VÕ THỊ CHINH NGHIÊN cứu CHIẾT XUẤT CAO rễ ĐAN sâm GIÀU các HOẠT CHẤT NHÓM TANSHINON KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VÕ THỊ CHINH NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CAO RỄ ĐAN SÂM GIÀU CÁC HOẠT CHẤT NHÓM TANSHINON KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VÕ THỊ CHINH Mã sinh viên: 1501063 NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CAO RỄ ĐAN SÂM GIÀU CÁC HOẠT CHẤT NHÓM TANSHINON KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Trần Trọng Biên Nơi thực hiện: Bộ môn Công Nghiệp Dược HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Với tất kính trọng, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến ThS Trần Trọng Biên, người trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình cho tơi suốt q trình thực khóa luận Bằng tất kinh nghiệm nhiệt huyết, thầy giúp đỡ truyền cảm hứng cho đường nghiên cứu khoa học Tiếp theo xin chân thành cảm ơn TS Bùi Thị Thúy Luyện thầy cô giảng viên, kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa luận cách tốt Tôi xin cảm ơn DS Nguyễn Thị Phương Dung nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi q trình làm thực nghiệm Nhân đây, xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, Bộ mơn Phịng ban, tồn thể cán công nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ bảo tận tình cho suốt năm học tập trường Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè, người ủng hộ, động viên đồng hành suốt chặng đường vừa qua Hà Nội, tháng năm 2020 Sinh viên Võ Thị Chinh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN Thông tin Đan sâm Đặc điểm thực vật phân bố Tác dụng .2 Thành phần hóa học .3 Các phương pháp chiết xuất làm giàu tanshinon từ rễ Đan sâm Các phương pháp chiết xuất .6 Các phương pháp tinh chế làm giàu nhóm hoạt chất tanshinon .8 Thông tin nhựa hấp phụ macroporous Nhựa macroporous .9 Ứng dụng nhựa macroporous làm giàu hợp chất tự nhiên 11 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 Nguyên vật liệu thiết bị .15 Nguyên vật liệu 15 Chất chuẩn hóa chất 15 Thiết bị thí nghiệm 16 Nội dung nghiên cứu 16 Phương pháp nghiên cứu 16 Phương pháp chiết xuất điều chế cao thô .16 Phương pháp xử lý hạt nhựa macroporous 17 Phương pháp lựa chọn nhựa macroporous 17 Phương pháp nghiên cứu trình hấp phụ giải hấp phụ tĩnh 18 Phương pháp nghiên cứu trình hấp phụ giải hấp phụ động 18 Phương pháp định tính định lượng tanshinon IIA cryptotanshinon 19 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 22 Thẩm định phương pháp định lượng tanshinon IIA cryptotanshinon 22 Độ đặc hiệu .22 Độ thích hợp hệ thống 22 Khoảng tuyến tính .23 Độ lặp lại 24 Khảo sát điều kiện chiết xuất tanshinon từ rễ Đan sâm 24 Định lượng dược liệu đầu vào 24 Khảo sát kích thước nguyên liệu 25 Khảo sát số lần chiết 26 Khảo sát dung môi chiết .26 Nghiên cứu làm giàu tanshinon nhựa macroporous 27 Sàng lọc nhựa macroporous .27 Quá trình hấp phụ, giải hấp phụ điều kiện tĩnh 29 Quá trình hấp phụ, giải hấp phụ điều kiện động 30 Quy trình điều chế cao rễ Đan sâm giàu hoạt chất nhóm tanshinon 33 BÀN LUẬN 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu BV HPLC Tên đầy đủ Thể tích khối hạt (Bed Volume) Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) kl/tt Khối lượng/thể tích LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lipoprotein) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SKLM Sắc ký lớp mỏng tt/tt Thể tích/thể tích UV Tử ngoại (Ultraviolet) VIS Khả kiến (Visible) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại nhựa macroporous 10 Bảng 2.1 Các đặc tính