sát nhiệt độ chiết xuất 23 3.2.2 Khảo sát thời gian chiết xuất 24 3.2.3 Khảo sát pH dịch chiết đậu nành 25 3.2.4 Khảo sát thể tích dịch chiết đậu nành tham gia trình thủy phân 26 3.3 Kết khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu cho trình chiết xuất 28 3.3.1 Thiết kế thí nghiệm 28 3.3.2 Xây dựng mơ hình 30 3.3.3 Đánh giá mơ hình 32 3.3.4 Lựa chọn điều kiện tối ưu biến đầu vào 34 3.3.5 Thẩm định mô hình 34 3.4 Bàn luận 35 3.4.1 Về ý nghĩa việc sử dụng dung môi eutectic (DES) chiết xuất apigenin từ Cúc hoa vàng 35 3.4.2 Về ý nghĩa việc kết hợp dung môi eutectic enzym β-glucosidase đậu nành chiết xuất apigenin từ Cúc hoa vàng 36 3.4.3 Về kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng lựa chọn điều kiện tối ưu cho quy trình chiết xuất apigenin từ Cúc hoa vàng 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt DES Deep eutectic solvent Dung môi eutectic HBD Hydrogen bond donor Chất cho liên kết hydro HBA Hydrogen bond acceptor Chất nhận liên kết hydro ANOVA Analysis of variance Phân tích phương sai XO Xanthine oxidase Xanthin oxidase HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao MAE Microwave-assisted extraction Chiết xuất có hỗ trợ vi sóng RDE Rutin degrading enzyme Enzym thủy phân rutin OFAT One factor at a time Phương pháp thay đổi yếu tố RSM Response surface methodology Phương pháp bề mặt đáp ứng Glc Glucose Glucose Rha Rhamnose Rhamnose Glu Gluconic acid Acid gluconic Gal Galactose Galactose Ac Acetyl Acetyl RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn STT Số thứ tự TB Trung bình DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Cấu trúc hóa học số flavonoid Cúc hoa vàng Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 2.2 Các thiết bị dụng cụ sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 3.1 Kết mã hóa biến đầu vào 28 Bảng 3.2 Thiết kế thí nghiệm kết thực nghiệm 29 Bảng 3.3 Kết phân tích ANOVA hàm lượng apigenin dịch chiết Cúc hoa vàng (mg/g) 32 Bảng 3.4 Một số thông số thống kê đánh giá chất lượng mơ hình 33 Bảng 3.5 Kết kiểm tra khả dự đoán mơ hình điều kiện tối ưu 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Khung cấu trúc flavonoid có dược liệu Cúc hoa vàng Hình 1.2 Cấu trúc hóa học dẫn chất apigenin có Cúc hoa vàng Hình 1.3 Một số chất enzym β-Glucosidase 13 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 19 Hình 3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ chiết xuất 24 Hình 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết xuất 25 Hình 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng pH dịch chiết đậu nành 26 Hình 3.4 Khảo sát ảnh hưởng thể tích dịch chiết đậu nành 27 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc hàm lượng apigenin dịch chiết Cúc hoa vàng vào điều kiện chiết xuất 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Cụm hoa Cúc hoa vàng (Chrysanthemum indicum L.) dược liệu phổ biến, sử dụng để chữa bệnh mắt, đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, đinh nhọt hỗ trợ điều trị bệnh lý tăng huyết áp, bệnh gút, béo phì [2], [4], [10] Nhiều tác dụng dược liệu chứng minh mô hình dược lý chống oxy hóa, chống viêm, kháng khuẩn hay bảo vệ gan [14] Một tác dụng bật Cúc hoa vàng nghiên cứu nhiều khả ức chế enzym xanthin oxidase (XO) [8], [35], [39], [50] Xanthin oxidase enzym xúc tác q trình oxy hóa xanthin tạo thành acid uric thể Ức chế hoạt động enzym làm giảm nồng độ acid uric máu, từ giúp phòng ngừa điều trị bệnh gút [35] Các nghiên cứu rằng, thành phần hóa học liên quan đến tác dụng ức chế XO Cúc hoa vàng hợp chất flavonoid, đó, bật apigenin [50] Vì vậy, việc nghiên cứu chiết xuất flavonoid nói chung apigenin nói riêng từ dược liệu Cúc hoa vàng để nghiên cứu phát triển sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh gút theo chế ức chế enzym xanthin oxidase cần thiết Trong năm gần đây, nghiên cứu chiết xuất apigenin từ dược liệu tăng lên đáng kể Trong phần lớn nghiên cứu này, dung môi hữu thông thường methanol, ethanol, hexan dung mơi sử dụng Mặc dù có hiệu chiết xuất cao khả hòa tan chọn lọc dung mơi cịn tồn số nhược điểm dễ cháy nổ, gây ô nhiễm môi trường ảnh hưởng tới sức khỏe người [41] Do đó, việc nghiên cứu sử dụng dung mơi xanh để chiết xuất hợp chất có hoạt tính sinh học từ dược liệu nói chung apigenin từ Cúc hoa vàng nói riêng nhằm giảm thiểu ảnh hưởng môi trường sức khỏe người