Trương thị mỹ quyên nghiên cứu chiết xuất flavonoid từ vỏ cây núc nác (oroxylum indicum (l ) vent) khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -  - TRƯƠNG THỊ MỸ QUYÊN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT FLAVONOID TỪ VỎ CÂY NÚC NÁC (OROXYLUM INDICUM (L.) VENT) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -  TRƯƠNG THỊ MỸ QUYÊN Mã sinh viên: 1801587 NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT FLAVONOID TỪ VỎ CÂY NÚC NÁC (OROXYLUM INDICUM (L.) VENT) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Bùi Thị Thúy Luyện Nơi thực hiện: Bộ môn Kỹ thuật Hóa dược Chiết xuất Khoa Cơng nghệ Hóa dược HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp, em nhận quan tâm, giúp đỡ vô quý báu thầy cô bạn bè gia đình Để có thành này, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng sâu sắc đến TS Bùi Thị Thuý Luyện, tổ Chiết xuất - Bộ mơn Kỹ thuật Hóa dược Chiết xuất - Khoa Cơng nghệ Hóa dược tận tình bảo, hướng dẫn đưa lời khuyên giúp em tháo gỡ vướng mắc trình nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi để giúp em hoàn thành đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Phạm Văn Hùng – Bộ môn Công nghiệp Dược – Khoa Bào chế Cơng nghệ dược phẩm giúp đỡ góp ý cho em suốt q trình thí nghiệm Em xin cảm ơn ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội, thầy cô Bộ môn Kỹ thuật Hóa dược Chiết xuất - Khoa Cơng Nghệ Hóa Dược giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn đến bạn sinh viên khóa 73 em sinh viên khóa 74 làm đề tài môn chia sẻ em kinh nghiệm quý báu giúp đỡ em nhiều q trình hồn thành đề tài Và cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người thân gia đình, bạn bè ln giúp đỡ, động viên, quan tâm tạo điều kiện cho em suốt trình học tập nghiên cứu để đạt kết ngày hôm Mặc dù em cố gắng để khóa luận hồn thiện khơng tránh khỏi có sai sót q trình thực Vì vậy, kính mong thầy anh chị bảo, góp ý để khóa luận em hồn thiện Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Trương Thị Mỹ Quyên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG : TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dược liệu núc nác 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.4 Tác dụng sinh học 1.2 Các phương pháp chiết xuất flavonoid ứng dụng núc nác 1.2.1 Phương pháp chiết xuất flavonoid 1.2.2 Các phương pháp chiết xuất flavonoid từ núc nác 1.3 Tổng quan tối ưu hóa 1.3.1 Tối ưu hóa 1.3.2 Các phương pháp tối ưu hóa CHƯƠNG : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tượng nghiên cứu .12 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 12 2.1.2 Thiết bị, hóa chất, phần mềm nghiên cứu 12 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 13 2.3.1 Phương pháp định lượng xác định tổng lượng flavonoid toàn phần chiết từ vỏ núc nác 13 2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng .13 2.3.3 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp dung môi chiết xuất phù hợp 14 2.3.4 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất flavonoid từ vỏ thân núc nác 15 CHƯƠNG : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .18 3.1 Kết xây dựng thẩm định phương pháp xác định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết từ vỏ thân núc nác .18 3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc C0 18 3.1.2 Thẩm định phương pháp xác định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết từ vỏ núc nác .18 3.2 Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất flavonoid từ vỏ thân núc nác sử dụng phương pháp thay đổi yếu tố (OFAT) 21 3.2.1 Khảo sát phương pháp chiết 21 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ ethanol 23 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian chiết xuất .24 3.2.4 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi dược liệu (tỷ lệ DM/DL) 25 3.3 Kết tối ưu hóa trình chiết xuất flavonoid từ vỏ thân núc nác sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 26 3.3.1 Quy hoạch thực nghiệm 26 3.3.2 Mối quan hệ biến đầu vào biến đầu 27 3.3.3 Xác định không gian thiết kế 30 3.3.4 Lựa chọn điều kiện chiết xuất tối ưu .33 3.4 Xây dựng quy trình chiết xuất đánh giá độ ổn định quy trình 34 3.5 Bàn luận 35 3.5.1 Về phương pháp định lượng flavonoid tổng 35 3.5.2 Về yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất flavonoid tổng từ vỏ núc nác 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU Phần viết đầy đủ STT Phần viết tắt ALT Alanin transaminase ANN Mạng neuron nhân tạo (Artificial Neural Network) ANOVA AOAC AST Aspart transaminase CCO Thiết kế hỗn hợp tâm trực giao (Orthogonal Central Composite Design) DM/DL DoE DPPH 10 IC50 Nồng độ ức chế 50% 11 KGTK Không gian thiết kế 12 OFAT Phương pháp khảo sát thay đổi yếu tố (One factor at a time) 13 PGE2 Prostaglandin E2 14 PLS Hồi quy bình phương tối thiểu phần (Partial Least Squares regression) 15 RSD 16 RSM 17 STT Phương pháp phân tích phương sai (Analysis of variance) Association of Official Analytical Chemists Tỷ lệ dung môi - dược liệu Thiết kế thí nghiệm (Design of Experiments) 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology) Số thứ tự DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Tên bảng biểu Trang Bảng 1.1 Cấu trúc số hợp chất flavonoid vỏ núc nác Bảng 2.1 Danh sách các hóa chất 12 Bảng 3.1 Kết thẩm định độ phù hợp hệ thống phương pháp định lượng 18 Bảng 3.2 Kết đo độ hấp thụ dãy dung dịch chuẩn C1 đến C5 19 Bảng 3.3 Kết thẩm định độ phương pháp định lượng 20 Bảng 3.4 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp định lượng 20 Bảng 3.5 Kết khảo sát xác trung gian phương pháp định lượng 21 Bảng 3.6 Các biến đầu vào lựa chọn quy hoạch thực nghiệm 27 Bảng 3.7 Các công thức thiết kế quy hoạch thực nghiệm kết giá trị thực nghiệm các biến đầu 27 Bảng 3.8 Phân tích phương sai (ANOVA) cho hiệu suất chiết flavonoid 28 Bảng 3.9 Phân tích hệ số hồi quy hiệu suất chiết flavonoid 29 Bảng 3.10 Kết kiểm định không gian thiết kế 31 Bảng 3.11 Kết thẩm định mơ hình thực nghiệm 33 Bảng 3.12 Kết nâng cấp quy mô chiết xuất 34 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Tên hình vẽ, sơ đồ Trang Hình 1.1 Hình ảnh núc nác Hình 1.2 Sơ đồ các bước tối ưu hóa quá trình chiết xuất sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 11 Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu vỏ núc nác 12 Hình 2.2 Sơ đồ Ishikawa cho quy trình chiết flavonoid 15 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan độ hấp thụ nồng độ quercetin 19 Hình 3.2 Kết khảo sát phương pháp chiết 22 Hình 3.3 Kết khảo sát nồng độ ethanol 23 Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian chiết xuất đến hiệu suất chiết flavonoid 25 Hình 3.5 Ảnh hưởng tỷ lệ dung mơi – dược liệu đến hiệu suất chiết flavonoid 25 Hình 3.6 Ảnh hưởng tương tác các cặp yếu tố đầu vào đến hiệu suất chiết flavonoid 30 Hình 3.7 Không gian thiết kế xây dựng từ mô hình 32 Hình 3.8 Sơ đồ quy trình chiết flavonoid tổng từ vỏ thân núc nác 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Núc nác (Oroxylum indicum (L.) Vent) loài dược liệu tìm thấy nhiều nơi Việt Nam giới, đặc biệt Nam Á, Đông Nam Á Trung Quốc [2] Trong nhiều kỷ, núc nác dùng loại thảo dược quan trọng nhiều nước châu Á để điều trị bệnh khác nhau, đặc biệt phận vỏ [37] Từ lâu vỏ núc nác sử dụng thuốc cổ truyền vị thuốc dùng để chữa bệnh tiêu chảy, kiết lỵ, đau dày, viêm nhiễm đường tiết niệu, tiểu buốt, tiểu máu, ho, viêm họng [5] Các nghiên cứu dược lý học đại cho thấy vỏ núc nác có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống ung thư, bảo vệ dày, bảo vệ gan [13], [23], [24], [26], [27], [28] Và hầu hết nghiên cứu đánh giá độc tính cho thấy núc nác không gây độc cho người động vật thí nghiệm kể dùng với liều cao [37] Thành phần vỏ thân núc nác bao gồm flavonoid, tannin, alcaloid, saponin, lignin, chất béo [50] Trong đó, nhóm chất flavonoid chứng minh thành phần tạo tác dụng sinh học sản phẩm chiết từ vỏ núc nác [36] Với nhiều tác dụng dược lý quan trọng mức độ an tồn sử dụng flavonoid vỏ núc nác nguồn hoạt chất tiềm để định hướng phát triển sản phẩm phục vụ cho nhiệm vụ chăm sóc sức khỏe người dân Bởi vậy, việc xây dựng quy trình chiết xuất flavonoid từ vỏ núc nác để đạt hiệu suất tối đa cần thiết, từ góp phần cung cấp sở khoa học cho việc định hướng khai thác dược liệu cách hiệu Cho đến nay, nhiều nghiên cứu giới Việt Nam chiết tách, tinh chế, định lượng flavonoid vỏ núc nác tiến hành [21], [26], [50], [51] Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng điều kiện chiết xuất lên hiệu suất chiết