NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢI LO ÂU TRÊN CHUỘT NHẮT CÔ LẬP CỘNG ĐỒNG VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TOÀN PHẦN TỪ CÂY CẢI CẦN (CORYDALIS BALANSAE PRAIN.)

Việc sử dụng các thuốc có nguồn gốc hoá dược trong thời gian dài và tác động lên hệ thần kinh trung ương làm xuất hiện nhiều tác dụng phụ như lệ thuộc thuốc cộng thêm giá thành cao của c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN NGUYÊN HỒNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢI LO ÂU TRÊN CHUỘT NHẮT CÔ LẬP CỘNG ĐỒNG VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TOÀN PHẦN

TỪ CÂY CẢI CẦN (CORYDALIS BALANSAE PRAIN.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN NGUYÊN HỒNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢI LO ÂU TRÊN CHUỘT NHẮT

CÔ LẬP CỘNG ĐỒNG VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TOÀN PHẦN TỪ CÂY CẢI

CẦN (CORYDALIS BALANSAE PRAIN.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH HOÁ SINH DƯỢC

MÃ SỐ 8720208

Nơi thực hiện đề tài: Viện Dược liệu Thời gian thực hiện: từ tháng 4/2018 đến tháng 4/2019

HÀ NỘI 2019

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Thị Lập, TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, người thầy, người cô luôn nhiệt tình giúp đỡ, hết lòng chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Hóa sinh Dược – trường Đại học Dược Hà Nội; các anh chị nghiên cứu viên của phòng Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu đã giúp đỡ cũng như tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể các thầy cô giáo cùng cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ mang lại cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Sau đại học và các phòng ban khác trong trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là PGS.TS Nguyễn Thị Song Hà, ThS Chu Lê Mai đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành chương trình đào tạo thạc sỹ đúng thời hạn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự yêu thương và biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn bên tôi, ủng hộ tôi và là chỗ dựa tinh thần của tôi khi gặp khó khăn trong học tập cũng như trong cuộc sống

Hà Nội, ngày 14 tháng 04 năm 2019

Học viên cao học

Trần Nguyên Hồng

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Rối loạn lo âu 3

1.1.1 Khái niệm rối loạn lo âu 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Sinh hóa thần kinh trong rối loạn lo âu 3

1.1.4 Tác động của stress oxy hoá và các bệnh lý trên mô hình động vật 10

1.1.5 Thuốc điều trị rối loạn lo âu 12

1.1.6 Sử dụng dược liệu trong điều trị rối loạn lo âu 14

1.1.7 Các mô hình thực nghiệm đánh giá tác dụng giải lo âu của thuốc trên động vật thí nghiệm 15

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 18

1.2.1 Thành phần hoá học của chi Corydalis 18

1.2.2 Một số tác dụng sinh học của các hoạt chất có trong các loài thuộc chi Corydalis 18

1.2.2.1 Tác dụng an thần và chống co giật 18

1.2.2.2 Tác dụng ức chế Acetylcholinesterase (AchE) và butylcholinesterase (BchE) 19

1.2.3.Về loài Cải cần - Corydalis balansae Prain 21

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.2 Nguyên vật liệu và đối tượng nghiên cứu 24

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2.1.1 Nguồn gốc 24

2.2.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 24

2.2.2 Động vật thí nghiệm 25

2.2.3 Hoá chất và trang thiết bị 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Nghiên cứu tác dụng giải lo âu cao chiết ethanol từ cải cần 27

2.3.1.1 Trên mô hình chuột cô lập 27

2.3.1.2 Thử nghiệm mê lộ chữ thập nâng cao (Elevated plus-maze - EPM) 28

2.3.1.3 Thử nghiệm treo đuôi chuột (Tail suspension test - TST) 29

2.3.1.4 Thử nghiệm bơi cưỡng bức (Force Swimming Test - FST) 30 2.3.2 Đánh giá tác dụng chống oxy hoá của cao chiết ethanol toàn phần 31

2.3.2.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính dọn gốc DPPH 31

2.3.2.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính dọn gốc Superoxide 32

2.3.3 Định lượng hàm lượng BNIP3 trong não 33

2.3.3.1 Tách chiết ARN 34

2.3.3.2 Phiên mã ngược tạo cADN 34

2.3.3.3 Định lượng gen BNIP3 trong não chuột thí nghiệm bằng phương pháp real-time PCR 35

2.3.4 Xử lý số liệu 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 38

3.1 Đánh giá tác dụng giải lo âu cao chiết cải cần 38

3.1.1 Thử nghiệm mê lộ chữ thập nâng cao (Elevated plus-maze - EPM) 38

3.1.2 Thử nghiệm treo đuôi chuột (Tail suspension test - TST) 39

3.1.3 Thử nghiệm bơi cưỡng bức (Force Swimming Test - FST) 41

3.2 Đánh giá hoạt tính chống oxy hoá của cao chiết cải cần 42

3.2.1 Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine)

42

3.2.2 Hoạt tính dọn gốc superoxide 44

3.3 Đánh giá mức độ biểu hiện gen BNIP3 trong não chuột thí nghiệm 45

4.1 Về tác dụng giải lo âu của cao chiết cồn cải cần trên các mô hình chuột cô lập cộng đồng 47

4.1.1 Về mô hình gây stress cho chuột bằng nuôi cô lập 47

4.1.2 Về kết quả đánh giá tác dụng giải lo âu của cao chiết cải cần trên chuột nhắt nuôi cô lập 48

4.2 Về cơ chế tác dụng của cao chiết cải cần 51

4.2.1 Về kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết cải cần 51

4.2.2 Về mức độ biểu hiện gen BNIP3 trong não chuột thí nghiệm 52

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AChE Achetycholinesterase Enzym thủy phân este của

achetylcholine

ADR Adverse Drug Reaction Phản ứng có hại của thuốc

butylcholine BDNF Brain-derivated neurontrophic

factor

Các yếu tố hướng thần kinh

BNIP3 BCL2/adenovirus E1B 19 kDa

interacting protein 3

Protein thuộc họ protein Bcl2

DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

cao FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và

Dược phẩm Hoa Kỳ

GABA γ-aminobutyric acid γ-aminobutyric axit

IC50 The half maximal inhibitory

concentration

Nồng độ ức chế một nửa giá

trị cực đại MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 Một dòng tế bào ung thư vú