ngày quan tâm [51] Trong nghiên cứu tiến hành năm 2022, tác giả Nguyễn Thu Hằng cộng tiến hành ứng dụng dung môi eutectic (DES) để chiết xuất apigenin luteolin từ Cúc hoa vàng [13] Đây coi hệ dung môi xanh hệ mới, không độc hại, thân thiện với môi trường, với hiệu chiết xuất cao dung mơi hữu thơng thường Để tiếp tục hồn thiện quy trình chiết xuất trên, đề tài tốt nghiệp “Nghiên cứu cải tiến quy trình chiết xuất apigenin từ Cúc hoa vàng sử dụng dung môi eutectic” thực với mục tiêu: Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân tạo thành apigenin từ dịch chiết Cúc hoa vàng Tối ưu hóa q trình q trình thủy phân tạo thành apigenin từ dịch chiết Cúc hoa vàng Bảng 3.5 Kết kiểm tra khả dự đốn mơ hình điều kiện tối ưu Hàm lượng Apigenin (mg/g) Giá trị thực nghiệm (n=3) 3,3795 ± 0,0310 Giá trị dự đốn 3,4049 Độ xác 99,25% Nhận xét: Quy trình chiết xuất có tính ổn định cao với giá trị RSD hàm lượng apigenin dịch chiết nhỏ 5% Bên cạnh mơ hình thể khả dự đốn xác với sai lệch kết thực nghiệm dự đoán nhỏ 1% 3.4 Bàn luận Đây nghiên cứu sử dụng enzym từ đậu nành kết hợp với dung môi eutectic để chiết xuất dịch chiết giàu apigenin từ Cúc hoa vàng Kết nghiên cứu sở để tiếp tục nâng cấp quy mô quy trình cải tiến khác nhằm phát triển sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh gút từ dược liệu Cúc hoa vàng 3.4.1 Về ý nghĩa việc sử dụng dung môi eutectic (DES) chiết xuất apigenin từ Cúc hoa vàng Dung môi hữu sử dụng rộng rãi chiết xuất hoạt chất polyphenol, flavonoid, terpenoid với ưu điểm rẻ tiền, dễ kiếm, khả chiết xuất tốt Tuy nhiên, ngày nhiều nghiên cứu tập trung khai thác dung môi thay dung môi hữu chiết xuất dung môi dễ cháy nổ, dễ bay hơi, làm ảnh hưởng đến chất lượng dịch chiết ô nhiễm môi trường [78] Bên cạnh dung môi hữu cơ, nước sử dụng rộng rãi chiết xuất tính an tồn, kinh tế thân thiện với mơi trường [79] Nhiệt độ sôi nước cao (100°C) nên hạn chế thất q trình chiết xuất, nhiên hàm lượng hoạt chất dịch chiết nước thường khơng cao nước khơng hịa tan hồn tồn chất khơng phân cực phân cực liệu Do đó, để khắc phục nhược điểm dung môi nước dung môi hữu cơ, ngày có nhiều nghiên cứu ứng dụng dung môi xanh vào chiết xuất, đặc biệt chiết xuất dược liệu [13], [23] Hiện nay, dung môi eutectic (DES) thu hút 35 nhiều quan tâm tính xanh, thân thiện với mơi trường giải pháp thay xanh cho dung môi truyền thống Đây coi hệ dung môi xanh hệ mới, không độc hại, thân thiện với môi trường, đem lại hiệu chiết cao dung môi hữu thông thường Không làm tăng hiệu suất chiết xuất, số DES chứng minh có khả làm tăng độ ổn định hợp chất phenolic dịch chiết tốt so với dung môi khác Độ nhớt cao DES giúp cho hoạt chất ổn định dung môi Tuy nhiên, điều gây khó khăn q trình phân lập hợp chất khơng bay dịch chiết Ngoài ra, độ nhớt cao DES yếu tố gây cản trở trình chiết xuất Độ nhớt cao làm giảm khả thấm dung môi vào dược liệu, gây trở ngại trình chuyển khối dẫn đến giảm hiệu suất chiết, kéo dài thời gian chiết xuất gây khó khăn trình xử lý sau chiết [97] Tuy nhiên, giải vấn đề cách tăng nhiệt độ chiết xuất thêm lượng nước thích hợp vào dung môi eutectic [97] 3.4.2 Về ý nghĩa việc kết hợp dung môi eutectic enzym β-glucosidase đậu nành chiết xuất apigenin từ Cúc hoa vàng Việc ứng dụng dung môi eutectic chiết xuất apigenin từ dược liệu nói chung, Cúc hoa vàng nói riêng cần thiết Từ điều chế chế phẩm thuốc dược liệu điều trị gút hiệu khắc phục hạn chế tính an tồn thuốc có nguồn gốc hóa dược Tuy nhiên, apigenin dược liệu Cúc hoa vàng có dạng liên kết với glycosid, chất có nhược điểm sinh khả dụng thấp có tính phân cực cao khả hấp thu thể người Nhiều nghiên cứu việc chuyển hóa dạng O-glycosid thành dạng aglycon làm tăng sinh khả dụng hoạt chất Các nghiên cứu gần báo cáo việc xử lý dịch chiết flavonoid enzym làm tăng hàm lượng thành phần hoạt tính sinh học khác [11], [15] Do đó, việc sử dụng enzym để loại bỏ gốc đường khỏi apigenin-glycosid giúp thu dịch chiết có hàm lượng cao hoạt chất apigenin β-glucosidase enzym thủy phân liên kết glycosid để giải phóng gốc glucosyl cuối phân tử glycosid oligosaccharid β-glucosidase tác dụng dựa chế phân tách liên kết β-glycosid hai nhiều phân tử glucose phần đường phần đường (aglycon) [65], [72] Enzym có mặt tất loại sinh vật điều chế từ nhiều nguồn khác Trong đó, 36 nguồn β-glucosidase sử nhiều từ thực vật đậu nành, hạt hạnh nhân, hạt