lý hóa nhựa macroporous 15 Bảng 2.2 Danh mục hóa chất sử dụng 15 Bảng 3.1 Kết thời gian lưu diện tích píc dung dịch chuẩn hỗn hợp 23 Bảng 3.2 Mối tương quan diện tích píc nồng độ tanshinon IIA cryptotanshinon .23 Bảng 3.3 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp định lượng 24 Bảng 3.4 Kết định lượng dược liệu đầu vào 25 Bảng 3.5 Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hiệu suất chiết tanshinon 25 Bảng 3.6 Ảnh hưởng số lần chiết đến hiệu suất chiết tanshinon 26 Bảng 3.7 Ảnh hưởng độ cồn đến hiệu suất chiết tanshinon 27 Bảng 3.8 Dung lượng hấp phụ tĩnh tanshinon IIA cryptotanshinon loại nhựa khác .28 Bảng 3.9 Ảnh hưởng nồng độ dịch hấp phụ đến dung lượng hấp phụ tanshinon IIA cryptotanshinon 29 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến trình giải hấp phụ tanshinon IIA cryptotanshinon .30 Bảng 3.11 Hiệu suất giải hấp phụ tanshinon IIA cryptotanshinon phân đoạn trình giải hấp phụ .32 Bảng 3.12 Kết khảo sát độ lặp lại quy trình chiết xuất tinh chế 35 Bảng 3.13 Kết so sánh hàm lượng hoạt chất cao thô cao sau tinh chế .36 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc số diterpenoid có rễ Đan sâm .4 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học tanshinon IIA Hình 1.3 Cấu trúc hóa học cryptotanshinon Hình 1.4 Cấu trúc số acid phenolic Hình 1.5 Một phần mạng lưới polyme polystyren liên kết chéo 10 Hình 3.1: Sắc ký đồ HPLC thẩm định độ đặc hiệu .22 Hình 3.2 Đường chuẩn mối tương quan diện tích píc nồng độ 24 Hình 3.3 Hình ảnh hạt nhựa trước (A) sau hấp phụ (B) .28 Hình 3.4 Đường đẳng nhiệt hấp phụ tanshinon IIA cryptotanshinon 29 Hình 3.5 Sắc ký lớp mỏng quan sát tanshinon giai đoạn hấp phụ 31 Hình 3.6 Dịch giải hấp phụ phân đoạn .31 Hình 3.7 Sắc ký lớp mỏng quan sát tanshinon giai đoạn giải hấp phụ 31 Hình 3.8 Sự thay đổi nồng độ tanshinon IIA cryptotanshinon theo thể tích giải hấp phụ 32 Hình 3.9 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất làm giàu tanshnon từ rễ Đan sâm 34 Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu cao thô cao sau tinh chế 36 Hình 3.11 Hình ảnh cao thơ (A) cao sau làm giàu tanshinon (B) 36 ĐẶT VẤN ĐỀ Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) dược liệu quý thuộc chi Salvia L., họ Hoa môi (Lamiaceae) Rễ Đan sâm sử dụng từ lâu y học cổ truyền làm thuốc hoạt huyết, thông kinh, giảm đau, tâm lương huyết [4] Tanshinon tên gọi chung để nhóm hoạt chất diterpenoid thân dầu có rễ Đan sâm (tanshinon IIA, cryptotanshinnon, tanshinon I, dihydrotanshinon…) với nhiều tác dụng sinh học bật như: giãn mạch vành, tăng tuần hồn máu [42], chống oxy hóa, giảm cholesterol máu [11]… Hiện nay, có 40 tanshinon phân lập xác định, tanshinon IIA cryptotanshinon hai thành phần có hàm lượng hoạt tính đáng kể thường sử dụng làm chất đánh dấu cho nhóm hoạt chất kiểm tra chất lượng dược liệu sản phẩm chiết từ rễ Đan sâm [12] Đối với cao dược liệu nói chung, tác dụng sinh học có nhờ kết hợp đồng thời nhiều hoạt chất có mặt thành phần cao Để điều chế cao dược liệu giàu hoạt chất, nhiều phương pháp tinh chế dịch chiết nghiên cứu áp dụng phương pháp kết tủa (do thay đổi dung môi, pH, nhiệt độ…), trao đổi ion hay phương pháp hấp phụ…Trong đó, phương pháp hấp phụ sử dụng nhựa macroporous ứng dụng nhiều làm giàu hợp chất tự nhiên có khả hấp phụ chọn lọc nhiều nhóm phân tử mục tiêu hầu hết sử dụng dung môi "xanh" nước ethanol [22] Dược điển Trung Quốc 2015 có chuyên luận “Tanshinones”, quy định hàm lượng tanshinon IIA cryptotanshinon có sản phẩm chiết khơng 9,8% 2,1% tương ứng [7] Tuy nhiên, nghiên cứu nhóm tanshinon chủ yếu