flavonoid tổng từ vỏ núc nác Do đề tài “Nghiên cứu chiết xuất flavonoid từ vỏ núc nác (Oroxylum indicum (L.) Vent)” thực với hai mục tiêu: Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng tối ưu hóa điều kiện chiết xuất flavonoid tổng từ vỏ núc nác Đề xuất quy trình chiết xuất flavonoid tổng từ vỏ núc nác quy mô 50g/mẻ CHƯƠNG : TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dược liệu núc nác 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố Vị trí phân loại [7]: Ngành Ngọc Lan (Mangnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Mangnoliopsida) Phân lớp Bạc Hà (Lamidae) Bộ Hoa Mõm Chó (Scrophulariales) Họ Chùm ớt (Bignoniaceae) Chi Oroxylum Tên đầy đủ: Oroxylum indicum (L.) Vent Hình 1.1: Hình ảnh núc nác 1.1.1.1 Đặc điểm thực vật Cây cao – 12 m, cao tới 20 – 25 m, thân nhẵn, phân nhánh Vỏ màu xám tro, mặt màu vàng Lá xẻ – tầng lông chim Lá chét hình bầu dục, nguyên, đầu nhọn, dài 7,5 – 15 cm, rộng – 6,5 cm Hoa màu nâu đỏ sẫm mọc thành chùm dài đầu cành, dài khoảng 10 cm, nhị có nhị nhỏ Quả nang to, dài tới 50 – 80 cm, rộng – cm, bên chứa hạt, bao quanh có màng mỏng, bóng trong, hình chữ nhật [2] 1.1.1.2 Phân bố Cây núc nác mọc hoang trồng khắp nơi Việt Nam, miền Bắc miền Nam Cây mọc Trung Quốc, Malaysia, Ấn Độ, Lào, Campuchia [2] 1.1.2 Thành phần hóa học ➢ Vỏ thân Vỏ thân núc nác chứa: flavonoid, tannin, sterol với nồng độ trung bình; alcaloid, saponin, lignin, chất béo dầu với nồng độ thấp [50] Trong flavonoid thành phần gồm chrysin 0,35%; baicalein 0,5%; oroxylin A 0,65%;… [5] ➢ Vỏ rễ Vỏ rễ núc nác chứa flavonoid, alkaloid, glycosid, tannin, sterol, phenol, lignin saponin [50] Trong có oroxylin A chiếm 0.86%, naphtalen, 3-methoxy-6,7dohydroxy flavon acid ellagic (1 kg vỏ rễ cho 100 ng ellagic) [5] ➢ Lá Lá núc nác chứa flavonoid: Chrysin, oroxylin A, scutellarin baicalein [53], baicalein-7-O-glucosid, baicalein-7-O-diglucosid, baicalein-7-O-glucuronid, chrysin-7-O-glucuronid chrysin-diglucosid [55], [56] Bảng 3.9: Phân tích hệ số hồi quy hiệu suất chiết flavonoid Hiệu suất (Y) Hệ số Độ lệch chuẩn p Khoảng tin cậy Hằng số 82,0139 1,92378 1,01968e-09 4,54908 Thời gian (X1) 3,81808 0,926637 0,00445753 2,19118 Độ cồn (X2) 1,31995 0,926636 0,197332 2,19118 Tỷ lệ DM/DL (X3) 3,94388 0,926637 0,00376457 2,19118 X1*X1 -1,31202 1,04334 0,248893 2,46714 X2*X2 -2,55912 1,04334 0,043926 2,46714 X3*X3 -0,688508 1,04334 0,53042 2,46715 X1*X2 0,309206 0,955156 0,755605 2,25861 X1*X3 1,35574 0,955156 0,198747 2,25861 X2*X3 -0,689765 0,955156 0,493615 2,25861 Độ tin cậy = 0,95 Dữ liệu bảng 3.9 cho thấy giá trị p X1, X3 X22 < 0,05 chứng tỏ thời gian chiết (X1), độ cồn (X2), tỷ lệ DM/DL (X3) có ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê tới hiệu suất chiết flavonoid Ngoài ra, biến thiên biến đầu theo giá trị biến đầu vào thể hình 3.6 Hình 3.6 cho thấy ảnh hưởng tương tác nồng độ ethanol tỷ lệ dung môi dược liệu, tương tác thời gian chiết tỷ lệ dung môi – dược liệu, tương tác nồng độ ethanol thời gian chiết liệu lên hiệu suất chiết flavonoid Theo giá trị p > 0,05 bảng 3.9 cho thấy ba cặp tương tác khơng có ý nghĩa mặt thống kê Hình 3.6a cho thấy chiết thời gian tỷ lệ dung mơi – dược liệu tăng đến 18/1 hiệu suất chiết không tăng tăng nồng độ ethanol Khi tăng nồng độ ethanol từ 70% hiệu suất chiết có xu hướng giảm nhẹ tỷ lệ dung mơi – dược liệu cao 13/1 Có thể lí giải do, cồn thấp độ, nước dung môi có tác dụng làm trương nở dược liệu, làm cho dung dễ thấm sâu vào dược liệu, tăng diện tích tiếp xúc khả khuếch tán flavonoid Khi nồng độ ethanol cao làm đông tụ protein polysaccharid bề mặt tế bào làm hạn chế khả thấm dung môi chiết vào tế bào làm giảm tốc độ khuếch tán hoạt chất Hình 3.6b cho thấy chiết với nồng độ ethanol tăng thời gian chiết tăng tỷ lệ dung môi – dược liệu hiệu suất chiết tăng nhẹ Hình 3.6c cho thấy thời gian chiết tỷ lệ dung môi – dược liệu tăng nồng độ ethanol hiệu suất chiết tăng khơng đáng kể chí cịn giảm nồng độ ethanol lớn 75% 29 a Nồng độ ethanol tỷ lệ dung môi dược liệu b Thời gian chiết tỷ lệ dung môi – dược liệu c Nồng độ ethanol thời gian chiết Hình 3.6: Ảnh hưởng tương tác cặp yếu tố đầu vào đến hiệu suất chiết flavonoid 3.3.3 Xác định khơng gian thiết kế Để tính tốn khơng gian thiết kế quy trình chiết flavonoid, giá