mơ, chè,… Do đó, đề tài nghiên cứu sử dụng dung môi eutectic kết hợp với enzym βglucosidase có đậu nành để cải tiến quy trình chiết xuất dịch chiết với hàm lượng cao hoạt chất apigenin từ dược liệu Cúc hoa vàng Trong nghiên cứu này, DES có thành phần cholin propylen glycol tỷ lệ 1:2 với hàm lượng nước 20% enzym β-glucosidase có đậu nành sử dụng để tham gia vào quy trình chiết xuất Các điều kiện ảnh hưởng đến trình chiết xuất khảo sát tối ưu hóa Các phương pháp thay đổi yếu tố (OFAT) bề mặt đáp ứng (RSM) áp dụng để xác định điều kiện chiết xuất tối ưu cách nhanh chóng, xác, giúp rút ngắn đáng kể thời gian khảo sát tiết kiệm chi phí cho nghiên cứu Kết nghiên cứu cho thấy rằng, việc sử dụng hệ dung môi eutectic kết hợp với enzym β-glucosidase đậu nành làm tăng hàm lượng apigenin dịch chiết Cúc hoa vàng lên nhiều lần so với việc sử dụng dung môi eutectic riêng lẻ [13] Nghiên cứu cho thấy, việc lựa chọn thành phần tỉ lệ hệ dung môi eutectic enzym β-glucosidase đậu nành vô quan trọng, định phần lớn đến khả chiết xuất thủy phân apigenin-glycosid thành apigenin 3.4.3 Về kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng lựa chọn điều kiện tối ưu cho quy trình chiết xuất apigenin từ Cúc hoa vàng 3.4.3.1 Về kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất apigenin Dựa phương pháp thay đổi yếu tố, yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất apigenin khảo sát bao gồm nhiệt độ chiết xuất có mặt enzym, thời gian chiết xuất có mặt enzym, pH dịch chiết đậu nành thể tích dịch chiết đậu nành tham gia q trình thủy phân  Về kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất: Tiến hành khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ tới trình chiết xuất nhiệt độ 30 C, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC Kết hình 3.1 cho thấy nhiệt độ chiết xuất tăng dần đến 50oC hàm lượng apigenin dịch chiết tăng Nguyên nhân tăng nhiệt độ làm giảm độ nhớt sức căng bề mặt dung môi làm tăng hoạt động enzym, từ tăng khả thủy phân apigenin-glycosid để tạo thành apigenin [6] Tuy nhiên, tiếp tục tăng nhiệt độ lên cao 50oC, lượng apigenin thu giảm đáng kể Nguyên nhân do, enzym β-glucosidase đậu nành có hoạt tính ổn o 37 định khoảng nhiệt độ từ 45 – 50oC [73] Do đó, tăng nhiệt độ lên cao, enzym bị bất hoạt phần, dẫn đến giảm khả thủy phân tạo thành apigenin  Về kết khảo sát thời gian chiết xuất: Tiến hành khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết xuất có mặt enzym với khoảng thời gian 0h, 1h, 1,5h, 2h, 2,5h, 3h Kết hình 3.2 cho thấy thời gian chiết có mặt enzym tăng dần đến 2h hàm lượng apigenin dịch chiết Cúc hoa vàng tăng lên Nguyên nhân có mặt enzym, thời gian chiết ngắn, apigenin dạng liên kết glycosid chưa thủy phân hết dẫn đến hàm lượng apigenin thu dịch chiết chưa đạt giá trị tối đa Khi thời gian chiết tăng lên, enzym β-glucosidase với vai trò chuyển dạng apigenin-glycosid thành apigenin, hàm lượng apigenin thu tăng cao hàm lượng cao thu Tuy nhiên, tiếp tục tăng thời gian chiết xuất, hàm lượng apigenin thu lại giảm đáng kể Do với trình sử dụng enzym, phản ứng phải dừng lại lúc để tránh phản ứng theo tầng mức làm biến tính sản phẩm mong muốn [67] Bên cạnh thời gian chiết xuất dài làm cho dịch chiết nhiều tạp, gây bất lợi cho trình tinh chế gây tốn thời gian, lượng [6]  Về kết khảo sát pH dịch chiết đậu nành: Tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH dịch chiết đậu nành tới trình chiết xuất giá trị pH = 3, 4, 5, 6, Kết hình 3.3 cho thấy, pH dịch chiết đậu nành tăng từ dần đến hàm lượng apigenin dịch chiết tăng lên Nguyên nhân pH acid, enzym đậu nành hoạt động kém, tăng dần pH đến 5, enzym hoạt động tốt Kết nghiên cứu cho thấy enzym β-glucosidase đậu nành hoạt động tốt pH = Kết tương đồng với nghiên cứu trước đề cập mục 1.4 [73]  Về kết khảo sát thể tích dịch chiết đậu nành tham gia thủy phân: Tiến hành khảo sát ảnh hưởng thể tích dịch chiết đậu nành thêm vào tới trình chiết xuất giá trị: 0ml, 1ml, 2ml, 3ml, 4ml Kết hình 3.4 cho thấy, thể tích dịch chiết đậu nành thêm vào tăng dần đến 3ml hàm lượng apigenin dịch chiết Cúc hoa vàng tăng lên Nguyên nhân lượng dịch chiết tăng lên đồng nghĩa với việc hàm lượng enzym β-glucosidase tham gia trình thủy phân tăng lên, từ dẫn đến tăng hiệu suất trình thủy phân apigenin-glycosid thành apigenin Tuy nhiên, 38 tiếp tục tăng thể tích dịch chiết đậu