BÙI THỊ NGỌC HUYỀN NGHIÊN cứu điều CHẾ CAO đặc PHƯƠNG THUỐC TAN THỐNG PHONG THEO HƯỚNG làm GIÀU BERBERIN HYDROCHLORID KHOÁ LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ NGỌC HUYỀN MÃ SINH VIÊN: 1701266 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO ĐẶC PHƯƠNG THUỐC TAN THỐNG PHONG THEO HƯỚNG LÀM GIÀU BERBERIN HYDROCHLORID KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Bùi Hồng Cường Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Để có kết ngày hôm nay, em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới: Ban giám hiệu nhà trường, phòng ban chức tồn thể thầy trường Đại học Dược Hà Nội tận tình dạy dỗ em suốt năm tháng qua Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới người thầy - PGS.TS Bùi Hồng Cường, thầy ln hết lịng, bảo cho chúng em, quan tâm tạo điều kiện để em hồn thành khố luận Từ thầy em học hỏi nhiều điều kĩ làm việc khoa học, cẩn thận có trách nhiệm Em xin cảm ơn thầy cô môn Dược học cổ truyền tạo điều kiện cho em khoảng thời gian nghiên cứu hoàn thành khoá luận Em xin cảm ơn sinh viên nghiên cứu môn giúp đỡ lúc khó khăn Cuối em xin cảm ơn tình cảm quý báu gia đình, người thân bạn bè, người cạnh bên, động viên giúp đỡ em học tập tốt Do kiến thức cịn hạn chế, q trình làm nghiên cứu khơng thể tránh khỏi sai sót, em mong nhận góp ý q báu thầy Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng 06 năm 2022 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Cao đặc phương thuốc Tan thống phong 1.1.1 Thành phần 1.1.2 Công năng, chủ trị 1.1.3 Tác dụng sinh học 1.1.4 Định tính, định lượng cao đặc phương thuốc Tan thống phong 1.2 Các vị thuốc .4 1.2.1 Hoàng bá 1.2.2 Thương truật 1.2.3 Ngưu tất 1.2.4 Hy thiêm 1.2.5 Tri mẫu .8 1.2.6 Mộc qua 1.3 Phương pháp điều chế cao đặc 10 1.4 Thiết kế thí nghiệm tối ưu hố thí nghiệm dựa nguyên tắc mạng neuron nhân tạo 11 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị .13 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.1.2 Thiết bị, máy móc 13 2.1.3 Hóa chất, chất chuẩn 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Chuẩn bị vị thuốc 14 2.3.2 Định lượng BBR cao đặc, dược liệu Hoàng bá phương pháp HPLC… 15 2.3.3 Chiết xuất bào chế cao đặc 16 2.3.4 Xác định độ ẩm dược liệu, cao đặc 17 2.3.5 Khảo sát tối ưu hố quy trình bào chế cao đặc theo hàm lượng hiệu suất chiết BBR .18 2.3.6 Xử lí số liệu 19 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20 3.1 Xác định tính đặc hiệu xây dựng đường chuẩn phương pháp định lượng BBR cao đặc Tan thống phong 20 3.1.1 Kết tính đặc hiệu .20 3.1.2 Kết xây dựng phương trình đường chuẩn BBR 21 3.2 Nghiên cứu điều chế cao đặc phương thuốc Tan thống phong tối ưu hoá quy trình chiết xuất 22 3.2.1 Kết khảo sát thông số điều chế cao 22 3.2.2 Thiết kế thí nghiệm 25 3.2.3 Tối ưu hố quy trình chiết xuất 27 3.2.4 Xác định giá trị tối ưu biến độc lập kiểm chứng mơ hình 29 CHƯƠNG IV BÀN LUẬN 32 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Đề xuất .35 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN ANN Acetonitril Mạng neuron nhân tạo - artificial neural network BBR Berberine hydrochloride DĐTQ Dược điển Trung Quốc DĐVN Dược điển Việt Nam DL Dược liệu ĐL Định lượng DM Dung mơi ĐT Định tính EtOH Ethanol HB Hoàng bá HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao LOD Giới hạn phát LOQ Giới hạn định