trị tối thiểu hiệu suất chiết flavonoid đặt 80% Không gian thiết kế tạo cách sử 30 dụng mơ hình thiết lập mục 2, từ thu KGTK (xác suất thất bại < 1%) theo biến thời gian, độ cồn, tỷ lệ DM/DL thể hình 3.7 Kiểm định KGTK: Kiểm chứng độ xác khơng gian thiết kế trình chiết flavonoid cách thực thí nghiệm tám điểm khơng gian thiết kế điểm ngồi khơng gian thiết kế Kết thí nghiệm thể bảng 3.10 Bảng 3.10: Kết kiểm định không gian thiết kế STT X1 (phút) 35 35 55 55 55 55 35 35 20 Y (%) Độ xác Đạt u Thực Mơ (%) cầu tế hình Điểm nằm khơng gian thiết kế 65 17,5 85,26 83,86 98,33 Đạt 65 21,5 87,61 86,94 99,23 Đạt 65 17,5 88,66 86,35 97,33 Đạt 65 21,5 88,92 90,92 97,79 Đạt 75 17,5 89,96 87,95 97,71 Đạt 75 21,5 93,09 91,77 98,56 Đạt 75 17,5 85,00 85,04 97,29 Đạt 75 21,5 89,44 87,37 97,63 Đạt Điểm nằm ngồi khơng gian thiết kế 60 14 71,43 73,52 97,15 Không đạt X2 (%) X3 (mL/g) Theo kết bảng 3.10, với thời gian chiết từ 35 – 55 phút, nồng độ ethanol từ 65 – 75%, tỷ lệ dung môi – dược liệt từ 17,5 – 21,5 mL/g thực nghiệm cho kết gần với dự đoán phần mềm Độ xác hiệu suất chiết flavonoid 97% Các thí nghiệm thực khơng gian thiết kế thí nghiệm từ - bảng 3.10 Theo KGTK mơ hình, thí nghiệm dự đoán có xác suất thất bại 1% kết thực nghiệm thu thí nghiệm thỏa mãn điều kiện nêu trước (hiệu suất chiết ≥80%) Thí nghiệm bảng 3.10 điểm nằm ngồi KGTK, dự đoán xác suất thất bại 100% Sau thực nghiệm, thu kết không thỏa mãn điều kiện với hiệu suất chiết đạt 71,43% (< 80%) Như vậy, thấy kết thực nghiệm phù hợp với dự đoán KGTK Kết luận KGTK xác định có độ tin cậy cao Việc xác định không gian thiết kế thay cho xác định điểm (tức điều kiện chiết xuất) mang lại tính linh hoạt việc cải tiến nâng cấp quy trình chiết bước nghiên cứu Phạm vi hoạt động biến lựa chọn không gian thiết kế sau: thời gian chiết 35 – 55 phút, nồng độ ethanol 65 – 75%, tỷ lệ dung môi – dược liệu 17,5 – 21,5 mL/g 31 Hình 3.7: Khơng gian thiết kế xây dựng từ mơ hình 32 3.3.4 Lựa chọn điều kiện chiết xuất tối ưu Sau xác định quy luật phụ thuộc biến đầu theo biến đầu vào, tiến hành tìm kiếm cơng thức tối ưu phần mềm MODDE Pro 12 với mục tiêu biến đầu đạt giá trị cao Cơng thức tối ưu chọn cơng thức có giá trị log(D) thấp tỷ lệ thất bại nhỏ Giá trị tối ưu tìm biến đầu vào là: − Nồng độ ethanol: 70,9 % − Thời gian chiết xuất: 46,24 phút − Tỷ lệ dung môi - dược liệu: 19,06 mL/g Và giá trị dự đoán tương ứng biến đầu là: 88,88% • Thẩm định mơ hình: Điều kiện thẩm định vừa đảm bảo gần với mơ hình vừa phù hợp với thực tế lựa chọn sau: − Nồng độ ethanol: 71 % − Thời gian chiết xuất: 46 phút − Tỷ lệ dung môi - dược liệu: 19 mL/g Tiến hành thí nghiệm điều kiện tối ưu lần thu kết trình bày bảng 3.11 Bảng 3.1: Kết thẩm định mô hình thực nghiệm Dự đốn Độ xác (%) RSD (%) 88,80 98,50 1,49 Thực nghiệm Thông số Hiệu suất chiết (%) Lần Lần Lần Trung bình 90,48 88,65 91,27 90,13 Nhận xét: Ta thấy giá trị RSD hiệu suất chiết flavonoid sau lần chiết nhỏ (1,49% < 5%) cho thấy khơng có khác biệt lần chiết Vì quy trình có tính ổn định Với độ xác cao (98,5 %), mơ hình có khả dự đoán tương đối xác hiệu suất chiết flavonoid tổng so với thực nghiệm Sau có kết tối ưu các thông số lần chiết, tiến hành khảo sát số lần chiết với điều kiện lần trên, thực thí nghiệm lặp lại lần Thu kết sau: − Hiệu suất chiết lần 1: 89,01 ± 3,67 (%) − Hiệu suất chiết lần 2: 7,38 ± 1,92 (%) − Hiệu suất chiết lần 3: 1,35 ± 0,24 (%) Nhìn vào kết có nhận xét: Hiệu suất chiết flavonoid qua lần giảm dần, đến lần chiết thứ 1,35% Tổng hiệu suất lần chiết 96,39% không khác biệt 33 nhiều so với lần (97,74%), cần dừng lại lần chiết để tiết kiệm thời gian lượng dung môi sử dụng 3.4 Xây dựng quy trình chiết xuất đánh giá độ ổn định quy trình Quy trình chiết xuất xây dựng dựa mơ hình chiết xuất tối ưu tìm cụ thể sau: dược liệu vỏ núc nác sấy khơ làm nhỏ đến kích thước khoảng 2-4 mm, đem chiết hồi lưu lần với lần sử dụng dung môi ethanol 71% tỷ lệ dung môi – dược liệu 19 mL/g thời gian 46 phút Lọc thu dịch chiết, cô dịch chiết thu hồi dung môi áp suất giảm, cô cách thủy đến cắn sấy nhiệt độ 55oC thời gian 48 tủ sấy tĩnh thu sản phẩm cao khô núc nác Sơ đồ quy trình chiết xuất flavonoid từ vỏ núc nác tóm tắt hình 3.8: Hình 3.8: Sơ đồ quy trình chiết flavonoid tổng từ vỏ thân núc nác Tiến