nành, hàm lượng apigenin thu giảm đáng kể 3.4.3.2 Về kết khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu cho trình chiết xuất apigenin từ Cúc hoa vàng Dựa vào kết khảo sát phương pháp thay đổi yếu tố, biến đầu vào phương pháp bề mặt đáp ứng lựa chọn bao gồm: nhiệt độ chiết xuất có mặt enzym, thời gian chiết xuất có mặt enzym thể tích dịch chiết đậu nành Biến đầu hàm lượng apigenin (Y) có dịch chiết Cúc hoa vàng Thiết kế Box-Behnken với 18 thí nghiệm xây dựng mơ hình phù hợp để sử dụng dự đoán điều kiện chiết xuất tối ưu hàm lượng apigenin từ dược liệu Cúc hoa vàng Điều kiện tối ưu xác định bao gồm: - Nhiệt độ chiết xuất có mặt enzym: 54°C Thời gian chiết xuất có mặt enzym: 2h Thể tích dịch chiết đậu nành: 3ml Hàm lượng apigenin thu ~ 3,4 mg/g dược liệu Dựa nghiên cứu trước tác giả Nguyễn Thu Hằng cộng sự, hàm lượng apigenin thu sử dụng dung môi eutectic ~ 0,5 mg/g dược liệu [13] Do đó, so sánh với kết đề tài cho thấy việc kết hợp dung môi DES enzym làm tăng hàm lượng apigenin dịch chiết lên nhiều lần Như vậy, kết nghiên cứu chứng minh việc sử dụng dung môi eutectic kết hợp với enzym phương pháp phù hợp để ứng dụng chiết xuất dịch chiết giàu apigenin từ dược liệu Cúc hoa vàng 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Sau thời gian nghiên cứu, đề tài hoàn thành mục tiêu thu kết sau: Đã tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng lựa chọn điều kiện tối ưu việc cải tiến quy trình chiết xuất apigenin từ Cúc hoa vàng phương pháp thay đổi yếu tố phương pháp bề mặt đáp ứng Từ đó, cho thấy điều kiện tối ưu cải tiến quy trình chiết xuất dịch chiết giàu apigenin từ Cúc hoa vàng sau: - Nhiệt độ chiết xuất có mặt enzym: 54°C - Thời gian chiết xuất có mặt enzym: 2h Thể tích dịch chiết đậu nành tham gia trình thủy phân: 3ml Tiến hành chiết xuất điều kiện tối ưu thu dịch chiết với hàm lượng apigenin 3,3795 ± 0,0310 mg/g dược liệu ĐỀ XUẤT Tiếp tục nghiên cứu trình tinh chế apigenin từ dịch chiết Cúc hoa vàng Nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase cao chiết Cúc hoa vàng thu theo quy trình tối ưu 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đỗ Huy Bích cộng (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam Tập 1, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr 604605 Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V Tập 2, NXB Y học, Hà Nội Nguyễn Viết Thân (2007), Cây thuốc Việt Nam thuốc thường dùng Tập 1, NXB Y học, Hà Nội, tr 610 Lê Kim Biên (2007), Thực vật chí Việt Nam Tập 7, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Từ Minh Koóng (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm Tập 1, NXB Y học, Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh Takhtajan Armen (2009), Flowering plants, Springer Science & Business Media Azmi S M N., Jamal Parveen, et al (2012) "Xanthine oxidase inhibitory activity from potential Malaysian medicinal plant as remcdies for gout", International Food Research Journal, 19, pp 159-165 Aziz Nur, Kim Mi-Yeon, Cho Jae Youl (2018), "Anti-inflammatory effects of luteolin: A review of in vitro, in vivo, and in silico studies”, Journal of Ethnopharmacology, 225, pp 342-358 10 Cha Ji-Yun, Nepali Sarmila, et al (2018), "Chrysanthemum indicum L ethanol extract reduces high-fat diet-induced obesity in mice”, Experimemtal and therapeutic medicine, 15(6), pp 5070-5076 11 Yang-Hee HONG and others (2013), “Enzymatic Improvement in the Polyphenol Extractability and Antioxidant Activity of Green Tea Extracts”, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 77(1), pp 22-29 12 Hirano Marina et al (2017), "Luteolin-rich chrysanthemum flower extact suppresses baseline serum uric acid in Japanese subjects with mild hyperuricemia”, Integrarive Molecular Medicine, 4(2), pp 1-5 13 Nguyen Thu Hang, Vu Thi Huyen Trang, Nguyen Van Phuong, et al (2022) “Application of multivariate linear regression models for selection of deep eutectic solvent for extraction of apigenin and luteolin from Chrysanthemum indicum L.”, Phytochemical Analysis, 33(3), pp 427- 440 41 14 Shao Yanhao et al (2020), "Chrysanthemum indicum L.: A Comprehensive Review of its Botany, Phytochemistry and Pharmacology”, The American Journal of Chinese Medicine, 48(04), pp 871-897 15 Lee J-H, Moon J-M, Kim Y-H, Lee B, Choi S-Y, Song B-J, Kim D-K, Lee Y-M, (2019), “Effect of Enzymatic Treatment