NG108-15 Mouse neuroblastoma x Rat

glioma hybrid

Một dòng tế bào nguyên bào

sợi thần kinh PCR Polymerase Chain Reaction Chuỗi phản ứng kéo dài mạch

qPCR Quantitative Polymerase Chain

Reaction

Phản ứng định lượng nhờ chuỗi phản ứng kéo dài mạch

RT-PCR Reverse transcription PCR Phiên mã ngược PCR

phân tử oxy TST Tail-suspension Test Mô hình thử nghiệm treo đuôi

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc của protein thành viên của họ Bcl-2 7

Hình 1.2: Cơ chế BNIP3 cảm ứng gây chết tế bào 9

Hình 1.3: Các nhóm hợp chất isoquinoline alkaloid trong các loài Corydalis [51] 18

Hình 1.4: Hình ảnh loài Cải cần (Corydalis balansae Prain.) 22

Hình 2.1: Sơ đồ chiết cao toàn phần Cải cần bằng ethanol 25

Hình 2.2: Tiến trình thực hiện thí nghiệm [22, 27] 27

Hình 2.3: Mô hình mê lô chữ thập EPM 29

Hình 2.4: Mô hình treo đuôi chuột TST 30

Hình 2.5: Mô bơi cưỡng bức FST 31

Hình 2.6: Phản ứng của gốc DPPH với các gốc khác (•R= •H, gốc alkyl,…) 31

Hình 2.7: Tính khử của NBT khi phản ứng với gốc anion superoxide tạo ra bởi phản ứng của PMS-NADH 33

Hình 3.1: Tác dụng giải lo âu của cao cồn Cải cần được đánh giá bằng thử nghiệm mê lộ chữ thập (EPM) 39

Hình 3.2: Tác dụng trên mô hình treo đuôi chuột (TST) 40

Hình 3.3: Tác dụng trên mô hình bơi cưỡng bức (FST) 42

Hình 3.4 : Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH 43

Hình 3.5 : Hoạt tính dọn gốc Superoxide 44

Hình 3.6: Tỷ lệ biểu hiện mARN của gen BNIP3 và β-actin 46

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Hoạt tính ức chế AChE và BChE của một số alkaloid chiết từ các loài

Corydalis [51] 21

Bảng 2.1: Hỗn hợp phản ứng 32

Bảng 2.2: Thành phần cho một phản ứng 33

Bảng 2.3: Trình tự mồi BNIP3 sử dụng cho phản ứng qPCR [22, 70] 36

Bảng 3.1: Hàm lượng ARN tổng số 46

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, rối loạn lo âu (anxiety disorders) đang là một vấn đề cấp thiết do tình trạng mắc các chứng bệnh này ngày càng tăng nhanh, ảnh hưởng nặng nề sức khỏe của người bệnh cũng như gánh nặng cho gia đình và cộng đồng Theo thống kê của WHO [55]có khoảng 264 triệu người mắc rối loạn tâm thần trong năm 2015 (chiếm 3,6% dân số toàn cầu) Tỷ lệ mắc rối loạn tâm thần giữa các nước, các khu vực trên thế giới có sự khác nhau, từ 3,1% dân số ở Nhật Bản cho đến 6,3% dân số, ở Mỹ Tại Việt Nam, hiện có khoảng 1,9 triệu trường hợp gặp các rối loạn tâm thần chiếm 2,2% dân số Tỷ lệ độ tuổi mắc các rối loạn trải dài

từ 15 đến 80 tuổi, trong đó tỷ lệ phụ nữ mắc cao gần gấp đôi ở nam giới do đặc điểm sinh lý dễ nhạy cảm và có giai đoạn mang thai dễ mắc các rối loạn về lo âu

Rối loạn lo âu thực sự là gì? Đó là một trạng thái bệnh lý thể hiện sự lo lắng hoặc lo sợ quá mức trước một tình huống xảy ra, có tính chất vô lý, lặp lại và kéo dài gây ảnh hưởng đến sự thích nghi với cuộc sống người bệnh Đây là một trong những rối loạn tâm lý rất dễ mắc phải, có xu hướng ngày một gia tăng thường kết hợp với các rối loạn phức tạp khác như rối loạn hành vi giấc ngủ, trầm cảm [6] Hiện nay, phương pháp điều trị rối loạn lo âu chủ yếu là phối hợp liệu pháp tâm lý kết hợp với sử dụng các thuốc giải lo âu Các thuốc này chủ yếu

là các thuốc có nguồn gốc hoá dược là dẫn chất của benzodiazepine, buspirone

và các thuốc chống trầm cảm ức chế chọn lọc tái thu hồi serotonin hoặc chống trầm cảm 3 vòng [45] Việc sử dụng các thuốc có nguồn gốc hoá dược trong thời gian dài và tác động lên hệ thần kinh trung ương làm xuất hiện nhiều tác dụng phụ như lệ thuộc thuốc cộng thêm giá thành cao của các thuốc điều trị hướng thần điều trị trong thời gian dài là một vấn đề đáng quan tâm Vì vậy sử dụng thuốc và sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu được coi là một hướng đi tiềm

2

năng bổ sung và thay thế cho các thuốc có nguồn gốc hoá dược trong điều trị các bệnh về tâm thần nói chung và rối loạn lo âu nói riêng [57]