hành chiết xuất với quy mô nâng cấp gấp 10 lần so với quy mô khảo sát ban đầu theo quy trình hình 3.8 Sản phẩm thu cao khơ núc nác có màu nâu sẫm, dễ hút ẩm; có hàm ẩm 2,92%; hiệu suất chiết cao 26,16% hàm lượng flavonoid tổng cao 8,81% (tính theo khối lượng quercetin) Kết nâng cấp quy mô so với quy mô ban đầu trình bày bảng 3.12 Bảng 3.12: Kết nâng cấp quy mô chiết xuất Quy mô chiết xuất (50g/mẻ) Thông số Hiệu suất chiết flavonoid (%) Mẻ Mẻ Mẻ Trung RSD bình (%) 88,13 86,3 89,44 87,96 34 1,79 Quy mô chiết xuất ban đầu (5g/mẻ) Độ tương đồng (%) 90,13 97,56 Nhận xét: Giá trị RSD mẻ chiết nhỏ (< 5%), cho thấy quy trình chiết xuất có tính ổn định độ tương đồng hiệu suất flavonoid toàn phần chiết quy trình quy mơ ban đầu quy mô nâng cấp đạt mức cao 97,56% Độ tương đồng cao quy mô nâng cấp so với quy mơ ban đầu tính ổn định cao cho thấy quy trình chiết xuất xây dựng có tính khả thi để nâng cấp đến quy mơ lớn 3.5 Bàn luận 3.5.1 Về phương pháp định lượng flavonoid tổng Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử tử ngoại - khả kiến dùng để định lượng flavonoid tổng vỏ thân núc nác xây dựng dựa sở tham khảo tài liệu thẩm định tiêu như: độ thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ lặp lại độ Với điều kiện thực khơng q phức tạp, sử dụng hóa chất thơng dụng, thiết bị dụng cụ đơn giản, thao tác thực nhanh chóng, dễ dàng triển khai phịng thí nghiệm Việt Nam, kết thẩm định đáp ứng yêu cầu phép định lượng Tuy nhiên, phương pháp có sai số cần phải ý thực phản ứng tạo màu có thời gian ủ ngắn phút sau thêm NaNO2 phút sau thêm AlCl3 3.5.2 Về yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất flavonoid tổng từ vỏ núc nác Quy trình chiết xuất hoạt chất từ dược liệu chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố: nguyên liệu sử dụng, dung môi chiết xuất, kỹ thuật, phương tiện thực trình chiết xuất Ở nghiên cứu này, chúng tơi khảo sát yếu tố phương pháp chiết, thời gian chiết, dung môi chiết xuất nồng độ ethanol, tỷ lệ dung môi - dược liệu số lần chiết xuất Phương pháp chiết xuất sử dụng chiết hồi lưu, cách tiến hành đơn giản với dung môi hỗn hợp ethanol nước cất, dung mơi thân thiện với mơi trường ứng dụng sản xuất công nghiệp để đạt hiệu chiết xuất tối đa với dược liệu vỏ núc nác Nhiều nghiên cứu chứng minh khả làm tăng hàm lượng flavonoid dịch chiết sử dụng phương pháp chiết hồi lưu so với phương pháp khác [33], [49] Và trình khảo sát phương pháp chiết cho kết phương pháp chiết hồi lưu cho hiệu suất chiết flavonoid vỏ thân núc nác cao hẳn so với các phương pháp chiết ngâm chiết siêu âm Vì ứng dụng phương pháp chiết hồi lưu sản xuất công nghiệp để đạt hiệu chiết xuất tối đa với dược liệu vỏ thân núc nác Việc thực thiết kế thí nghiệm tối ưu hoá, xác định không gian thiết kế bước quan trọng thiết yếu nghiên cứu phát triển nhằm cải tiến kiểm soát quy trình chiết xuất Có hai phương pháp thiết kế thí nghiệm tối ưu hoá 35 phương pháp dựa hàm mục tiêu dạng đa thức bậc ≤ phương pháp dựa mạng neuron nhân tạo Trong hai phương pháp phương pháp dựa mạng neuron nhân tạo chứng minh tính hiệu xử lý tốn phức tạp có sở liệu lớn Tuy nhiên, lựa chọn phương pháp dựa hàm mục tiêu dạng đa thức bậc ≤ để áp dụng đề tài với toán cụ thể biểu thị ảnh hưởng thời gian, dung môi tỷ lệ dung mơi – dược liệu tới q trình chiết xuất, phương pháp dựa hàm mục tiêu có ưu điểm cách thức xây dựng mơ hình đơn giản biểu thị dạng phương trình cụ thể Việc sử dụng phần mềm thơng minh tối ưu hóa giúp giảm thời gian, chi phí số lần thực thí nghiệm Ngồi việc xác định điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất flavonoid tử vỏ núc nác chúng thơi cịn tìm khơng gian thiết kết cho hiệu suất chiết flavonoid ≥ 80% với khoảng giá trị biến phụ thuộc Kiểm chứng mơ hình tám điểm điểm KGTK cho thấy kết thu có độ xác cao so với dự đoán chứng tỏ mơ hình xây dựng có độ tin cậy cao Việc xác định KGTK thay cho xác định điểm (hay điều kiện chiết xuất) tối ưu mang lại tính linh hoạt việc cải tiến nâng cấp quy trình chiết xuất các bước nghiên cứu 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết thu được, ta đến kết luận: Đã khảo sát ảnh hưởng yếu tố nồng độ ethanol, tỷ lệ dung môi dược liệu, thời gian chiết xuất đến hiệu suất chiết flavonoid tổng chiết flavonoid từ vỏ núc nác (Oroxylum indicum (L.) Vent) phương pháp chiết hồi lưu thể qua phương trình có dạng: 𝑌 = 82,0139 + 3,8181𝑋1 + 3,9439𝑋3 − 2,5591𝑋22 Trong đó: X1: thời gian chiết (phút) X2: nồng độ ethanol (%) X3: tỷ lệ DM/DL (mL/g) Từ tìm điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất flavonoid từ vỏ núc nác phương pháp chiết hồi lưu xác định sau: − Nồng độ ethanol: 71 % − Thời gian chiết xuất: 46 phút − Tỷ lệ dung môi - dược liệu: 19 mL/g − Số lần chiết: lần Đã đề xuất quy trình chiết xuất flavonoid tổng từ vỏ núc nác quy mô 50g/mẻ Kết hiệu suất chiết flavonoid hàm lượng flavonoid cao thu sau: − Hiệu suất chiết flavonoid: 87,96% − Hàm lượng flavonoid tổng cao: 8,81% KIẾN NGHỊ Nghiên cứu các phương pháp tinh chế làm giàu flavonoid nhằm tăng hàm lượng flavovoid cao chiết, tăng giá trị kinh tế sản phẩm Nâng cấp quy trình chiết xuất flavonoid từ vỏ núc nác lên quy mô lớn quy mô pilot, mẻ 100 kg dược liệu,… 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ y tế (2010), Dược liệu học tập 1, Nhà xuất Y học, Hà Nội., pp 353-399 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 727-729 Nguyễn Văn Hân (2017), Kỹ thuật chiết xuất dược liệu, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 135 Trần Văn Linh (2012), Một số phương pháp thiết kế thí nghiệm tối ưu hố ứng dụng bào chế, Đại học Dược Hà Nội, tr 3-5 Viện Dược Liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa Học Kĩ Thuật, Hà Nội, tr 480-484 TIẾNG ANH Appendix F: Guidelines for standard method performace requirements, in Official Methods of Analysis of AOAC International 22nd Edition 2023, Oxford University Press p Al Bojian Bao Et (2003), Flora of China, pp 204 Aman Upaganlawar, Burle Sushil, et al (2009), "In vitro antioxidant and preliminary hepatoprotective activity of Oroxylum indicum Vent leaf extracts", Pharmacologyonline, 1, pp 35-43 Babu Hari, Pujar Manjulatha, et al (2009), "Gastroprotective flavonoid constituents from Oroxylum indicum Vent", Bioorganic & medicinal chemistry letters, 20, pp 117-20 10 11 12 13 14 Begum M M., Islam A., et al (2019), "Ethnopharmacological Inspections of Organic Extract of Oroxylum indicum in Rat Models: A Promising Natural Gift", Evid Based Complement Alternat Med, 2019 Buranrat B., Noiwetch S., et al (2020), "Inhibition of cell proliferation and migration by Oroxylum indicum extracts on breast cancer cells via Rac1 modulation", Journal of Pharmaceutical Analysis, 10(2), pp 187-193 Costa-Lotufo L V., Khan M T., et al (2005), "Studies of the anticancer potential of plants used in Bangladeshi folk medicine", Journal of Ethnopharmacology, 99(1), pp 21-30 Das Sudipta, Duttachoudhury Manabendra (2010), "Antimicrobial Activity of Stem Bark Extracts from the Plant Oroxylum indicum Vent", Assam University Journal of Science and Technology, 5, pp 95-99 Daud M N H., Fatanah D N., et al (2017), "Evaluation of antioxidant potential of Artocarpus heterophyllus L J33 variety fruit waste from different extraction methods and identification of phenolic constituents by LCMS", Food Chem, 232, pp 621-632 15 Dias M C., Pinto Dcga, et al (2021), "Plant Flavonoids: Chemical Characteristics and Biological Activity", Molecules, 26(17), pp 5377 16 Doshi K., Ilanchezhian R., et al (2012), "Anti-inflammatory activity of root bark and stem bark of Shyonaka", Journal of Ayurveda and Integrative Medicine, 3(4), pp 194-7 17 Dunkhunthod B., Talabnin C., et al (2020), "Intracellular ROS Scavenging and Anti-Inflammatory Activities of Oroxylum indicum Kurz (L.) Extract in LPS plus IFN-γ-Activated RAW264.7 Macrophages", Evid Based Complement Alternat Med, 2020 18 Harmonization International Conference on (1996), "Topic Q2B: Validation of Analytical Procedures and Methodology", ICH Harmonised Tripartite Guideline, pp 71-76 19 Harmonization International Conference on (1994), "Topic Q2A: Validation of Analytical Methods: Definitions and Terminology", ICH Harmonised Tripartite Guideline, pp 68-70 Islam Mohammad Kaisarul, Eti I., et al (2010), "Phytochemical and Antimicrobial Analysis on the Extracte of Oroxylum indicum Linn Stem-Bark", Iranian Journal of Pharmacology and Therapeutics, 9, pp 25-28 20 21 22 23 24 25 Kamkaen Narisa, Wilkinson Jenny, et al (2006), "Cytotoxic Effect of Four