of Chrysanthemum Indicum Linné Extracts on Lipid Accumulation and Adipogenesis in High-Fat-Diet-Induced Obese Male Mice”, Nutrients, 11(2), pp 269 16 Shao Y., Sun Y., et al (2020), “Chrysanthemum indicum L., A Comprehensive Review of its Botany, Phytochemistry and Pharmacology”, American Journal oƒ Chinese Medicine, 48(4), pp 871-897 17 Shao Y., Sun Y., Li D., Chen Y., (2020), “Chrysanthemum indicum L., A Comprehensive Review of its Botany, Phytochemistry and Pharmacology”, Am J Chin Med., 48(4), pp 871-897 18 Hisashi matsuda, Toshio morikawa, Iwao toguchida, Shoichi harima, and Masayuki yoshikawa, (2002), “Medicinal Flowers VI Absolute Stereostructures of Two New Flavanone Glycosides and a Phenylbutanoid Glycoside from the Flowers of Chrysanthemum indicum L.: Their Inhibitory Activities for Rat Lens Aldose Reductase”, Chem Pharm Bull., 50(7), pp 972-975 19 Lijun Song, Pengzhan Liu, Yinzhuo Yan, Ying Huang, Bingyao Bai, Xujie Hou, Li Zhang, (2019), “Supercritical CO2 fluid extraction of flavonoid compounds from Xinjiang jujube (Ziziphus jujuba Mill.) leaves and associated biological activities and flavonoid compositions”, Industrial Crops and Products, 139, pp 1-5 20 Niu, Q., Gao, Y., Liu P., (2019), “Optimization of microwave-assisted extraction, antioxidant capacity, and characterization of total flavonoids from the leaves of Alpinia oxyphylla Miq”, Prep Biochem Biotechnol, 50, pp 82–90 21 Ke, L., Chen H., (2016), “Enzymatic-Assisted Microwave Extraction of Total Flavonoids from Bud of Chrysanthemum indicum L and Evaluation of Biological Activities”, Int J Food Eng, 12, pp 607–613 22 Wang Y, Xu Z, Huang Y, Wen X, Wu Y, Zhao Y, Ni Y, (2018), “Extraction, Purification, and Hydrolysis Behavior of Apigenin-7-O-Glucoside from Chrysanthemum Morifolium Tea”, Molecules, 23(11) 42 23 Xiu-min Liu, Ya Liu, Chun-hui Shan, Xin-quan Yang, Qin Zhang, Na Xu, Li-ying Xu, Wen Song, (2022), “Effects of five extraction methods on total content, composition, and stability of flavonoids in jujube”, Food Chemistry: X, 14 24 Marcus Yizhak (2019), Deep eutectic solvents, Spinger International Publishing 25 Lin Chun-Mao et al (2002), "Molecular modeling of flavonoids that inhibits xanthine oxidase”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 294(1) pp 167172 26 Zhou Y, Wu D, Cai P, Cheng G, Huang C, Pan Y, (2015), “Special Effect of Ionic Liquids on the Extraction of Flavonoid Glycosides from Chrysanthemum morifolium Ramat by Microwave Assistance”, Molecules, 20(5), pp 7683-7699 27 Gualtiero Milani, Maryline Vian, Maria Maddalena Cavalluzzi, Carlo Franchini, Filomena Corbo, Giovanni Lentini, Farid Chemat, (2020), “Ultrasound and deep eutectic solvents: An efficient combination to tune the mechanism of steviol glycosides extraction”, Ultrasonics Sonochemistry, 69 28 Hertog M G L., Hollman P C H., Venema D P., (1992), “Optimization of a quantitative HPLC determination of potentially anticarcinogenic flavonoids in vegetables and fruits”, J Agric Food Chem, 40, pp 1591–1598 29 Pablo Domínguez de María, Zaira Maugeri, (2011), “Ionic liquids in biotransformations: from proof-of-concept to emerging deep-eutectic-solvents”, Current Opinion in Chemical Biology, 2(15), pp 220-225 30 de Araújo M E M B., Moreira Franco Y E., Alberto T G., Sobreiro M A., Conrado M A., Priolli D G., et al (2013), “Enzymatic de-glycosylation of rutin improves its antioxidant and antiproliferative activities”,Food Chem, 141, pp 266–273 31 Azwanida N.N, (2015), “A Review on the Extraction Methods Use in Medicinal Plants, Principle, Strength and Limitation”, Med Aromat Plants, 4, pp 196 32 Ahn-Jarvis J H., Parihar A., Doseff A I., (2019), “Dietary flavonoids for immunoregulation and cancer: food design for targeting disease”, Antioxidants, 8, 202 33 Nuutila A.M., Kammiovirta K., Oksman-Caldentey K.M, (2002), “Comparison of methods for the hydrolysis of flavonoids and phenolic acids from onion and spinach for HPLC analysis”, Food Chem, 76, pp 519–525 34 Shao P, He J, Sun P, Zhao P, (2012), “Analysis of conditions for microwave-assisted extraction of total water-soluble flavonoids from Perilla Frutescens leaves”, J Food Sci Technol”, 49(1), pp 66-73 43 35 Kong L D., Cai Y., et al (2000), "Inhibition of xanthine oxidase by some Chinese medicinal plants used to treat gout”, Journal of