Chi Corydalis (họ Papaveraceae), bao gồm hơn 400 loài ở Châu Âu và Bắc

Mỹ, là một nguồn giàu alkaloids isoquinoline với các đặc tính sinh học khác nhau bao gồm các tác dụng ức chế acetylcholinesterase, hoạt tính chống tăng sinh/chống ung thư, giảm đau, chống viêm, an thần và tác động chống chống co

giật [51] Trong y học cổ truyền Cải cần (Corydalis balansae Prain.) đã được sử

dụng từ lâu đời Trong cuốn sách “Dược thảo toàn thư” của tác giả Andrew Chevallier (2006), chỉ ra Cải cần có 3 tác dụng chính: giảm đau, chống co giật

và an thần Một alkaloid khác được phân lập từ loài cây thuốc này là

l-Tetrahydropalmatin có tác dụng giảm đau, an thần, đồng thời ngăn chặn hấp thu acid amin trong hệ thần kinh trung ương, kich thích tuyến yên sản sinh ra hormon adrenocorticotropic có tác dụng giảm stress [7] Tuy nhiên, tại Việt Nam lại chưa có bằng chứng khoa học nghiên cứu chứng minh tác dụng dược lý

và cơ chế tác dụng của loài cây thuốc này, đặc biệt là trên lĩnh vực dược lý tâm thần, cụ thể trên rối loạn lo âu Do vậy, chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu tác dụng giải lo âu trên chuột nhắt cô lập cộng đồng và bước đầu nghiên

cứu cơ chế của cao chiết ethanol toàn phần từ cây cải cần (Corydalis balansae Prain.) với 2 mục tiêu cụ thể :

1 Đánh giá được tác dụng giải lo âu của cao chiết ethanol cải cần trên mô hình chuột cô lập cộng đồng (SI) thông qua ba mô hình hành vi là mê lộ chữ thập (EPM), treo đuôi chuột (TST) và bơi cưỡng bức (FST)

2 Bước đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng của cao chiết ethanol cải cần trên tế bào thần kinh trung ương (đánh giá khả năng chống oxy hoá và sự thay đổi biểu hiện của gen BNIP3)

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Rối loạn lo âu

1.1.1 Khái niệm rối loạn lo âu

Rối loạn lo âu (anxiety disorder) là một trong những rối loạn tâm lý phổ biến có xu hướng ngày càng gia tang thường kết hợp với nhiều rối loạn khác như mất ngủ, trầm cảm, rối loạn ăn uống, rối loạn hành vi Lo âu bệnh lý là sự lo

sợ quá mức trước một tình huống xảy ra, có tính chất vô lý, lặp lại; các triệu chứng thường nặng, kéo dài dai dẳng, ảnh hưởng tới hoạt động hàng ngày của người bệnh Rối loạn lo âu còn gặp trong nhiều bệnh lý tâm thần và bệnh hệ thống khác Trầm cảm và lo âu thường đi kèm với nhau, khoảng 3/4 bệnh nhân trầm cảm có lo âu kèm theo và trên 1/2 bệnh nhân lo âu có biểu hiện trầm cảm

rõ rệt

1.1.2 Phân loại

Theo phân loạn DSM-IV-TR của Hiệp Hội tâm thần Hoa Kỳ (2000) và

Hệ thống phân loại bệnh tật quốc tế ICD-10, rối loạn lo âu được chia thành các loại [64]:

 Rối loạn lo âu toàn thể (Generalised anxiety disorder)

 Rối loạn ám ảnh- cưỡng chế (Obsessive-compulsive disorder)

 Rối loạn hoảng sợ (Panic disorder)

 Rối loạn ám ảnh xã hội (Social phobia)

 Rối loạn căng thẳng sau chấn thương (post-traumatic stress disorder, PTSD)

 Rối loạn căng thẳng cấp (acute stress disorder)

1.1.3 Sinh hóa thần kinh trong rối loạn lo âu

1.1.3.1 Mối liên hệ giữa thần kinh và nội tiết trong rối loạn lo âu

Stress kéo dài được biết đến là yếu tố nguy cơ chủ yếu đối với nhiều rối loạn tâm thần, bao gồm lo lắng và trầm cảm [48] Khi tiếp xúc với các yếu tố stress trong môi trường, cơ thể sẽ phản ứng lại bằng điều chỉnh để tự cân bằng lại, bao gồm cả thay đổi trục vùng dưới đồi- tuyến yên – tuyến thượng thận (trục

4

HPA), và hoạt hoá hệ thống các tuyến nội tiết thần kinh [59] Hoạt hoá trục HPA đẩy stress lên cực điểm và giải phóng ra corticosterone (CORT) từ tuyến thượng thận Quá trình này được điều khiển bởi hoạt động của tế bào thần kinh thuộc vùng đồi hải mã (HPC) và vùng vỏ não trước trán (PFC), con đường này điều hoà ngược ức chế lên trục HPA Điều đáng chú ý, những báo cáo về tăng và giảm hoạt hóa của trục HPA dễ hình thành các rối loạn tâm thần [56, 58, 59] Trong nghiên cứu tiến hành trên động vật thí nghiệm, stress trong thời kỳ thai sản của chuột mẹ sẽ tăng cường điều hòa ngược làm ức chế đáp ứng stress của trục HPA, làm tăng cường corticosterone và ACTH của con con, những ảnh hưởng này còn phụ thuộc vào giới tính và tuổi Trong nghiên cứu cô lập các chuột còn non để gây stress, kết quả cho thấy có sự tăng hàm lượng ACTH và corticosterone sau khi gây stress, tăng hàm lượng yếu giải phóng corticosterone (CRF) trong dịch não tủy, tăng biểu hiện các mARN của CRF ở vùng nhân đồi hải mã và giảm thụ thể CRF ở tuyến yên, các chuột này cũng biểu hiện ra hành

vi sợ hãi co cứng người, giảm thời gian khám phá môi trường mới và tăng sự giật mình khi đáp ứng âm thanh [64]

1.1.3.2 Yếu tố di truyền liên quan tới rối loạn lo âu

Rất nhiều nghiên cứu trên động vật thí nghiệm để nghiên cứu các gen liên quan tới rối loạn lo âu trên mô hình động vật thực nghiệm bằng cách tạo các chuột đột biến loại bỏ gen quan tâm và tiến hành đánh giá hành vi để xác định các gen ảnh hưởng và tác động tới sự hình thành các hành vi liên quan tới lo âu Một trong các gen được cho liên quan tới rối loạn lo âu là gen mã hóa thụ thể 5-

HT1A, đích tác dụng của nhiều thuốc giải lo âu theo cơ chế ức chế tái hấp thu chọn lọc serotonine (SSRI) Khi thụ thể 5-HT1A bị bất hoạt thể hiện ra kiểu hình

ở chuột thí nghiệm là tim đập nhanh và tăng cường đáp ứng sợ hãi [64]

Một số nghiên cứu về cơ sở sinh học nhận thấy các triệu chứng của rối loạn này có liên quan đến các bất thường sinh học trong cấu trúc và chức năng não Các nghiên cứu này đã đưa đến giả thuyết cho rằng sự rối loạn điều chỉnh (dysregulation) của hệ thần kinh trung ương và ngoại biên có liên quan tới sinh

5

lý bệnh rối loạn hoảng sợ Hệ thần kinh giao cảm của một số bệnh nhân mắc chứng rối loạn hoảng sợ được cho là bị tăng trương lực giao cảm, thích ứng chậm với các kích thích mạnh và đáp ứng quá mức với các kích thích trung bình Gen mã hóa cho yếu tố dẫn truyền thần kinh GABA được cho là liên quan tới bệnh lý rối loạn lo âu Trong nghiên cứu chuột bất hoạt thụ thể GABA-A, thiếu hụt tiểu phân γ2 của thụ thể GABA-A làm tăng cường hành vi lo âu trong các thử nghiệm sợ hãi bẩm sinh và sợ hãi được luyện tập Ngoài ra, biến đổi một trong các dạng của axit glutamic decarboxylase (GAD, GAD65), một enzyme liên quan tới tổng hợp GABA, thể hiện tăng biểu hiện hành vi sợ hãi trong các thử nghiệm không gian mở và mê lộ số không nâng cao [64] Hàm lượng noradrenaline tăng cao trong các rối loạn lo âu cũng cho thấy có khả năng liên quan tới nguyên nhân gây bệnh Một số nghiên cứu trên mô hình loại bỏ các yếu

tố liên quan tới yếu tố dẫn truyền thuộc hệ thần kinh noradrenergic, chuột đột biết gen MAO-A – enzyme liên quan tới chuyển hóa noradrenaline, thể hiện giảm lo lắng; chuột bị bất hoạt gen mã hóa thụ thể α2-adrenergic làm tăng biểu hiện lo lắng trong thử nghiệm hộp sáng/tối và thử nghiệm mê lộ chữ thập nâng cao Một số cơ chế khác cũng được cho liên quan tới sợ hãi và lo âu như yếu tố dẫn truyền thuộc hệ glutamatergic và peptidergic, các yếu tố này có thể không liên quan trực tiếp tới lo âu nhưng góp phần vào thể hiện biểu hiện hành vi lo âu [64]

1.1.3.3 Thoái hóa thần kinh với rối loạn lo âu

Thoái hóa thần kinh là kết quả của chết các tế bào thần kinh, do chết tế bào trực tiếp hoặc quá trình chết theo chu trình Các yếu tố nguy cơ được biết đến tác động tới thoái hóa thần kinh bao gồm đa hình di truyền và già hóa Các nguyên nhân có thể khác có thể bao gồm giới tính, hệ thống giáo dục lạc hậu, hệ nội tiết, stress oxy hóa, yếu tố viêm, đột quỵ, tăng huyết áp, tiểu đường, hút thuốc, chấn thương đầu, trầm cảm, nhiễm trùng, khối u, thiếu vitamin, điều kiện miễn dịch và trao đổi chất, và phơi nhiễm hóa chất Các bệnh thoái hóa thần kinh là nguyên nhân dẫn đến rất nhiều bệnh lý thần kinh ví dụ bệnh Alzheimer

6

(AD), bệnh Parkinson, bệnh sa sút trí tuệ trán thái dương (FTD),… Các bệnh thoái hóa thần kinh được cho là ảnh hưởng chủ yếu đến các quá trình nhận thức (ví dụ: trí nhớ, khả năng trực giác, ngôn ngữ, kiểm soát điều hành, tính toán) và

do đó không kiểm soát được quá trình cảm xúc và tương tác xã hội Lo lắng là một triệu chứng phổ biến trong nhiều bệnh thoái hóa thần kinh, với ước tính tỷ

lệ phổ biến từ 5% đến 21% đối với các rối loạn lo âu và từ 8% đến 71% đối với các triệu chứng lo âu Trong suy giảm nhận thức nhẹ (MCI) và bệnh lý Alzheimer, phần lớn bệnh nhân có triệu chứng lo âu Các biểu hiện phổ biến của

sự lo lắng ở bệnh nhân mắc Alzheimer bao gồm vẻ ngoài lo lắng, sợ hãi (ví dụ,

sợ bị bỏ lại một mình), căng thẳng, bồn chồn (Ferretti et al 2001) Các nghiên cứu trước đây được thực hiện ở cả trên động vật và con người đã phác họa hệ mạch thần kinh tham gia hình thành sự sợ hãi Những mô hình thần kinh học này nhấn mạnh vai trò của hạch hạnh nhân (amygdala) là một cấu trúc chính trong phản ứng sợ hãi (LeDoux 2000) Khung mô hình này cũng chỉ ra sự kết hợp của sự tăng cường vận động trong các hệ thống tạo cảm xúc và giảm hoạt động trong các hệ thống điều tiết cảm xúc giúp điều chỉnh các phản ứng sợ hãi Minh chứng giả thuyết này, nhiều nghiên cứu của fMRI đã phát hiện ra rằng những người mắc chứng rối loạn lo âu có hoạt động cao hơn ở vùng hạch hạnh nhân, insula, vỏ não trước và vỏ não trước trán để đáp ứng với các dấu hiệu cảm xúc tiêu cực (Etkin & Wager 2007, Freitas) Các phân tích về kết nối nội tại ở những người mắc chứng lo âu cũng đã tìm thấy kết nối nội tại tăng cường giữa amygdala và vỏ não trước và các cấu trúc tạo cảm xúc khác (Pannekoek et al 2013) và giảm sự liên kết giữa các bộ tạo cảm xúc (ví dụ, amygdala) orbitofrontal và vỏ não trước trán (Etkin et al 2009, Hahn et al 2011)

7

Hình 1.1: Cấu trúc của protein thành viên của họ Bcl-2 Các trung tâm BH

1,2,3 tương đồng của họ Bcl-2 và thành viên chỉ chứa trung tâm BH3 Đa số thành viên đều có trung tâm xuyên màng (TM) BNIP3 còn có thêm trung tâm PEST - tham gia giáng hóa protein và CD- vùng bảo tồn xuất hiện ổn định từ C

elegens tới người.