tiến hành phân lập đơn chất có độ tinh khiết cao kỹ thuật kỹ thuật sắc ký lọc gel [35], sắc ký hấp phụ ngược dòng tốc độ cao [39]… Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu xây dựng quy trình điều chế cao rễ Đan sâm giàu hoạt chất nhóm tanshinon đạt tiêu chuẩn nêu Đan sâm gây giống từ lâu cho sản lượng cao nhiều vùng Hà Giang, Sa Pa, Hưng Yên, Tam Đảo [1] Do đó, đề tài “Nghiên cứu chiết xuất cao rễ Đan sâm giàu hoạt chất nhóm tanshinon” thực với mục tiêu: Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất làm giàu nhóm hoạt chất tanshinon từ rễ Đan sâm Xây dựng quy trình điều chế cao rễ Đan sâm giàu hoạt chất nhóm tanshinon, đạt hàm lượng tanshinon IIA ≥ 9,8% cryptotanshinon ≥ 2,1% TỔNG QUAN Thông tin Đan sâm Đặc điểm thực vật phân bố Đan sâm có tên khoa học Salvia miltiorrhiza Bunge., thuộc chi Salvia, họ Hoa môi Lamiaceae, Labiatae Đan sâm hay gọi Huyết sâm, Xích sâm, Huyết căn, có tên rễ giống sâm mà lại có màu đỏ (Đan đỏ) Chi Salvia chi lớn họ Lamiaceae, phân bố chủ yếu vùng ơn đới ẩm cận nhiệt đới Chi có loài vùng nhiệt đới Đan sâm Việt Nam có nguồn gốc từ Trung Quốc, di thực vào nước ta Hiện nay, Đan sâm gây giống Tam Đảo, Hưng Yên, Hà Giang, Sa Pa [1] Đặc điểm thực vật: Đan sâm loại sống lâu năm, cao 30 – 80 cm, đường kính 0,5 – 1,5 cm Lá kép mọc đối, gồm – chét, mặt chét màu xanh Cụm hoa mọc thành chum đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10 – 20 cm Hoa mọc vịng, vịng có – 10 hoa, thường hoa Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, mơi, mơi hình lưỡi liềm, mơi xẻ thùy Hai nhị hai mơi dưới, bầu có vịi dài lồi môi Quả nhỏ dài 3mm, rộng 1,5mm [1] Bộ phận dùng: Dược liệu đan sâm (Radix salviae miltiorrhiza) rễ phơi khô hay sấy khô Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) Rễ ngắn, thô, hình trụ dài, cong, dài 10-20 cm, đường kính 0,3-1 cm Bên màu nâu đỏ nâu nhạt, có vân nhăn dọc, phần vỏ bám chặt vào gỗ khơng dễ bóc Kết cấu cứng, giịn dễ vỡ; phần gỗ màu vàng xám nâu tía, cho thấy bó mạch màu vàng nhạt, xuyên tâm Chất chắc, mặt bẻ gãy tương đối phẳng, có dạng chất sừng Mùi nhẹ, vị đắng tương đối cay [4] Tác dụng - Theo y học cổ truyền: đan sâm vị đắng, tính mát, quy kinh tâm, can; cơng hoạt huyết, thông kinh, giảm đau, tâm lương huyết; chủ trị kinh nguyệt không đều, kinh nguyệt bế tắc, hành kinh đau bụng, huyền tích hịn cục, tâm phiền ngủ, đau thắt ngực [4] - Theo y học đại: Đan sâm sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh mạch máu, bao gồm xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, tăng lipid máu đột quỵ nhiều nước giới [8], [18] Các thuộc tính có lợi Đan sâm bao gồm cải thiện lưu lượng máu giải ứ máu [27] Hình 3.9 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất làm giàu tanshnon từ rễ Đan sâm ❖ Mơ tả quy trình - Chuẩn bị nguyên liệu, chiết xuất: Rễ Đan sâm (hàm ẩm 12%) thái lát dày 2-5 mm Tiến hành chiết 100,0 g nguyên liệu phương pháp ngâm nhiệt độ phịng có kết hợp khuấy trộn (150 vịng/phút), chiết lần × 12 giờ/lần, tỷ lệ dung mơi/ dược liệu lần 7/5/5 Gộp dịch chiết, cô thu hồi dung môi áp suất giảm (500 mbar, 55°C) dịch chiết loại bớt ethanol, pha loãng dịch chiết 34 nước cất thành 0,65 L (nồng độ tanshinon IIA ~ 400 µg/mL, cryptotanshinon ~ 230 µg/mL) - Làm giàu tanshinon nhựa macroporous: Cân 7,2 g (khối lượng khô) nhựa macroporous D101 xử lý nạp lên cột thủy tinh đường kính cm (chú ý khơng để bọt khí cịn lại cột) Cho 0,65 L dịch chiết (tương ứng với 27 BV) chuẩn bị hấp phụ qua cột, tốc độ BV/giờ đến hết dịch Tiếp tục rửa cột nước cất (4 BV, tốc độ BV/giờ) ethanol 96% (19 BV, tốc độ BV/giờ) Dịch giải hấp phụ ethanol 96% cô thu hồi ethanol áp suất giảm (500 mbar, 55°C) đông khô (tiền đông -70°C 24 giờ, thăng hoa 12 -50°C, 0,1 mbar) thu cao khơ tinh chế - Kiểm nghiệm, đóng gói, bảo quản: Cao rễ Đan sâm sau tinh chế kiểm tra tiêu cảm quan, hàm ẩm, hàm lượng tanshinon IIA cryptotanshinon Cuối cùng, cao bảo quản lần túi PE điều kiện 5-8°C, tránh ánh sáng ❖ Đánh giá độ ổn định quy trình Tiến hành lặp lại quy trình mẻ, thu kết sau: Bảng 3.12 Kết khảo sát độ lặp lại quy trình chiết xuất tinh chế Chỉ Khối lượng tiêu cao (g) Mẻ 2,35 Mẻ 2,06 Mẻ 2,23 Trung bình Cảm quan Bột khơ tơi, màu nâu đỏ Bột khô tơi, màu nâu đỏ Bột khô tơi, màu nâu đỏ 2,21 - Hàm Hàm lượng (%) ẩm (%) Tanshinon IIA Cryptotanshinon 3,96 10,29 6,33 4,28 10,54 6,14 3,87 10,81 4,88 4,04 10,55 5,78 Hình ảnh sắc ký đồ HPLC mẫu cao thô cao tinh chế thể Hình 3.11 Hình 3.12 35 Mẫu cao thơ Mẫu cao sau làm giàu tanshinon Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu cao thô cao sau tinh chế Hình 3.11 Hình ảnh cao thơ (A) cao sau làm giàu tanshinon (B) Kết so sánh cao thô cao sau tinh chế: Bảng 3.13 Kết so sánh hàm lượng hoạt chất cao thô cao sau tinh chế Thông số đánh giá Cao thô Cao sau tinh chế Hiệu suất chiết cao (%) 4,93 2,35 Hàm lượng tanshinon IIA (%) 5,34 10,55 Hàm lượng cryptotanshinon (%) 2,80 5,78 36 BÀN LUẬN Về phương pháp định lượng tanshinon IIA cryptotanshinon HPLC phương pháp phổ biến xác để phân tích định lượng tanshinon Đan sâm Trên sở tham khảo tài liệu [7], [34], phương pháp HPLC rửa giải theo chế độ gradient theo Dược điển Trung Quốc 2015 áp dụng phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm thẩm định tiêu độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính độ lặp lại Kết thẩm định đáp ứng yêu cầu phép định lượng, cho phép xác định xác hàm lượng tanshinon IIA cryptotanshinon mẫu thử Về trình chiết xuất nhóm hoạt chất tanshinon Nhiều phương pháp chiết xuất tanshinon từ Đan sâm công bố [34], sở tham khảo tài liệu, phương pháp ngâm với dung mơi ethanol nhiệt độ phịng lựa chọn Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới hiệu suất chiết khảo sát để phù hợp với mẫu nghiên cứu gồm kích thước dược liệu, dung môi chiết số lần chiết Mặc dù số tác giả đưa phương pháp chiết xuất tanshinon phương pháp chiết hồi lưu, nghiên cứu này, đề xuất chiết phương pháp ngâm nhiệt độ phịng Qua tìm hiểu tài tiệu [25] cho thấy q trình chiết nhiệt độ phịng cho hiệu suất chiết nhóm hoạt chất tanshinon từ dược liệu cao hơn so với phương pháp chiết hồi lưu Mặt khác, chiết xuất phương pháp ngâm nhiệt độ phịng đơn giản hơn, nguy cháy nổ tiết kiệm nhiên liệu so với phương pháp chiết hồi lưu Yan Cui cộng chiết hồi lưu rễ Đan sâm ethanol thu cao thô với hàm lượng tanshinon IIA cryptotanshinon 1,07% 1,10% [12] Hàm lượng thấp nhiều so với cao thô điều chế đề tài (tanshinon IIA 5,34% cryptotanshinon 2,80%) Nghiên cứu lựa chọn kích thước nguyên liệu tối ưu dược liệu thái lát dày 2-5 mm Với kích thước nguyên liệu này, hiệu suất chiết cao nhỏ so với nguyên liệu có kích thước ≤ mm, nhiên hàm lượng hoạt chất cao lại lớn (Bảng 3.5) Điều lý giải kích thước dược liệu nhỏ dẫn đến số lượng tế bào bị phá vỡ nhiều, diện tích tiếp xúc dung môi dược liệu lớn, làm cho lượng tạp chất hịa tan dung mơi nhiều khiến hàm lượng hoạt chất cao giảm xuống Lựa chọn dung môi chiết ethanol 96% cho hiệu suất thu hồi đạt cao (tanshinon IIA 95,11%, cryptotanshinon 92,82%) (Bảng 3.7) Đồng thời tăng nồng 37 độ ethanol từ 50% lên 96%, hiệu suất chiết cao giảm dần, hàm lượng hoạt chất cao chiết lại tăng dần Điều chứng tỏ việc tăng nồng