Nghiên cứu điều chế cao rễ đan sâm giàu hoạt chất sử dụng nhựa hấp phụ Macroporous

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐOÀN HUY HOÀNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO RỄ ĐAN SÂM GIÀU HOẠT CHẤT SỬ DỤNG NHỰA HẤP PHỤ MACROPOROUS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐOÀN HUY HOÀNG Mã sinh viên: 1401247 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO RỄ ĐAN SÂM GIÀU HOẠT CHẤT SỬ DỤNG NHỰA HẤP PHỤ MACROPOROUS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Bùi Thị Thúy Luyện NCS Nguyễn Thị Phương Dung Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Với tất kính trọng, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: TS Bùi Thị Thúy Luyện, NCS Nguyễn Thị Phương Dung trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình cho tơi suốt thời gian thực khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn DS.Trần Trọng Biên ln quan tâm, giúp đỡ tơi tháo gỡ khó khăn q trình thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ bảo tận tình suốt năm năm học tập trường Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè người ln ủng hộ động viên suốt thời gian qua Do thời gian thực đề tài có hạn nên khóa luận khơng thể tránh khỏi thiếu sót, tơi mong có góp ý q báu thầy cô bạn sinh viên Hà Nội, tháng năm 2019 Sinh viên Đoàn Huy Hoàng i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .vi DANH MỤC CÁC BẢNG viii ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Đan sâm .2 1.1.1 Tên gọi & phân bố 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Bộ phận sử dụng 1.1.4 Tác dụng 1.1.5 Thành phần hóa học [2], [11], [12], [23] .3 1.1.5.1 Acid salvianolic B .4 1.1.5.2 Tanshinon IIA 1.1.6 Một số phương pháp tinh chế làm giàu hoạt chất cao rễ Đan sâm 1.1.6.1 Phương pháp CO2 siêu tới hạn 1.1.6.2 Phương pháp sắc ký cột kết hợp sắc ký lỏng hiệu cao 1.1.6.3 Phương pháp sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (HSCCC) .6 1.1.6.4 Phương pháp sắc ký hấp phụ kết hợp phương pháp sắc ký ngược dòng tốc độ cao (HSCCC) 1.2 Tổng quan nhựa macroporous 1.2.1 Định nghĩa & phân loại .7 1.2.2 Bản chất hóa học 1.2.3 Bản chất trình làm giàu hợp chất nhựa macroporous 1.2.4 Các nghiên cứu tinh chế cao đan sâm nhựa macroporous làm CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .12 2.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.1.1 Nguyên vật liệu 12 2.1.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 13 2.1.2.1 Hóa chất 13 ii 2.1.2.2 Thiết bị 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Phương pháp định tính hoạt chất Đan sâm 14 2.3.2 Phương pháp định lượng ASB tanshinon IIA HPTLC .14 2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 15 2.3.4 Phương pháp chiết xử lý dịch chiết .16 2.3.5 Phương pháp xử lý hạt nhựa 17 2.3.6 Phương pháp nghiên cứu trình hấp phụ 17 2.3.6.1 Khảo sát lựa chọn nhựa macroporous 17 2.3.6.2 Khảo sát tỷ lệ khối lượng nhựa thể tích dịch chiết .18 2.3.6.3 Phương pháp tiến hành trình hấp phụ 18 2.3.7 Phương pháp nghiên cứu trình