Vai trò gen BNIP-3 với gây chết tế bào BNIP3 (BCL2/adenovirus E1B 19

kDa interacting protein 3) là protein thuộc họ Bcl-2 chứa vùng trung tâm BH3 Các vùng khác được tìm thấy trong BNIP3 là vùng PEST có vai trò liên quan tới giáng hóa, vùng được bảo tồn từ Caenorhabditis elegans sang tới người và một miền xuyên màng (TM), có vai trò liên quan tới ty thể (Hình 1.1)[63] Protein chứa vùng BH3 điều hòa quá trình chết theo chu trình bằng cách gắn với các thành viên của họ protein Bcl-2 Tuy nhiên, BNIP3 khác với các thành viên này,

vì miền BH3 của nó không tương tác với các thành viên khác của họ Bcl-2, việc xóa miền BH3 ở BNIP3 không ảnh hưởng đến khả năng gây ra cái chết tế bào BNIP3 tương tác với Bcl-2 và Bcl-XL thông qua vùng TM và đầu tận N (axit amin 1-49), loại bỏ vùng TM làm ngăn chặn khả năng BNIP3 gây chết tế bào BNIP3 di chuyển ở 30 và 60 kDa, chỉ ra rằng BNIP3 là một protein hình thành các chất đồng hóa Quá trình đồng hóa này chủ yếu thông qua miền TM của BNIP3 Cấu trúc độc đáo của miền TM cho thấy rằng các bộ điều chỉnh BNIP3

có thể hoạt động như các kênh proton trong màng ty thể bên ngoài làm tăng độ dẫn ion Có ba kiểu chết tế bào chính trong cơ thể gồm: hoại tử, tự thực bào và chết theo chu trình Hoại tử được đặc trưng bởi căng phồng ty thể, mở lỗ thấm,

8

mất điện thế màng ty thể (Δψm) và tạo các gốc oxy hóa (ROS) Điều này dẫn đến vỡ tế bào và giải phóng các thành phần bên trong tế bào ra ngoài [63] Tự thực bào là một hệ thống thoái hóa nội bào thường nhằm mục đích tái sử dụng protein và biến đổi cơ quan đặc trưng bởi sự hình thành các thể tự thực bào Thông thường quá trình tự thực bào được coi là một cơ chế sinh tồn để cung cấp chất dinh dưỡng cho các tế bào bị stress, tuy nhiên hiện tượng này kéo dài sẽ dẫn tới sự chết của tế bào Chết theo chu trình là một quá trình được kiểm soát chặt chẽ có liên quan đến cân bằng nội mô, phát triển và loại bỏ các tế bào bị nhiễm hoặc bị hư hại Quá trình này đặc trưng bởi quá trình ngưng tụ chromatin,

rỏ rỉ màng, tăng biểu hiện phosphatidyl serine bên ngoài màng và hình thành các đám gây chết Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng BNIP3 gây ra cả ba loại chết

tế bào (Hình 1.2) [63]

Khi BNIP3 được biểu hiện quá mức hoặc cảm ứng do stress trong tế bào,

nó sẽ gắn vào ty thể thông qua vùng TM Vùng này tích hợp vào màng ngoài của ty thể, gây tăng sản sinh ROS, mở lỗ PT và gây mất điện thế màng Δψm Rối loạn chức năng ty thể do BNIP3 gây ra xảy ra ở từng loại tế bào cụ thể Trong tế bào cơ tim, khu trú BNIP3 ở ty thể gây ra sự giải phóng cytochrom c dẫn đến việc kích hoạt caspase và quá trình chết theo chu trình Trong tế bào thần kinh, BNIP3 có liên quan đến việc giải phóng endonuclease G từ ty thể nhưng thay cho cytochrome c điều này dẫn đến gây chết tế bào không phụ thuộc

caspases Trong các tế bào biểu mô, sự biểu hiện quá mức của BNIP3 không giải phóng protein từ ty thể và không hoạt hóa caspases Việc điều hòa BNIP3 ở ty

thể vẫn chưa được biết rõ; tuy nhiên, một số bằng chứng cũng đề cập tới BNIP3

có thể điều chỉnh chức năng của ty thể Trong các nguyên bào sợi murine bị

thiếu hụt Bax và Bak, BNIP3 không gây ra rối loạn chức năng ty thể và chết tế

bào Tuy nhiên khi Bax và Bak được khôi phục, BNIP3 cảm ứng cá gốc ROS,

mất điện thế màng và giải phóng cytochrom c Điều này chỉ ra rằng Bax và Bak

sẽ kết hợp với BNIP3 để gây chết tế bào ở ty thể Trong ty thể bị cô lập, dầu tận

C của BNIP3 đóng vai trò quan trọng trong việc gây ra sự suy giảm của ty thể

9

đối với điện thế màng và giải phóng cytochrom c Bcl-XL liên kết với vùng TM của BNIP3 làm ngăn chặn quá trình chết tế bào do BNIP3 gây ra BNIP3 cũng liên kết với acetyl-coenzyme A acyltransferase 2 (ACAA2) ở ty thể và biểu hiện quá mức ACAA2 cũng ngăn cản cảm ứng gây chết tế bào của BNIP3 ở tế bào u biểu mô gan và tế bào u tủy Do đó, sự điều hòa BNIP3 ở ty thể rất quan trọng đối với sự chết tế bào do BNIP3 gây ra, nhưng hậu quả chức năng trong ty thể

có thể khác nhau tùy thuộc vào loại tế bào

Hình 1.2: Cơ chế BNIP3 cảm ứng gây chết tế bào BNIP3 nhân đôi và chèn vào

màng ty thể, cảm ứng gây chết tế bào thông qua cả 3 con đường chết theo chu trình, hoại tử và tự thực bào BNIP3 cạnh tranh với Beclin 1 để gắn với Bcl-2,