độ ethanol giúp hạn chế đáng kể tạp chất thân nước xuất dịch chiết, khiến hàm lượng hoạt chất nhóm tanshinon cao chiết tăng lên Về trình làm giàu nhóm hoạt chất tanshinon Có nhiều loại nhựa macroporous đặc trưng tính chất lý hóa khác (Bảng 2.1), thí nghiệm sàng lọc nhựa macroporous phù hợp cho trình làm giàu tanshinon thực Ba loại nhựa lựa chọn để đánh giá khả hấp phụ hoạt chất nhóm tanshinon dịch chiết rễ Đan sâm nhựa macroporous D101, HPD826 H103 Trong đó, nhựa D101 H103 nhựa không phân cực, HPD826 nhựa phân cực Khả hấp phụ nhựa macroporous không phụ thuộc vào tính phân cực cấu trúc hóa học chất hấp phụ, mà phụ thuộc vào đặc tính chất hấp phụ tính phân cực, diện tích bề mặt đường kính lỗ xốp Đối với tanshinon, nhựa không phân cực áp dụng nhiều cho q trình hấp phụ nhóm hoạt chất [16] Kết nghiên cứu Bảng 3.8 thể nhựa D101 cho khả hấp phụ tanshinon cao nhựa HPD826 H103, cho thấy hạt nhựa có độ phân cực tương tự với tanshinon kích thước lỗ xốp lớn tối ưu cho trình hấp phụ Do đó, nhựa D101 lựa chọn cho q trình làm giàu nhóm hoạt chất tanshinon rễ Đan sâm Trên giới, Jiang cộng (2009) thực nghiên cứu đánh giá bảy loại nhựa với đặc tính phân cực khác để xác định khả hấp phụ tanshinon IIA Kết cho thấy nhựa không phân cực HPD-100 cho hiệu suất hấp phụ giải hấp phụ tanshinon IIA cao so với loại nhựa khác Tỷ lệ hấp phụ, giải hấp phụ dung lượng hấp phụ tanshinon IIA nhựa HPD-100 72,24%, 69,31% 15 mg/g nhựa khô [20] Điểm tương đồng nghiên cứu với kết đề tài chứng tỏ nhựa khơng phân cực có khả hấp phụ nhóm hoạt chất tanshinon tốt nhựa phân cực Nghiên cứu trình hấp phụ đẳng nhiệt tanshinon nhựa D101 cho thấy, ban đầu nồng độ dịch chiết thấp (Co tanshinon IIA thay đổi từ 100 lên 400 µg/mL), Qe tăng theo chiều tăng Ce đến giá trị cân (Hình 3.4) Sau khoảng nồng độ này, Ce bắt đầu tăng mạnh theo chiều tăng Co vị trí liên kết với tanshinon hạt nhựa bão hịa khơng thể hấp phụ thêm Việc nghiên cứu 38 trình hấp phụ đẳng nhiệt giúp lựa chọn nồng độ dịch hấp phụ tối ưu, đảm bảo dung lượng hấp phụ cao hạn chế cạnh tranh hấp phụ tạp chất vị trí liên kết bề mặt nhựa Do đó, dịch chiết Đan sâm điều chỉnh mức nồng độ tanshinon IIA 400 µg/mL Việc lựa chọn dung môi giải hấp phụ hoạt chất nhóm tanshinon phụ thuộc vào đặc tính lý hóa nhóm hoạt chất Bản thân tanshinon nhóm hoạt chất thân dầu, tan tốt dung môi phân cực Nước giải hấp phụ nhóm hoạt chất tanshinon nên trước giải hấp phụ hoạt chất ethanol, nước sử dụng để loại bớt tạp chất thân nước cột nhựa macroporous Tỷ lệ giải hấp phụ nhóm tanshinon tăng mạnh tăng nồng độ ethanol (Bảng 3.9) đạt 90% giải hấp phụ ethanol 96% Do đó, lựa chọn dung mơi cho q trình giải hấp phụ ethanol 96% Về xây dựng quy trình điều chế cao rễ Đan sâm giàu hoạt chất nhóm tanshinon Sau thí nghiệm khảo sát cụ thể giai đoạn, quy trình điều chế cao rễ Đan sâm giàu hoạt chất nhóm tanshinon thực lặp lại ba lần quy mô 100 g nguyên liệu/mẻ Các mẻ cao điều chế có hàm lượng tanshinon IIA cryptotanshinon đạt yêu cầu mục tiêu nghiên cứu đặt (tanshinon IIA ≥ 9,8%, cryptotanshinon ≥ 2,1%) Các sắc ký đồ Hình 3.11 cho thấy nhiều tạp chất cao thô loại bỏ, tanshinon IIA cryptotanshinon làm giàu đáng kể Hàm lượng tanshinon IIA cryptotanshinon cao sau tinh chế cao gấp 1,9 2,1 lần so với cao thô Phương pháp chiết xuất tinh chế khơng sử dụng dung mơi hữu cơ, hóa chất độc hại với sức khỏe, mơi trường, chi phí thấp sử dụng chất hấp phụ nhựa macroporous rẻ tái sử dụng Q trình giải hấp phụ bước ethanol 96% đơn giản, dễ thực Điều cho thấy tính thực tiễn quy trình nâng cấp quy mơ 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện, đề