lượng MeOH Methanol PKN Phiếu kiểm nghiệm SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng TB Trung bình XO Xanthin oxidase YHCT Y học cổ truyền DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Nồng độ kết mẫu chuẩn A-E 22 Bảng 3.2 Kết định lượng BBR dược liệu Hoàng bá 23 Bảng 3.3 Kết hàm lượng hiệu suất chiết BBR mẫu cao đặc khảo sát phương pháp chiết 23 Bảng 3.4 Kết hàm lượng hiệu suất chiết BBR mẫu cao đặc khảo sát kích thước 24 Bảng 3.5 Kết hàm lượng hiệu suất chiết BBR mẫu cao đặc khảo sát dung môi 24 Bảng 3.6 Khoảng biến thiên biến độc lập 25 Bảng 3.7 Thiết kế thí nghiệm kết biến phụ thuộc 26 Bảng 3.8 Kết đánh giá mạng neuron nhân tạo 28 Bảng 3.9 Giá trị hàm hy vọng tuyến tính theo biến phụ thuộc 30 Bảng 3.10 Giá trị dự đoán kết thực nghiệm kiểm chứng (n=3) 31 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc điển hình ANN 11 Hình 2.1 Các vị thuốc phương thuốc Tan thống phong 13 Hình 2.2 Sơ đồ bào chế cao đặc 17 Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu phân tích tính đặc hiệu ghi bước sóng 347nm 20 Hình 3.2 Phổ hấp thụ UV mẫu thử mẫu chuẩn BBR 20 Hình 3.3 Sắc ký đồ dãy chuẩn bước sóng 347nm 21 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ diện tích pic 22 Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu dược liệu Hồng bá bước sóng 347nm 23 Hình 3.6 Sắc ký đồ thí nghiệm 10 (Nồng độ EtOH 60%, tỷ lệ DM/DL= 12 ml/g, thời gian chiết 180 phút, chiết lần) 27 Hình 3.7 Sắc ký đồ thí nghiệm 15 (Nồng độ EtOH 96%, tỷ lệ DM/DL= 12 ml/g, thời gian chiết 180 phút, chiết lần) 27 Hình 3.8 Sơ đồ mạng neuron nhân tạo 28 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn biến thiên biến phụ thuộc theo biến độc lập giá trị hàm hy vọng 29 Hình 3.10 Khơng gian thiết kế theo Nồng độ ethanol Tỷ lệ DM/DL (vùng màu trắng) (Thời gian chiết = 90; Số lần chiết = 3) 30 Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu kiểm chứng 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Tam diệu thang bao gồm vị thuốc Hoàng bá (HB), Thương truật, Ngưu tất dùng y học cổ truyền (YHCT) với công nhiệt, táo thấp, có tác dụng điều trị chứng phong thấp nhiệt tí (thể nhiệt) [1], [3], [12], biểu sưng, nóng, đỏ, đau bàn chân đầu gối, chi nặng nề [1], [12] Trên thực nghiệm chứng minh tác dụng tốt điều trị viêm khớp, đặc biệt bệnh nhân viêm khớp kèm viêm loét dày [4] Phương thuốc Tan thống phong gia giảm dựa phương thuốc Tam diệu thang, bao gồm vị thuốc Hoàng bá, Thương truật, Ngưu tất gia thêm vị Hy thiêm, Tri mẫu, Mộc qua nhằm tăng hiệu lực điều trị Đặc biệt có nghiên cứu gần xây dựng số tiêu định tính (ĐT), định lượng (ĐL) đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thực nghiệm cao đặc phương thuốc Tan thống phong Và kết nghiên cứu cao đặc Tan thống phong chiết ethanol liều 3,2 g/kg có tác dụng ức chế tăng acid uric huyết thanh, theo chế ức chế enzym XO [10] Từ xa xưa, người bệnh hay dùng phương thuốc dạng sắc, hãm, nhiên điều thường tốn thời gian gây bất tiện cho người sử dụng Đồng thời, hàm lượng hiệu suất chiết cách dùng thường không cao khó để kiểm sốt tác dụng Mong muốn tìm dạng bào chế thuận tiện phù hợp cho người bệnh, kiểm soát hàm lượng hoạt chất tác dụng điều trị Vì cao đặc lựa chọn dạng bán thành phẩm trung gian để sản xuất dạng bào chế đại khác, ví dụ thuốc cốm, viên nang Hoạt chất berberin hydroclorid (BBR) thành phần dược liệu Hồng bá (vị Quân thuốc), có tác dụng giảm acid uric máu [24], [38], bảo vệ thận [38], chống viêm tinh thể muối urat lắng đọng khớp [22], kháng khuẩn, chống viêm [25], chống ung thư [29] Do việc nghiên cứu chiết xuất nhằm thu cao đặc có hàm lượng hiệu suất chiết BBR cao cần thiết Phương pháp thiết kế thí nghiệm (experimental design) lựa chọn điều kiện tối ưu dựa nguyên tắc mạng neuron nhân tạo (artificial neural network – ANN) với hỗ trợ phần mềm máy tính [21] cơng cụ hiệu việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất Cho đến nay, chưa có nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết xuất để bào chế cao đặc thuốc Tan thống phong cơng bố Chính vậy, đề tài “Nghiên cứu điều chế cao đặc phương thuốc Tan thống phong theo hướng làm giàu berberin hydrocholorid” ứng dụng thiết kế thí nghiệm phương pháp mạng neuron nhân tạo với mục tiêu: Tối ưu hoá quy trình chiết xuất để bào chế cao đặc phương thuốc Tan thống phong theo hướng làm giàu berberin hydroclorid CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Cao đặc phương thuốc Tan thống phong Phương thuốc Tam diệu thang sách Phương thang y học cổ truyền [3] bao gồm vị thuốc Hoàng bá, Thương truật, Ngưu tất Phương thuốc Tan thống phong Tam diệu thang có gia thêm vị Hy thiêm, Tri mẫu, Mộc qua 1.1.1 Thành phần Hoàng bá 3g Hy thiêm 4,8 g Thương truật 4,8 g Tri mẫu 4,8 g Ngưu tất 4,8 g Mộc qua 4,8 g Tổng khối lượng mẻ 27g 1.1.2 Công năng, chủ trị - Công năng: Thanh nhiệt, táo thấp - Chủ trị: Rối loạn thấp nhiệt dồn xuống, biểu sưng, nóng, đỏ, đau bàn chân đầu gối, chi nặng nề, nước tiểu vàng - Giải thích phương thuốc: + Hồng bá qn dược, vị đắng, tính hàn, cơng nhiệt táo thấp, tư âm giáng hỏa + Thương truật có vị đắng, cay, tính ấm, cơng kiện tỳ táo thấp, khu phong trừ thấp Hy thiêm vị đắng, cay, tính hàn, cơng trừ phong thấp, nhiệt Hai vị thuốc có vai trị thần dược + Tri mẫu vị đắng, tính hàn, cơng nhuận táo, nhiệt giáng hỏa, lợi tiểu tá dược Mộc qua vị chua, tính ơn, có cơng bình can dương, thư cân, hịa vị, hóa thấp, hành khí, dẫn thuốc lưu thơng đến nơi có bệnh, tá dược + Ngưu tất vị đắng, chua, tính bình, có cơng hoạt huyết thơng kinh, mạnh gân cốt, bổ can thận, dẫn thuốc xuống, có vai trị sứ dược 1.1.3 Tác dụng sinh học Có nghiên cứu Tam diệu thang làm giảm đáng kể nồng độ acid uric huyết thông qua ức chế hoạt động enzym xanthine oxidase (XO) gan, giảm mURAT1 (chất vận chuyển urat) thận để giảm hấp thu urat tăng cường tiết urat chuột tăng acid uric máu [30] Bài thuốc Simiao tang gia giảm có chứa vị thuốc Thương truật, Hoàng bá, Ngưu tất, Tri mẫu, ghi nhận cải thiện đáng kể triệu chứng dấu hiệu viêm khớp, gút giảm nồng acid uric protein C máu [26] Ngoài ra, có nghiên cứu tác dụng hạ acid uric huyết cao đặc phương thuốc Tan thống phong chuột thực nghiệm Cao đặc chiết ethanol liều 3,2 g/kg có tác dụng ức chế tăng acid uric huyết thanh, theo chế ức chế enzym XO Cao đặc chiết nước có xu hướng tác dụng mức liều 1,87 g/kg 3,74 g/kg [10] 1.1.4 Định tính, định lượng cao đặc phương thuốc Tan thống phong 1.1.4.1 Định tính vị thuốc cao đặc Tan thống phong : Định tính vị thuốc cao đặc Tan thống phong sắc kí lớp mỏng (SKLM) - ĐT vị thuốc Hoàng bá: quan sát bước sóng 366nm, kết cho thấy sắc ký đồ (SKĐ) cao đặc phương thuốc Tan thống phong chiết nước, chiết ethanol có vết