Ethnopharmacology, 73(1) pp 199207 36 Sainz Martinez A., Kornpointner C., Haselmair-Gosch C., Mikulic-Petkovsek M., Schröder K., Halbwirth H., (2021), “Dynamic streamlined extraction of iridoids, anthocyanins and lipids from haskap berries”, LWT, 138 37 Stobiecki M., Kachlicki P., (2006), “Isolation and Identification of Flavonoids”, The Science of flavonoids, pp 47–71 38 Mandalari G., Bennett R.N., Bisignano G., Saija A., Dugo G., Lo Curto R.B., et al (2006), “Characterization of flavonoids and pectins from bergamot (Citrus bergamia Risso) Peel, a major byproduct of essential oil extraction”, J Agric Food Chem, 54, pp 197–203 39 Lin C M., Chen C S., et al (2002), "Molecular modeling of flavonoids that inhibits xanthine oxidase”, Biochemical and Biophysical Research Communicarions, 294(1), pp 167-72 40 Moussa-Ayoub T.E., El-Samahy S.K., Kroh L.W., Rohn S., (2011), “Identification and quantification of flavonol aglycons in cactus pear (Opuntia ficus indica) fruit using a commercial pectinase and cellulase preparation”, Food Chem, 124, pp 1177–1184 41 Thenrajan Raja Sekharan, et al (2021), "Neoteric solvents for the pharmaceuticalindustry: an update”, Drug Discov Today, 26(7), pp 1702-1711 42 Kurioka A., Yamazaki M., (2002), “Purification and identification of flavonoids from the yellow green cocoon shell (Sasamayu) of the silkworm, Bombyx mori”, Biosci Biotechnol Biochem, 66, pp 1396–1399 43 Freischmidt A., Untergehrer M., Ziegler J., Knuth S., Okpanyi S., Müller J., et al (2015), “Quantitative analysis of flavanones and chalcones from willow bark”, Die Pharmazie Int J Pharm Sci., 70, pp 565–568 44 Haselmair - Gosch C., Miosic S., Nitarska D., Roth B L., Walliser B., Paltram R., et al (2018), “Great cause-mall effect: undeclared genetically engineered orange petunias harbor an inefficient dihydroflavonol 4-reductase”, Front Plant Sci., 9, pp 149 45 Yuan-Yuan Zang, Xi Yang, Zhi-Gang Chen, Tao Wu, (2020), “One-pot preparation of quercetin using natural deep eutectic solvents”, Process Biochemistry, 89, pp 193-198 44 46 Hong, Y.H., Jung, E.Y., Park, Y.H., Shin, K.S., Kim, T.Y., Yu, K.W., Chang, W.J., Suh, H.J, (2013), “Enzymatic improvement in the polyphenol extractability and antioxidant activity of green tea extracts”, Biosci Biotechnol Biochem, 77, pp 22 - 29 47 Guan, X., Yao H., (2008), “Optimization of Viscozyme L-assisted extraction of oat bran protein using response surface methodology”, Food Chem., 106, pp 345–351 48 H.B Sowbhagya, Kaul T Purnima, Suma P Florence, A.G Appu Rao, P Srinivas, (2009), “Evaluation of enzyme-assisted extraction on quality of garlic volatile oil”, Food Chemistry, 4(113), pp 1234-1238 49 Lu, M.J., Chen C., (2008), “Enzymatic modification by tannase increases the antioxidant activity of green tea”, Food Res Int., 41, pp 130–137 50 Nguyen Mai Thanh Thi Awale Suresh, et al (2004), "Xanthine Oxidase Inhibitory Activity of Vietnamese Medicinal Plamts", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 27(9), pp 1414-1421 51 Promila Promila and Singh Sushila (2018), "Applications of green solvents in extraction of phytochemicals from medicinal plants: A review", The Pharma Innovation,7(3), pp 238-245 52 Lee J-H, Moon J-M, Kim Y-H, Lee B, Choi S-Y, Song B-J, Kim D-K, Lee Y-M, (2019), “Effect of Enzymatic Treatment of Chrysanthemum Indicum Linné Extracts on Lipid Accumulation and Adipogenesis in High-Fat-Diet-Induced Obese Male Mice”, Nutrients, 11(2) 53 L Song, P Liu, Y Yan, Y Huang, B Bai, X Hou, L Zhang, (2019), “Supercritical CO2 fluid extraction of flavonoid compounds from Xinjiang jujube (Ziziphus jujuba Mill.) leaves and associated biological activities and flavonoid compositions”, Industrial Crops and Products, 139 54 Shamraja S Nadar, Priyanka Rao, Virendra K Rathod, (2018), “Enzyme assisted extraction of biomolecules as an approach to novel extraction technology: A review”, Food Research International, 108, pp 309-330 55 Y Wang, Y Gao, H Ding, S Liu, X Han, J Gui, D Liu, (2017), “Subcritical ethanol extraction of flavonoids from Moringa oleifera leaf and evaluation of antioxidant activity”, Food Chemistry, 218, pp 152-158 56 L Zhang, P Liu, L Li, Y Huang, Y Pu, X Hou, L Song, (2018), “Identification and Antioxidant Activity of Flavonoids Extracted from Xinjiang Jujube (Ziziphus jujube Mill.) Leaves with