tài đạt mục tiêu đề ra, gồm: Đã khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết xuất làm giàu nhóm hợp chất tanshinon từ rễ Đan sâm Điều kiện chiết xuất: Nguyên liệu thái lát dày 2-5 mm, chiết lần × 12 giờ/lần, - tỷ lệ dung mơi/dược liệu 7/5/5, dung môi ethanol 96% Làm giàu tanshinon phương pháp hấp phụ sử dụng hạt nhựa macroporous - D101 - Nồng độ tanshinon IIA dịch hấp phụ khoảng 400 µg/mL - Thể tích dịch hấp phụ: 27 BV - Dung môi giải hấp phụ tạp chất: nước cất (4 BV) - Dung môi giải hấp phụ tanshinon: ethanol 96% - Thể tích dung mơi giải hấp phụ: 19 BV Đã xây dựng quy trình điều chế cao rễ Đan sâm giàu tanshinon đạt hàm lượng tanshinon IIA ≥ 9,8% cryptotanshinon ≥ 2,1% - Chuẩn bị nguyên liệu, chiết xuất: Rễ Đan sâm thái lát dày 2-5 mm (hàm ẩm < 12%) chiết lần × 12 giờ/lần ethanol 96%, tỷ lệ dung môi/dược liệu lần thứ 7/1, hai lần sau 5/1, khuấy trộn (150 vòng/phút) - Làm giàu tanshinon hạt nhựa macroporous: Hấp phụ (27 BV, nồng độ tanshinon IIA 400 µg/mL, cryptotanshinon 230 µg/mL, tốc độ BV/giờ), giải hấp phụ (4 BV nước cất, 19 BV ethanol 96%, tốc độ BV/giờ) - Đóng gói, bảo quản: Bảo quản lần túi PE, 5-8°C, tránh ánh sáng Hàm lượng trung bình tanshinon IIA cryptotanshinon sau chiết tinh chế mẻ (100 g/mẻ) thu 10,55% 5,78% Hiệu suất quy trình trung bình đạt 86,05%, tính theo hàm lượng tanshinon IIA ĐỀ XUẤT Trên sở kết đạt được, đề tài xin đề xuất số nội dung sau: - Tiếp tục nghiên cứu nâng cấp quy trình điều chế cao rễ Đan sâm giàu hoạt chất nhóm tanshinon từ quy mơ phịng thí nghiệm lên quy mơ cơng nghiệp - Nghiên cứu độ ổn định cao điều chế 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đỗ Huy Bích Đặng Quang Chung (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 723-738 Đỗ Tất Lợi (2004), Cây thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội, tr 812 814 Lê Thị Loan (2017), "Xây dựng quy trình chiết xuất cao định chuẩn từ Đan sâm quy mơ phịng thí nghiệm", Đề tài cấp viện, Viện Dược liệu, tr 27-28 Hội đồng dược điển Việt Nam (2017), Dược điển Việt Nam V, NXB Y học, tr.1152 - 1154 Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học & vi sinh vật, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr 5-58 Vụ khoa học đào tạo (2006), Dược học cổ truyền, NXB Y học Hà Nội, tr.85-86 Tài liệu tiếng Anh China Food and Drug Administration (2015), China Pharmacopeia 2015, pp 398399 Chang Qi, et al (2008), "Simultaneous determination of ten active components in traditional Chinese medicinal products containing both Gegen (Pueraria lobata) and Danshen (Salvia miltiorrhiza) by high‐performance liquid chromatography", Phytochemical Analysis, 19(4), pp 368-375 Chaoyang Ma, et al (2009), "Preparative purification of salidroside from Rhodiola rosea by two‐step adsorption chromatography on resins", Journal of separation science, 32(2), pp 185-191 10 Chen Xiuping, et al (2014), "The anticancer properties of Salvia miltiorrhiza Bunge (Danshen): a systematic review", Medicinal Research Reviews, 34(4), pp 768-794 11 Chun-Yan Su, et al (2015), "Salvia miltiorrhiza: traditional medicinal uses, chemistry, and pharmacology", Chinese journal of natural medicines, 13(3), pp 163-182 12 Cui Yan, et al (2011), "Characterization of Salvia miltiorrhiza ethanol extract as an anti-osteoporotic agent", BMC complementary and alternative medicine, 11(1), pp 120 13 D Luo, et al (2010), "Purification of salvianolic acid by macroporous resins", Chinese Journal of Experimental Traditional, pp 146-152 14 Dong Yizhou, et al (2011), "Biosynthesis, total syntheses, and antitumor