đặc hiệu, tương ứng Rf màu sắc với SKĐ Hoàng bá chuẩn, chất chuẩn BBR mà cao chiết placebo khơng có [10] - ĐT vị thuốc Thương truật: quan sát bước sóng 366nm, kết cho thấy SKĐ cao đặc phương thuốc Tan thống phong chiết ethanol có vết đặc hiệu, tương ứng Rf màu sắc với SKĐ Thương truật chuẩn mà cao chiết placebo khơng có [10] - ĐT vị thuốc Ngưu tất: quan sát ánh sáng thường sau phun thuốc thử vanilin 2% ethanol H2SO4 đặc, kết cho thấy SKĐ cao đặc phương thuốc Tan thống phong chiết nước, chiết ethanol có vết đặc hiệu, tương ứng Rf màu sắc với SKĐ Ngưu tất chuẩn mà cao chiết placebo khơng có [10] - ĐT vị thuốc Hy thiêm: quan sát ánh sáng thường sau phun thuốc thử vanilin 2% ethanol H2SO4 đặc, kết cho thấy SKĐ cao đặc phương thuốc Tan thống phong chiết nước, chiết ethanol có vết đặc hiệu, tương ứng Rf màu sắc với SKĐ Hy thiêm chuẩn mà cao chiết placebo khơng có [10] - ĐT vị thuốc Tri mẫu: quan sát bước sóng 366nm, kết cho thấy SKĐ cao đặc phương thuốc Tan thống phong chiết ethanol có vết đặc hiệu, tương ứng Rf màu sắc với SKĐ Tri mẫu chuẩn mà cao chiết placebo khơng có [10] - ĐT vị thuốc Mộc qua: quan sát bước sóng 366nm, kết cho thấy SKĐ cao đặc phương thuốc Tan thống phong chiết nước có vết đặc hiệu, chiết ethanol có vết đặc hiệu, tương ứng Rf màu sắc với SKĐ Mộc qua chuẩn mà cao chiết placebo khơng có [10] 1.1.4.2 Định lượng BBR cao đặc Tan thống phong: Định lượng hoạt chất BBR cao đặc phương thuốc Tan thống phong phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) Phương pháp định lượng thẩm định có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính từ 11,29 đến 361,23 µg/ml (r=0,9999), độ lặp lại độ xác trung gian tốt (RSD < 3,7 %), độ (tỷ lệ thu hồi đạt 97,77 %100,36 %), LOD LOQ 0,052 µg/ml 0,172 µg/ml [10], [13] Phụ lục 2.5 Kết thực nghiệm mẫu kiểm chứng Mẫu Khối Độ ẩm Diện tích Khối lượng cao cao mẻ (%) pic (mAU.s) chiết (g) Nồng độ Hàm Hiệu lượng (µg/ml) cao ĐL lượng BBR suất chiết (g) (%) BBR (%) KC 8,34 13,51 2183446 0,212 97,34 1,33 74,23 KC 8,54 13 1951471 0,2074 86,78 1,20 69,27 KC 8,54 14,09 2129078 0,2067 94,86 1,34 75,98 PL-4 Phụ lục Phiếu kiểm nghiệm (PKN) chất lượng dược liệu Phụ lục 3.1 PKN dược liệu Hoàng bá PL-5 PL-6 Phụ lục 3.2 PKN dược liệu Thương truật PL-7 PL-8 Phụ lục 3.3 PKN dược liệu Ngưu tất PL-9 PL-10 Phụ lục 3.4 PKN dược liệu Hy thiêm PL-11 Phụ lục 3.5 PKN dược liệu Tri mẫu PL-12 PL-13 Phụ lục 3.6 PKN dược liệu Mộc qua PL-14 PL-15 Phụ lục PKN chất chuẩn BBR PL-16 PL-17 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ NGỌC HUYỀN NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO ĐẶC PHƯƠNG THUỐC TAN THỐNG PHONG THEO HƯỚNG LÀM GIÀU BERBERIN HYDROCHLORID KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2022 ... có nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết xuất để bào chế cao đặc thuốc Tan thống phong cơng bố Chính vậy, đề tài ? ?Nghiên cứu điều chế cao đặc phương thuốc Tan thống phong theo hướng làm giàu berberin. .. trình chiết xuất điều chế cao đặc phương thuốc Tan thống phong quy mơ lớn - Nghiên cứu định tính, định lượng hoạt chất cao đặc Tan thống phong - Nghiên cứu độ ổn định cao đặc thuốc để xác định thời... BBR cao đặc Tan thống phong 20 3.1.1 Kết tính đặc hiệu .20 3.1.2 Kết xây dựng phương trình đường chuẩn BBR 21 3.2 Nghiên cứu điều chế cao đặc phương thuốc Tan thống phong