Chết theo chu trình (Apotosis) Hoại tử

(Necrosis)

Tự thực bào (Autophagy)

Giải phóng Cytochrome c

10

khi Beclin 1 không gắn được với Bcl-2 sẽ cảm ứng quá trình tự thực bào BNIP3 cũng có thể gắn với Rheb và làm bất hoạt mTOR dẫn tới quá trình tự thực bào

1.1.4 Tác động của stress oxy hoá và các bệnh lý trên mô hình động vật

Mối tương quan giữa sản sinh các gốc hoạt hoá và các bệnh lý cũng đã được nghiên cứu và chứng minh Một dấu hiệu quan trọng của tổn thương oxy hóa là mức độ malondialdehyde (MDA), tăng ở những bệnh nhân có rối loạn liên quan đến lo âu MDA là một sản phẩm của peroxide hoá lipid kết quả của phản ứng giữa lipid và các gốc tự do Phép đo MDA được coi là chỉ số thay đổi oxy hóa chất béo và do đó gây ra stress oxy hóa [18] Ngoài ra, sản phẩm này của peroxide hoá lipid có thể có trong máu và nước tiểu Bulut và cộng sự [11] cho rằng MDA tăng có thể liên quan đến sinh bệnh học của một số bệnh tâm thần Chakraborty và cộng sự [15] đã chỉ ra rằng sự gia tăng mức độ nghiêm trọng ở bệnh nhân rối loạn ám ảnh (OCD) có thể liên quan đến các dấu hiệu peroxide hoá lipid tăng trong huyết thanh Các tác giả cho rằng sự gia tăng này

có thể được gây ra bởi tổn thương tế bào thần kinh ở một số khu vực nhất định của não Một nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng nồng độ MDA cao hơn đáng kể

ở những bệnh nhân bị OCD [10] Ngoài ra, một nghiên cứu cho thấy sự chăm sóc cho một thành viên trong gia đình bị ung thư tiến triển, được coi là một hoạt động rất căng thẳng, cũng làm tăng mức độ MDA trong nước tiểu trong lo lắng

và trầm cảm [34]

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng phụ nữ lo lắng thể hiện bằng sự tăng nhanh

hô hấp, kết quả dẫn tới hình thành và giải phóng superoxide anion [25] Phân hủy superoxide thành hydrogen peroxide (H2O2) được xúc tác bởi enzyme SOD,

và một số nghiên cứu đã phát hiện tăng hoạt động enzyme này để đáp ứng sự tăng cao của các gốc ROS ở bệnh nhân tâm thần [26-29] Một số khác biệt liên quan đến hoạt động của enzyme chống oxy hóa, chẳng hạn như GPx và CAT, cũng đã được tìm thấy ở bệnh nhân Các enzyme này rất quan trọng đối với sự cân bằng oxy hóa, vì chúng giúp cho sự phân hủy H2O2 thành nước Các nghiên

11

cứu cũng chỉ ra hoạt động của GPX thấp hơn ở hồng cầu của bệnh nhân bị rối loạn lo âu so với nhóm chứng khỏe mạnh [30, 31] Mặt khác, các nghiên cứu khác cho thấy hoạt động GPx cao hơn ở hồng cầu của bệnh nhân bị OCD hoặc

ám ảnh từ cộng đồng (SP) [32, 33]

Các nghiên cứu đã chỉ ra mối liên quan giữa stress oxy hóa và lo lắng ở động vật tiếp xúc với chế độ ăn uống đặc biệt hoặc mô hình gây căng thẳng Chuột được cho ăn với chế độ ăn giàu methionine đã tăng mức độ lo lắng trong thử nghiệm mê lộ chữ thập nâng cao và tăng hoạt động của enzyme superoxide dismutase (SOD) trong vỏ não khi so sánh với nhóm chứng [42] Một nghiên cứu khác gợi ý rằng chế độ ăn uống ngon miệng (giàu sucrose) dẫn đến một kiểu hình béo phì, tăng quá trình oxy hóa protein ở vỏ não phía trước và xuất hiện để gây ra hành vi lo lắng giống như ở chuột [5] Nó cũng chỉ ra rằng căng thẳng tâm lý (sử dụng một mô hình hộp tương tác) gây ra thiệt hại oxy hóa trong cơ masseter ở chuột có liên quan với hành vi lo âu Chuột stress thể hiện giảm tỷ lệ thời gian khám phá trong cánh mở trong thử nghiệm mê lộ chữ thập, giảm thời gian ở khu vực trung tâm trong mô hình không gian mở Ở những con chuột này cũng thể hiện giảm hoạt độ enzyme SOD, glutathione peroxidase và CAT, trong khi tăng hàm lượng MDA trong cơ masseter so với nhóm chứng [43] Một nghiên cứu sử dụng mô hình căng thẳng khác nhau, ứng suất kiềm chế mãn tính, cho thấy chuột đực căng thẳng có hành vi lo lắng tăng lên và sự phân mảnh ADN tăng lên ở vùng đồi hải mã (HPC) [6]

Một khía cạnh có vẻ trái ngược với ý tưởng tăng lo âu có liên quan đến stress oxy hóa, là các nghiên cứu ở chuột đực với tổn thương gây nhân cận não thất vùng dưới đồi (PVN) gây bởi 5,7-dihydroxytryptamine cho thấy tác dụng giảm hành vi lo âu như tăng thời gian khám phá cánh mở mê lộ chữ thập nâng cao, khi so sánh với những con chuột sinh lý Ngoài ra, mặc dù không có thay đổi đáng kể trong hoạt động SOD hoặc glutathione peroxidase trong thùy thái dương, mức độ tăng MDA đã được quan sát thấy trong các động vật có tổn thương PVN này [45] Vì PVN cần thiết cho phản ứng ứng suất [46], liên quan