activity of tanshinones and their analogs as potential therapeutic agents", Natural product reports, 28(3), pp 529-542 15 Du Min, et al (2005), "Comparison of different techniques for extraction tanshinone IIA in Salvia miltiorrhiza Bunge", Research and Practice of Chinese Medicines, 3, pp 17-18 16 Gao Hongwei, et al (2018), "Simultaneous purification of dihydrotanshinone, tanshinone I, cryptotanshinone, and tanshinone IIA from Salvia miltiorrhiza and their anti-inflammatory activities investigation", Scientific reports, 8(1), pp 1-13 17 Gao Si, et al (2012), "Cardiovascular actions and therapeutic potential of tanshinone IIA", Atherosclerosis, 220(1), pp 3-10 18 Ji Xin-Yan, et al (2000), "Salvia miltiorrhiza and ischemic diseases", Acta Pharmacologica Sinica, 21(12), pp 1089-1094 19 Jia Guangtao, et al (2008), "Enrichment and purification of madecassoside and asiaticoside from Centella asiatica extracts with macroporous resins", Journal of Chromatography A, 1193(1-2), pp 136-141 20 Jiang Xi Cheng, et al (2008) "The static adsorption of tanshinone IIA using macroporous resins ", Beijing Key Lab of Bioprocess Beijing University of Chemical Technology, pp 112-117 21 Jing-Zheng Song, et al (2010), "A novel approach to rapidly explore analytical markers for quality control of Radix salviae miltiorrhizae extract granules by robust principal component analysis with ultra-high performance liquid chromatography– ultraviolet–quadrupole time-of-flight mass spectrometry", Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 53(3), pp 279-286 22 Li Jing, et al (2010), "Development of adsorptive (non-ionic) macroporous resins and their uses in the purification of pharmacologically-active natural products from plant sources", Natural product reports, 27(10), pp 1493-1510 23 Li Y., et al (2002), "Extraction of three tanshinones from the root of Salvia miltiorrhiza Bunge by supercritical carbon dioxide fluid and their analysis with high performance liquid chromatography", Chinese journal of chromatography, 20(1), pp 40-42 24 Liang Y., Xie L (2003), "Content variations of tanshinone IIA and cryptotanshinone at different pH conditions", Northwest Pharmaceutical Journal, 18, pp 108-109 25 Lin H., et al (2005), "Stability study of tanshinone IIA", Traditional Chinese Medicinal Research, (18), pp 16-17 26 Luo D., et al (2010), "Purification of Salvianolic Acid by Macroporous Resins", Chinese Journal of Experimental Traditional, pp 146-152 27 Luo Hou-Wei, et al (1985), "Pigments from Salvia miltiorrhiza", Phytochemistry, 24(4), pp 815-817 28 Matkowski Adam, et al (2008), "Antioxidant activity of extracts from leaves and roots of Salvia miltiorrhiza Bunge", Bioresource technology, 99(16), pp 78927896 29 Okay (2000), "Macroporous copolymer networks", Progress in polymer science, 25(6), pp 711-779 30 Pan Xuejun, et al (2001), "Microwave-assisted extraction of tanshinones from Salvia miltiorrhiza bunge with analysis by high-performance liquid chromatography", Journal of Chromatography A, 922(1-2), pp 371-375 31 Pang Hanqing, et al (2016), "Chemical analysis of the herbal medicine Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma (Danshen)", Molecules, 21(1), pp 51 32 Qiu Li-li, et al (2012), "The isolation and purification technology of four triterpenoids from Alismatis rhizoma by macroporous resin", Journal of Guangdong Pharmaceutical University, (2), pp 16-18 33 Rostagno Mauricio, et al (2013), Natural product extraction: principles and applications, Royal Society of Chemistry, pp 318 - 319 34 Sheng Shujun (2007), Cultivation and Quality Studies of Danshen (Salvia miltiorrhiza) in Australia, pp 164-258 35 Tian Guilian, et al (2002), "Separation of tanshinones from Salvia miltiorrhiza Bunge by multidimensional counter-current chromatography", Journal of Chromatography A, 945(1-2), pp 281-285 36 Tian Minglei, et al (2009), "Solid-phase extraction of tanshinones from Salvia miltiorrhiza Bunge using ionic liquid-modified silica sorbents", Journal of Chromatography B, 877(8-9), pp 738-742 37 Wan J., et al (2008), "Quantification and separation of protopanaxatriol and protopanaxadiol type saponins from Panax notoginseng with macroporous resins", Separation and Purification Technology, 60(2), pp 198-205 38 Weiping Yin, et al (2006), Medicine intermediate tanshinone IIA extracting process, Google patents CN100451011C 39 Wu Dingfang, et al (2010), "Direct purification of tanshinones from Salvia miltiorrhiza Bunge by high‐speed counter‐current chromatography without presaturation of the two‐phase solvent mixture", Journal of separation science, 33(1), pp 67-73 40 Xing Lu, et al (2017), "Bioavailability and pharmacokinetic comparison of tanshinones between two formulations of Salvia miltiorrhiza in healthy volunteers", Scientific reports, 7(1), pp 1-10 41 Xu Ming-cheng, et al (2000), "Synthesis of the adsorbent based on macroporous copolymer MA–DVB beads and its application in purification for the extracts from Ginkgo biloba leaves", Reactive and Functional Polymers, 43(3), pp 297-304 42 Yan Xijun (2014), Dan Shen (Salvia Miltiorrhiza) in Medicine 1, Springer, pp 97117 43 Yang Qiao, et al (2007), "Coupling continuous ultrasound-assisted extraction with ultrasonic probe, solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography for the determination of sodium Danshensu and four tanshinones in Salvia miltiorrhiza bunge", Analytica chimica acta, 589(2), pp 231-238 44 Yang Yuqiao, et al (2019), "Separation and enrichment of three coumarins from Radix angelicae pubescentis by macroporous resin with preparative HPLC and evaluation of their anti-inflammatory activity", Molecules, 24(14), pp 2664 45 Yudong Yao, et al (2001), Process for extracting and refining tanshinone IIA by supercritical CO2, Google patents CN1369485A 46 Zhang Bin, et al (2008), "Separation of chlorogenic acid from honeysuckle crude extracts by macroporous resins", Journal of Chromatography B, 867(2), pp 253258 47 Zhou Limin, et al (2005), "Danshen: an overview of its chemistry, pharmacology, pharmacokinetics, and clinical use", The Journal of Clinical Pharmacology, 45(12), pp 1345-1359 PHỤ LỤC Phụ lục Nguyên liệu loại nhựa macroporous Phụ lục Một số hình ảnh sắc ký đồ HPLC Phụ lục Nguyên liệu loại nhựa macroporous Phụ lục 1.1 Mẫu Đan sâm nguyên liệu Phụ lục 1.2 Hình ảnh hạt nhựa macroporous Phụ lục Một số hình ảnh sắc ký đồ HPLC Cao sau làm giàu tanshinon mẻ Cao sau làm giàu tanshinon mẻ ...BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VÕ THỊ CHINH Mã sinh viên: 1501063 NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CAO RỄ ĐAN SÂM GIÀU CÁC HOẠT CHẤT NHÓM TANSHINON KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS... tài ? ?Nghiên cứu chiết xuất cao rễ Đan sâm giàu hoạt chất nhóm tanshinon? ?? thực với mục tiêu: Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất làm giàu nhóm hoạt chất tanshinon từ rễ Đan sâm Xây... dịch chiết ethyl acetat [21] Các phương pháp chiết xuất làm giàu tanshinon từ rễ Đan sâm Các phương pháp chiết xuất Chiết xuất bước quy trình điều chế cao dược liệu có hàm lượng hoạt chất cao