Thai Edible Plants on Mammalian Cell Proliferation", Thai Pharmaceutical and Health Science Journal, 1, pp 189-195 Karnati M., Chandra R H., et al (2013), "Anti-arthritic activity of root bark of Oroxylum indicum (L.) vent against adjuvant-induced arthritis", Pharmacognosy Res, 5(2), pp 121-8 Kumar Vimal, Gogoi B., et al (2009), "Determining the antioxidant activity of certain medicinal plants of Sonitpur, (Assam), India using DPPH assay", Journal of Phytology, 1, pp 49-56 Lalrinzuali K., Vabeiryureilai M., et al (2016), "Investigation of the AntiInflammatory and Analgesic Activities of Ethanol Extract of Stem Bark of Sonapatha Oroxylum indicum In Vivo", International Journal of Inflammation, 2016 Mishra S L., Sinhamahapatra P K., et al (2010), "In vitro Antioxidant Potential of Different Parts of Oroxylum indicum: A Comparative Study", Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 72(2), pp 267-9 26 Naveen Kumar D R., Cijo George V., et al (2012), "Cytotoxicity, apoptosis induction and anti-metastatic potential of Oroxylum indicum in human breast 27 cancer cells", Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 13(6), pp 2729-34 Panda S K (2011), "Phytochemical Analysis and Hepatoprotective Effect of Stem Bark of Oroxylum indicum (L) Vent on Carbon Tetrachloride Induced Hepatotoxicity in Rat", International Journal of Pharmaceutical & Biological Archives, 2, pp 1714-1717 28 Shetgiri P P., Darji Kamil, et al (2010), "Evaluation of Antioxidant and Antihyperlipidemic Activity Of extracts Rich in Polyphenols", International Journal of Phytomedicine, 2, pp 267-276 29 Siriwatanametanon Nisarat, Fiebich Bernd L., et al (2010), "Traditionally used 30 Thai medicinal plants: In vitro anti-inflammatory, anticancer and antioxidant activities", Journal of Ethnopharmacology, 130(2), pp 196-207 Thiagarajan Kalaivani, Mathew Lazar (2009), "Phytochemistry and Free radical 31 32 33 34 35 36 37 38 scavenging activities of Oroxylum indicum", International Journal of Environmental Science and Technology, 4, pp 45-52 Tran Thi Van Anh, Malainer Clemens, et al (2015), "Screening of Vietnamese medicinal plants for NF-κB signaling inhibitors: Assessing the activity of flavonoids from the stem bark of Oroxylum indicum", Journal of Ethnopharmacology, 159, pp 36-42 Yan K., Cheng X J., et al (2022), "The Influence of Different Extraction Techniques on the Chemical Profile and Biological Properties of Oroxylum indicum: Multifunctional Aspects for Potential Pharmaceutical Applications", Evid Based Complement Alternat Med, 2022 A Khoddami M A Wilkes, and T H Roberts (2013), "Techniques foranalysis of plant phenolic compounds", Molecules, 18, pp 2328-2375 Chávez Mónica L., Sepúlveda Leonardo, et al (2020), "Conventional and Emerging Extraction Processes of Flavonoids", Processes, 8, pp 1-29 Czitrom Veronica (1999), "One-Factor-at-a-Time versus Designed Experiments", The American Statistician, 53(2), pp 126-131 Dev Lawania Rahul, Anurag Mishra, et al (2010), "Oroxylum indicum: A Review", Pharmacognosy Journal, 2(9), pp 304-310 Dinda B., SilSarma I., et al (2015), "Oroxylum indicum (L.) Kurz, an important Asian traditional medicine: From traditional uses to scientific data for its commercial exploitation", Journal of Ethnopharmacology, 161, pp 255-278 Dinda Biswanath, Mohanta B C., et al (2007), "Flavonoids from the stem-bark of Oroxylum indicum", Natural Product Sciences, 13, pp 190-194 39 Doloking Haeria, Mukhriani Mukhriani, et al (2022), "Flavonoids: A Review on Extraction, Identification, Quantification, and Antioxidant Activity", ad-Dawaa 40 Journal of Pharmaceutical Sciences, 5, pp 26-51 Feng Wei-sheng, Zhiyou Hao, et al (2017), "Isolation and Structure Identification of Flavonoids", Flavonoids, pp 41 42 Gupta R C., Sharma Vivek, et al (2008), "In vitro Antioxidant Activity from Leaves of Oroxylum indicum (L.) Vent - A North Indian Highly Threatened and Vulnerable Medicinal Plant", Journal of Pharmacy Research, 1, pp 65-72 Harminder, Singh V., et al (2011), "A Review on the Taxonomy, Ethnobotany, Chemistry and Pharmacology of Oroxylum indicum Vent", Indian journal of pharmaceutical sciences, 73, pp 483-90 43 44 45 Injac Rade, Boskovic Marija, et al (2008), "Comparative