L-có thể L-có của stress oxy hóa để gây ra sự lo lắng, L-có thể là một sự thay đổi trong tín hiệu nucleotide tuần hoàn Nó đã được chứng minh rằng stress oxy hóa dẫn đến hành vi lo sợ ở chuột, bị đảo ngược bởi sự ức chế phosphodiesterase-2 (một loại enzyme điều chỉnh tín hiệu cGMP và cAMP), có thể thông qua sự tăng cường tín hiệu qua cGMP-protein kinase G [50]

1.1.5 Thuốc điều trị rối loạn lo âu

Ba nhóm thuốc chính sử dụng trong điều trị bao gồm: thuốc chống trầm cảm, các benzodiazepine và các chất chủ vận thụ thể 5-HT1A của serotonin

 Các thuốc ức chế chọn lọc tái thu hồi serotonin (SSRI)

- Các thuốc trong nhóm: fluroxetin, paroxetine, fluvoxamine, sertalin, citalopram, escitalopram

- Cơ chế: Ức chế chọn lọc tái thu hồi serotonin về bọ dự trữ ở tận cùng tế bào thần kinh trước synap, làm tăng hoạt tính serotoninergic trung ương

- Chỉ định: Các SSRI là nhóm thuốc lựa chọn đầu tay trong nhiều thể lo âu bao gồm rối loạn ám ảnh cưỡng chế (fluroxetin, paroxetine, fluvoxamine,

13

sertalin), rối loạn hoảng loạn (sertalin, paroxetine), rối loạn ám ảnh xã hội (sertalin, paroxetine), rối loạn stress sau chấn thương (fluroxetin, paroxetine, sertalin) do hoạt phổ giải lo âu rộng và khả năng dung nạp tốt so với các thuốc khác

- Tác dụng không mong muốn: rối loạn tiêu hóa (buồn nôn, tiêu chảy, chán

ăn, đầy bụng), rối loạn tình dục (giảm ham muốn), rối loạn giấc ngủ, hội chứng cai thuốc và tương tác thuốc (ức chế enzyme chuyển hóa CYP2D6, CYP2C19, gây hội chứng serotonin khi dùng cùng tryptophan, lithi, IMAO và thuốc chống trầm cảm 3 vòng)

 Thuốc chống trầm cảm 3 vòng:

- Các thuốc trong nhóm: imipramine, clomipramine, doxepin

- Cơ chế: Ức chế tái thu hồi serotonin và noradrenalin về bọc dự trữ ở tận cùng tế bào thần kinh trước synap, làm tăng hoạt tính serotonin và noradrenalin trung ương

- Chỉ định: thuốc là lựa chọn thay thế (second line) trong điều rối loạn lo âu toàn thể, rối loạn hoảng loạn và rối loạn ám ảnh cưỡng chế

- Tác dụng không mong muốn: gây rối loạn thần kinh và tâm thần (hoang tưởng, ảo giác, ác mộng,…), kháng cholinergic (gây hạ huyết áp thế đứng, khô miệng, táo bón), rối loạn nội tiết (rối loạn kinh nguyệt, giảm tình dục,…),hội chứng cai thuốc khi dừng đột ngột

 Các benzodiazepine

- Các thuốc trong nhóm: diazepam, alprazolam, clonazepam

- Cơ chế: chất chủ vận thụ thể bonzodiazepin, một phần phức hợp “GABAA- kênh Cl” có nhiều ở đồi thị, hệ viền và vỏ não Sự gắn cảu BZD vào thụ thể tạo thuận lợi cho tác dụng ức chế của GABA, tăng số lần mở kênh Cl- qua trung gian GABA

- Chỉ định: BZD thuốc thay thế trong một số thể lo âu: rối loạn hoảng loạn (alprazolam, clonazepam), rối loạn ám ảnh xã hội (clonazepam) Khác với

 Chất chủ vận từng phần thụ thể 5-HT1A (buspirone)

- Chỉ định: điều trị trong rối loạn lo âu toàn thể Do khởi phát tác dụng chậm đồng thời không chắc chắn về hiệu quả chống tái phát khi dùng lâu dài nền buspirone là lựa chọn thay thế

- Tác dụng không mong muốn: buồn nôn, chóng mặt, đau đầu, mệt mỏi, buồn ngủ, đôi khi gây rối loạn vận động Nhìn chung, buspirone dung nạp tốt hơn so với BZD, ít gây bất lợi hơn trên đối tượng bệnh nhân cao tuổi

1.1.6 Sử dụng dược liệu trong điều trị rối loạn lo âu

Các biện pháp điều trị các rối loạn lo âu thường kết hợp giữa liệu pháp tâm lý

và các thuốc có nguồn gốc hóa dược bao gồm thuốc ức chế chọn lọc tái thu hồi serotonin, thuốc chống trầm cảm 3 vòng, benzodiazepine và thuốc chủ vận từng phần receptor 5-HT1A Các thuốc này đã được chứng mình có hiệu quả rõ rệt trên lâm sàng tuy nhiên sử dụng điều trị các thuốc này trong thời gian dài mang lại rất nhiều tác dụng không mong muốn và có thể gây ra hiện tượng lệ thuộc thuốc Chính vì vậy, sử dung các thuốc và sản phẩm có nguồn gốc dược liệu có tiềm năng được coi là hướng tiếp cận của các nhà nghiên cứu để khắc phục những nhược điểm của các thuốc từ hóa dược Có thể kể đến một số dược liệu được sử dụng để điều trị rối loạn lo âu như:

- Valerian (Valeriana officinalis L.), họ Valariaceae, còn gọi là cây nữ lang, thân và rễ được sử dụng rộng rãi để điều trị mất ngủ, giải lo âu, an thần Cơ chế tác dụng do acid valerenic ức chế enzyme GABA-transaminase, dẫn tới tác dụng an thần [8]

- Kava Kava (Piper methysticum G Forst), họ Piperaceae: là một loại thực vật sống ở vùng đảo Thái Bình Dương, rễ được sử dụng để điều trị lo âu

15

căng thẳng và bồn chồn; ngoài ra Kava Kava còn có tác dụng chống co thắt

và giãn cơ [37]