giải hấp phụ hoạt chất Đan sâm từ hạt nhựa macroporous D101 19 2.3.7.1 Khảo sát lựa chọn dung môi giải hấp phụ .19 2.3.7.2 Khảo sát thể tích dung môi giải hấp phụ .19 2.3.8 Xây dựng đánh giá quy trình làm giàu hoạt chất cao rễ đan sâm sử dụng nhựa macroporous .20 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Kết thẩm định phương pháp định lượng TLC-scanning .21 3.1.1 Kết thẩm định phương pháp định lượng ASB 21 3.1.1.1 Độ đặc hiệu 21 3.1.1.2 Khoảng tuyến tính 22 3.1.1.3 Độ thích hợp hệ thống 23 3.1.1.4 Độ lặp lại phương pháp 24 3.1.2 Kết thẩm định phương pháp định lượng tanshinon IIA 25 3.1.2.1 Độ đặc hiệu 25 3.1.2.2 Khoảng tuyến tính 26 3.1.2.3 Độ thích hợp hệ thống 27 3.1.2.4 Độ lặp lại phương pháp 27 3.2 Kết khảo sát trình chiết xuất 28 3.2.1 Lựa chọn dung môi chiết Đan sâm 28 3.2.2 Lựa chọn kích thước tiểu phân bột 29 iii 3.2.3 Lựa chọn số lần chiết 30 3.2.4 Kết xác định hàm lượng ASB tanshinon IIA dược liệu .31 3.3 Kết nghiên cứu trình hấp phụ 31 3.3.1 Lựa chọn nhựa hấp phụ macroporous .31 3.3.2 Khảo sát tỷ lệ khối lượng hạt thể tích dịch chiết 33 3.4 Kết nghiên cứu trình giải hấp phụ hoạt chất Đan sâm từ hạt nhựa macroporous D101 34 3.4.1 Khảo sát dung môi giải hấp phụ 34 3.4.1.1 Khảo sát dung môi giải hấp phụ tiến hành kỹ thuật mẻ 34 3.4.1.2 Khảo sát dung môi giải hấp phụ tiến hành kỹ thuật cột 34 3.4.2 Kết khảo sát thể tích dung mơi giải hấp phụ .36 3.4.2.1 Khảo sát thể tích dung mơi giải hấp phụ đồng thời ASB tanshinon IIA 36 3.4.2.2 Khảo sát thể tích dung mơi giải hấp phụ thành phần ASB Tan IIA 36 3.5 Đề xuất quy trình làm giàu hoạt chất cao rễ Đan sâm ứng dụng nhựa macroporous D101 38 3.6 Bàn luận .42 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44 4.1 Kết luận 44 4.2 Đề xuất 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ASB : Acid salvianolic B Tan IIA : Tanshinon IIA EtOH : Ethanol MeOH: Methanol EtOAc: Ethyl acetat NXB: Nhà xuất SKLM: Sắc ký lớp mỏng TLC: Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) TKHH: Tinh khiết hóa học KTTP: Kích thước tiểu phân TT: Thứ tự HSCCC: High speed countercurrent chromatography v DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TT Danh mục hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1: Cây rễ Đan sâm 2 Hình 1.2: Cấu trúc hóa học acid salvianolic B Hình 1.3: Cấu trúc hóa học tanshinon IIA Hình 1.4: Một phần mạng lưới polymer liên kết chéo Hình 2.1: Nguyên liệu Đan sâm 12 Hình 2.2: Hạt nhựa macroporous D101 12 Hình 2.3: Hạt nhựa macroporous HPD826 12 Hình 2.4: Hạt nhựa macroporous H103 12 Hình 3.1: Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu phương pháp định lượng ASB 10 Hình 3.2: Hình ảnh pic sắc ký ASB mẫu thử mẫu chuẩn 11 12 13 14 Hình 3.3: Đường biểu diễn phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ ASB Hình 3.4: Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu phương pháp định lượng Tan IIA Hình 3.5: Hình ảnh pic sắc ký Tan IIA mẫu thử mẫu chuẩn Hình 3.6: Đường biểu diễn phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ Tan IIA 21 22 23 25 25 26 15 Hình 3.7: Khảo sát dung mơi chiết Đan sâm SKLM 28 16 Hình 3.8: Theo dõi trình chiết xuất Đan sâm SKLM 30 17 Hình 3.9: SKLM khảo sát lựa chọn nhựa macroporous 32 18 19 20 Hình 3.10: Mối liên hệ khối lượng nhựa /50mL dịch chiết hiệu suất hấp phụ ASB Hình 3.11: SKLM khảo sát nồng độ dung môi giải hấp phụ hoạt chất kỹ thuật mẻ Hình 3.12: SKLM khảo sát nồng độ dung mơi giải hấp phụ hoạt chất kỹ thuật cột 21 Hình 3.13: Khảo sát thể tích giải hấp phụ đồng thời ASB Tan IIA vi 33 34 35 36 22 Hình 3.14: Khảo sát thể tích giải hấp phụ ASB 37 23 Hình 3.15: Khảo sát thể tích giải hấp phụ Tanshinon IIA 37 24 Sơ đồ quy trình làm giàu hoạt chất Đan sâm cao rễ Đan sâm 39 25 Hình 3.16: Cao I 40 26 Hình 3.17: Cao IIa 40 27 Hình 3.18: Cao IIb 40 vii DANH MỤC CÁC BẢNG TT Danh mục bảng Trang Bảng 2.1: Danh sách hóa chất sử dụng 13 Bảng 3.1: Kết khảo sát khoảng tuyến tính phương pháp định 23 lượng ASB Bảng 3.2: Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống phương pháp 24 định lượng ASB Bảng 3.3: Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp định lượng ASB 24 Bảng 3.4: Kết khảo sát khoảng tuyến tính định lượng tanshinon IIA 26 Bảng 3.5: Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống phương pháp 27 định lượng tanshinon IIA Bảng 3.6: Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp định lượng 28 tanshinon IIA Bảng 3.7: Kết định lượng khảo sát lựa chọn KTTP 29 Bảng 3.8: Hàm lượng ASB tanshinon IIA dịch chiết rễ Đan 31 sâm 10 Bảng 3.9: Kết định lượng ASB để lựa chọn nhựa hấp phụ 32 11 Bảng 3.10: Khối lượng ASB bị hấp phụ hiệu suất hấp phụ ASB 33 nhựa D101 12 Bảng 3.11: Hàm lượng ASB tanshinon IIA sau trình làm giàu 41 13 Bảng 3.12: Hiệu suất thu hồi ASB tanshinon IIA sau trình làm giàu 41 viii Nhựa H103 Nhựa HPD826 Nhựa D101 Hình 3.9: SKLM khảo sát lựa chọn nhựa macroporous Nhận xét 1:Khi tiến hành khảo sát với lượng nhauwj lượng dược liệu, kết kiểm tra SKLM cho thấy nhựa D101 cho hàm lượng hấp phụ tốt hoạt chất cao rễ Đan sâm vết hoạt chất dịch sau hấp phụ xuất mờ mỏng Khả hấp phụ nhựa HPD826 tốt nhiên vết sắc ký hoạt chất ASB rõ rệt sử dụng nhựa D101.Nhựa H103 cho khả hấp phụ thấy có mặt ASB tanshinon IIA SKLM.Tính chất phân cực kết hợp với kích thước hạt, kích thước lỗ trống hạt ảnh hưởng nhiều đến khả hấp phụ hạt nhựa.Cùng loại nhựa không phân cực D101 lại có khả hấp phụ tốt H103 Giải thích khác biệt vào tính chất hạt nhựa, siwj khác cấu trúc kích thước lỗ trống D101 to H103 Ngoài ra, loại nhựa D101 (khơng phân cực) HPD826 (phân cực mạnh) có khả hấp phụ hoạt chất tốt nên tiếp tục lựa chọn để xác định hàm lượng ASB.So sánh chọn loại nhựa có hiệu suất hấp phụ tốt Hút 10mL dịch sau hấp phụ cho vào bình định mức 25 mL cho nước cất cho vừa đủ 25mL, thể tích tiêm mẫu 25µL thu bảng kết sau: Bảng 3.9: Kết định lượng ASB để lựa chọn nhựa hấp phụ Loại nhựa SASB HPD826 77707,7 D101 75876,1 Nhận xét 2: Qua kết cho thấy diện tích pic ASB dịch sau hấp phụ nhựa D101 nhỏ nhiều so với nhựa HPD826 (75876,1