study of robustness between micellar electrokinetic capillary chromatography and high-performance liquid chromatography using one-variable-at-a-time and a new multi-variable-ata-time approach", Analytica Chimica Acta, 620(1), pp 150-161 Kansal Sushil Kumar, Singh M., et al (2007), "Parametric optimization of photocatalytic degradation of catechol in aqueous solutions by response surface methodology", Indian Journal of Chemical Technology, 14, pp 145-153 Laloo Deiwitawan, Gogoi Barnali, et al (2016), "Antioxidant, Analgesic and Anti-inflammatory Activities of Bark of Oroxylum indicum Vent: An Endemic Medicinal Plant of Northeast India", Asian Journal of Chemistry, 28, pp 22722276 46 47 48 49 Mairuae Nootchanat, Connor James R, et al (2019), "Oroxylum indicum (L.) extract protects human neuroblastoma SH‑SY5Y cells against β‑amyloid‑induced cell injury", Molecular medicine reports, 20(2), pp 19331942 Mohapatra Sushree Sangita, Roy R K., et al (2018), "Phytochemical Analysis and Hepatoprotective Effect of Hydroethanolic Extract of Stem Bark of Oroxylum indicum", International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 7, pp 1000-1006 Myers R H., Montgomery D C., et al (2016), Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments Rahmiyani Ira, Ruswanto Ruswanto, et al (2020), Influence of Extraction Method to Total Flavonoid Content of Mareme Leaf Extract (Glochidion arborescens Blume), 2nd Bakti Tunas Husada-Health Science International Conference (BTH-HSIC 2019), pp 57-60 50 Samatha T., Srinivas P., et al (2012), "Phytochemical analysis of seeds, stem bark and root of an endangered medicinal forest tree OROXYLUM INDICUM(L)kurz", International Journal of Pharma and Bio Sciences, 3, pp 1063-1075 51 Samatha Talari, Shyamsundarachary Rudroju, et al (2012), "Quantification of total phenolic and total flavonoid contents in extracts of Oroxylum indicum L Kurz", Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 5(4), pp 177- 52 179 Subramanian S S., Nair A G R (1972), "Flavonoids of the stem bark of Oroxylum indicum", Current Science, 41(2), pp 62-63 53 Subramanian S Sankara, Nair A G Ramachandran (1972), "Flavonoids of the 54 leaves of Oroxylum indicum and Pajanelia longifolia", Phytochemistry, 11, pp 439-440 Yu Miao, Wang Bing, et al (2019), "Response surface method was used to 55 56 57 58 59 optimize the ultrasonic assisted extraction of flavonoids from Crinum asiaticum", Saudi Journal of Biological Sciences, 26(8), pp 2079-2084 Yuan Yuan, Hou Wenli, et al (2008), "Separation of Flavonoids from the Leaves of Oroxylum indicum by HSCCC", Chromatographia, 68(11), pp 885-892 Yuan Yuan, Luo Houding, et al (2008), "Linear scale-up of the separation of active components from Oroxylum indicum using high-speed counter-current chromatography", Chinese Journal of Chromatography, 26(4), pp 489-493 Zaveri Maitreyi, Jain Sunita (2007), "Gastroprotective Effects of Root Bark of Oroxylum indicum, Vent", Journal of Natural Remedies, 7(2), pp 269-277 Zaveri Maitreyi, Sunita J (2010), "Anti-inflammatory and analgesic activity of root bark of Oroxylum indicum, vent", Journal of Global Pharma Technology, 2, pp 79-87 Zhishen Jia, Mengcheng Tang, et al (1999), "The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals", Food Chemistry, 64(4), pp 555-559 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết khảo sát phương pháp chiết ảnh hưởng đến hiệu suất chiết flavonoid tử vỏ núc nác Phương pháp Ngâm nhiệt độ phịng Ngâm nóng 80oC Siêu âm nhiệt độ phòng Siêu âm 80oC Chiết hồi lưu Hiệu suất chiết flavonoid (%) 14,02 20,19 28,47 62,78 74,27 Phụ lục 2: Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất flavonoid từ vỏ núc nác sử dụng phương pháp thay đổi yếu tố (OFAT) Bảng 1: Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol Nồng độ ethanol (%) 40 50 60 70 80 96 Hiệu suất chiết flavonoid (%) 51,85 68,03 73,56 82,13 78,74 30,30 Bảng 2: Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết xuất Thời gian chiết (phút) 10 20 30 60 120 Hiệu suất chiết flavonoid (%) 71,41 72,75 78,94 82,13 82,38 82,42 Bảng 3: Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi – dược liệu Tỷ lệ DM/DL (mL/g) 10 15 20 Hiệu suất chiết flavonoid (%) 43,97 66,20 82,13 85,00