Ultra-High Pressure Extraction Technology”, Molecules, 24(1) 45 57 Dr Nadia Guajardo, Dr Christoph R Müller, MSc Rodrigo Schrebler, Prof Dr Carlos Carlesi, Dr habil., Pablo Domínguez de María, (2015), “Deep Eutectic Solvents for Organocatalysis, Biotransformations, and Multistep Organocatalyst /Enzyme Combinations”, ChemCatChem, 6(8) 58 A.P Abbott, G Capper, D.L Davies, R.K Rasheed, V Tambyrajah, (2003), “Novel solvent properties of choline chloride/ urea mixtures”, Chemical Communications (Camb), 1, pp 70-71 59 M Cvjetko Bubalo, N Curko, M Tomasevic, K Kovacevic Ganic, I Radojcic Redovnikovic, (2016), “Green extraction of grape skin phenolics by using deep eutectic solvents”, Food Chemistry, 200, pp 159-166 60 Bosiljkov T., Dujmić F., Cvjetko Bubalo M., Hribar J., Vidrih R., Brnčić M., Jokić S., (2017), “Natural deep eutectic solvents and ultrasound-assisted extraction: Green approaches for extraction of wine lees anthocyanins”, Food and Bioproducts Processing, 102, pp, 195-203 61 Y Dai, J van Spronsen, G.J Witkamp, R Verpoorte, Y.H Choi, (2013), “Natural deep eutectic solvents as new potential media for green technology”, Analytica Chimica Acta, pp 61-68 62 A.R Mansur, N.E Song, H.W Jang, T.G Lim, M Yoo, T.G Nam, (2019), “Optimizing the ultrasound-assisted deep eutectic solvent extraction of flavonoids in common buckwheat sprouts”, Food Chemistry, 293, pp 438-445 63 Yuan-Yuan Zang, Xi Yang, Zhi-Gang Chen, Tao Wu, (2020), “One-pot preparation of quercetin using natural deep eutectic solvents”, Process Biochemistry, 89, pp 193-198 64 Yin X S., Zhong Z F., Bian G L., Cheng X J., & Li D Q., (2020), “Ultra-rapid, enhanced and eco-friendly extraction of four main flavonoids from the seeds of Oroxylum indicum by deep eutectic solvents combined with tissue-smashing extraction”, Food Chemistry, 319 65 James Ketudat Cairns, Asim Esen, (2010) “β-Glucosidase”, Cellular and Molecular Life Sciences, 67(20), pp 3389-405 66 Krisch J, Tako M, Papp T, Vagvolgyi C, (2010), “Characteristics and potential use of β-glucosidases from Zygomycetes”, Mendez-Vilas A (ed) Current Research, Technology and Education, Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology, pp 891–896 46 67 Manisha, Sudesh Kumar Yadav, (2017), “Technological advances and applications of hydrolytic enzymes for valorization of lignocellulosic biomass”, Bioresource Technology, 245, pp 1727-1739 68 Keerti, Gupta A, Kumar V, Dubey A, Verma AK, (2014), “Kinetic characterization and effect of immobilized thermostable β-glucosidase in alginate gel Beads on sugarcane juice”, ISRN biochemistry 69 Kurioka A., Yamazaki M., (2002), “Purification and identification of flavonoids from the yellow green cocoon shell (Sasamayu) of the silkworm, Bombyx mori.”, Biosci Biotechnol Biochem., 66, pp 1396–1399 70 Zhuang Li, He Wang, Xudong Pan, Yu Guo, Wenbin Gao, Jun Wang, Bingjie Dong, Mengyue Duan, Huayue Yin, Qiang Zhang, Fengli Chen, (2022), “Enzyme-deep eutectic solvent pre-treatment for extraction of essential oil from Mentha haplocalyx Briq leaves: Kinetic, chemical composition and inhibitory enzyme activity”, Industrial Crops and Products, 177 71 Freischmidt A., Untergehrer M., Ziegler J., Knuth S., Okpanyi S., Müller J., et al (2015), “Quantitative analysis of flavanones and chalcones from willow bark”, Die Pharmazie Int J Pharm Sci., 70, pp 565–568 72 Singh G, Verma AK, Kumar V., (2016), “Catalytic properties, functional attributes and industrial applications of β-glucosidases”, Biotech, 6(1) 73 R.F Santos, C.F Oliveira, G.S Varéa, M.L.C Orradi Da Silva, (2013), “Purification and characterization of soy cotyledon β-glucosidase”, Journal of Food Biochemistry, 37(3) 74 Grade L C., Moreira A A., Varea G S., Mandarino J., Silva J., Ida E., & Ribeiro M., (2013), “Immobilized soybean B-glucosidase application in commercial soy drink”, Americas: international conference on soybean utilization 75 Rajasckaran A et (2014), "Simultaneous Estimation of Luteolin and Apigenin in Methanol Leaf Extraet of Bacopa monmieri Linn by HPLC", Journal of Pharmaceutical Research International, 4(13), pp 1629-1637 76 Haselmair-Gosch C., Miosic S., Nitarska D., Roth B L., Walliser B., Paltram R., et al (2018), “Great cause - small effect: undeclared genetically engineered orange petunias harbor an inefficient dihydroflavonol 4-reductase”, Front Plant Sci., 9, pp 149 47 77 Guo Na et (2020), "Effective extraction and recovery of linarin from Chysanthemum indicum L flower using deep eutectic solvents", Microchemical Journal, 159 p 105586 78 Covington AK, Dickinson T (1973), "Introduction and solvent properties”, Physical Chemistry of Organic Solvent Systems, Springet, Dp 1-22 79 Chemat Farid, Abert Vian Maryline, et al (2019), "Review of Alternative Solvents for Green Extraction of Food and Natural Products: Panorama, Principles, Applications and Prospects", Molecules (Bascl, Swirserland), 24(16), pp 3007 80 Dai Yuntao, Verpoorte Robert, Choi Young Hae (2014), “Natural deep eutectic solvents providing enhanced stability of natural colorants from safflower (Carthamus tinctorius)", Food Chemistry, 159, pp 116-121 81 O.N Donkor and N.P Shah (2008), “Production of β-Glucosidase and Hydrolysis of Isoflavone Phytoestrogens by Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis, and Lactobacillus casei in Soymilk”, Journal of Food Science, 73(1), pp.M15-M20 82 Y.H Pyo, T.C Lee, and Y.C Lee (2005), “Enrichment of bioactive isoflavones in soymilk fermented with β-glucosidase-producing lactic acid bacteria”, Food Research International, 38(5), pp 551-559 83 S.J Yeom, B.N Kim, Y.S Kim, et al (2012), “Hydrolysis of isoflavone glycosides by a thermostable β-glucosidase from Pyrococcus furiosus”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60(6), pp 1535-1541 84 R.R Singhania, A.K Patel, R.K Sukumaran, et al (2013), “Role and significance of beta-glucosidases in the hydrolysis of cellulose for bioethanol production”, Bioresource Technology, 127, pp.500-507 85 Janbon G, Arnaud A, Galzy P., (1994), “Selection and study of a Candida molischiana mutant derepressed for beta-glucosidase production”, FEMS Microbiol Lett, 118(3) 86 Freer SN, Skory CD., (1996), “Production of beta-glucosidase and diauxic usage of sugar mixtures by Candida molischiana”, Can J Microbiol, 42(5) 87 Li Y-Y, Jiang C-J, Wan X-C, Zhang Z-Z, Li D-X, (2005), “Purification and partial characterization of β-glucosidase from fresh leaves of tea plants (Camellia sinensis L.) O Kuntze)”, Acta biochimica et biophysica Sinica, 37(6), pp 363-370 48 88 Masaru Matsuura and others, (1995), “Studies on β-Glucosidases from Soybeans That Hydrolyze Daidzin and Genistin: Isolation and Characterization of an Isozyme”, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 9(59), pp 1623-1627 89 Myers R.H et (2017), Response surface methdology - Process and product optimization using designed experiment, Wiley 90 Liyana-Pathirana et al (2005), "Optimization of extraction of phenolic compounds from wheat using response surface methodology”, Food Chemistry, 93(1), pp.47-56 91 Tzanova M, Atanasov V, Yaneva Z, Ivanova D, Dinev T., (2020), “Selectivity of Current Extraction Techniques for Flavonoids from Plant Materials”, Processes., 8(10) 92 Na Guo, Yong-Peng Zou, Hong-Kun Li, Ping Kou, Zhi-Ming Liu, Yu-Jie Fu, (2020), “Effective extraction and recovery of linarin from Chrysanthemum indicum L flower using deep eutectic solvents”, Microchemical Journal, 159 93 Tang Baokun, Zhang Heng, and Row Kyung Ho (2015), "Application of deep eutectic solvents in the extraction and separation of target compounds from various samples”, Journal o Separation Science, 38(6), pp 1053-1064 94 Zhang Q et al (2012), "Deep eutectic solvents: syntheses, properties and applications”, Chem Soc Rev, 41(21) p 7108 95 Francisco Maria, Adriaan van den Bruinhorst, Kroon Maaike C (2013), "LowTransition-Temperature Mixtures (LTTMs): A New Generation of Designer Solvents", Angewandte Chemie International Edition, 52(11), pp 3074-3085 96 Sun Yu, Ma Xiaobin, et al (2012), "Compounds from fraction with cardiovascular activity of Chrysanthemum indicum", China Journal oƒ Chinese Materia Medica, 37(1) pp 61-65 97 Oomen Wim Wouter et al, (2020), "Natural Deep Eutectic Solvent Extraction of Flavonoids of Scutellaria baicalensis as a Replacement for Conventional Organic Solvents”, Molecules, 25(3) p 617 98 Lijun You, Mouming Zhao, Chun Cui, Haifeng Zhao, Bao Yang (2009), “Effect of degree of hydrolysis on the antioxidant activity of loach (Misgurnus anguillicaudatus) protein hydrolysates”, Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2(10), pp 235-240 49