- Hops (Humulus lupulus), họ Cannabinaceae: còn gọi là hoa bia, có tác

dụng dịu thần kinh, giảm căng thẳng, lo âu Hops thương được sử dụng kết hợp với valerian [21]

- Zizyphi Spinosi Semen (ZSS) (hạt sấy khô của Ziziphus jujuba Millvar Spinosa), họ Rhamnaceae, sử dụng ở các nước châu Á để điều trị chứng lo âu

và mất ngủ Sanjoinine A (thành phần alkaloid chứng của ZSS) đã chứng minh là hoạt hóa kênh Cl và thụ thể GABA-benzodiazepine [67]

- Bạch quả (Ginkgo biloba) họ Ginkgoaceae, cao chiết từ lá đã được sử dụng

ở nhiều nước như Đức để điều trị suy giảm trí nhớ, giải lo âu Cao chiết lá cây bạch quả giúp ức chế quá trình hấp thu norepinephrine (NE), dopamine (DA) và 5-HT trong não chuột Ngoài ra một cao chiết của bạch quả có tên EGb 761 thể hiện tác dụng tham gia điều hòa chức năng của trục HPA [41, 43]

Ngoài ra, các dược liệu Matricaria recutita L., Passiflora incanata Linneaus (lạc tiên) và Scutellaria laterifola Georgi cũng được ghi nhận về hiệu quả ban đầu trong thử nghiệm lâm sàng[23]

1.1.7 Các mô hình thực nghiệm đánh giá tác dụng giải lo âu của thuốc trên động vật thí nghiệm

Hiện nay, phần lớn các thuốc mới được tìm ra nhờ phương pháp tiếp cận cổ điển trong các mô hình thí nghiệm trên động vật Phương pháp này cho khả năng dự đoán khá cao, tuy nhiên lại cung cấp ít thông tin về cơ chế phân tử liên quan đến tác dụng của thuốc nghiên cứu, chính vì vậy cần phối hợp các mô hình

và các phương pháp sinh học phân tử và sinh hóa thần kinh để nghiên cứu cơ chế của thuốc Bên cạnh đó, dựa vào mục đích thí nghiệm, đối tượng thí nghiệm

và điều kiện phòng thí nghiệm để đưa ra những lựa chọn mô hình khác nhau trong nghiên cứu sao cho phù hợp nhất Một số mô hình đánh giá hành vi tác dụng giải lo âu, chống trầm cảm:

16

- Mô hình chữ thập nâng cao (Elevated plus maze - EPM), Mô hình chữ T nâng cao (Elevated T maze - ETM)

- Mê lộ nước (Morris Water maze)

- Mô hình tương tác cộng đồng (Social interaction)

- Mô hình treo đuôi (Tail suspension test), mô hình bơi cưỡng bức (Force Swimming test)

- Mô hình không gian mở (Open field test), mô hình đo hoạt động tự nhiên (Spontaneous activity test)

- Mô hình đe dọa bởi động vật ăn thịt

 Mô hình mê lộ chữ thập nâng cao (EPM)

Mô hình chữ thập nâng cao là mô hình kinh điển để sử dụng trong sàng lọc các thuốc có tác dụng giải lo âu với tiêu chí đánh giá thời gian lưu tại cánh tay

hở Nguyên tắc của mô hình dựa trên tâm lý căng thẳng, sợ hãi với những khu vực hở và cao, thái độ thăm dò, khám phá của động vật thí nghiệm với môi trường lạ và mới Mô hình dược sử dụng trong rất nhiều nghiên cứu bởi mô hình thích hợp để đánh giá nhiều hợp chất tác dụng thông qua nhiều hệ receptor như GABA, serotonin, dopamine với độ lặp lại cao [13, 64] Mô hình EPM đá được

sử dụng để đánh giá tác dụng giải lo âu của một số dược liệu: Apocynum

venetum L [20] Panax ginseng C A Meyer[14], Passiflora incaARNta L.[17]

…

 Mô hình bơi cưỡng bức (FST)

Mô hình FST (còn được gọi là thử nghiệm bơi Porsolt) được phát triển đầu tiên cho chuột cống và sau đó được sửa đổi cho chuột nhắt bởi Porsolt và cộng

sự [31, 32] Đây là một thử nghiệm phổ biến được sử dụng để đánh giá hiệu quả của thuốc chống trầm cảm và tác dụng của các loại thuốc khác nhau tới hành vi

và sinh học thần kinh trong nghiên cứu cơ bản và tiền lâm sàng [30] Nó đã được mô tả như thể hiện một tình huống trong đó " hành vi tuyệt vọng " được gây ra; nghĩa là, con vật mất hy vọng thoát khỏi môi trường căng thẳng [30] Mô hình FST là một thử nghiệm hành vi tương đối ngắn và chi phí thấp, không yêu

17

cầu luyện tập cho chuột và có thể dễ dàng thiết lập Do tính phổ biến của nó, có rất nhiều dữ liệu liên quan đến tác dụng của các thuốc chống trầm cảm khác nhau trong FST FST sử dụng phổ biến trong nghiên cứu cơ bản liên quan đến sinh học thần kinh và di truyền rối loạn tâm trạng FST có hiệu lực dự đoán tốt, chỉ đáp ứng với các hợp chất có tác dụng trên người như thuốc chống trầm cảm [42] Tuy nhiên, FST không mô phỏng được hết toàn bộ trạng thái trầm cảm ở người do đó cần kết hợp với các mô hình, thử nghiệm khác để đánh giá

 Mô hình treo đuôi chuột (TST)

Mô hình TST được đưa ra bởi Steru và cộng sự dựa trên bị ảnh hưởng bởi thử nghiệm bơi cưỡng bức (FST) được phát triển trước đó [38] Tương tự như bài kiểm tra bơi cưỡng bức, chuột TST được đặt trong tình huống không thể giải thoát được nhưng ở mức độ stress vừa phải Bất lực trong vùng vẫy thoát khỏi trạng thái stress dẫn tới hành vi bất động Giống như thử nghiệm bơi cưỡng bức, TST là một thử nghiệm tốt để đánh giá hiệu quả chống trầm cảm của thuốc, nhưng cũng được sử dụng để đánh giá tác động của môi trường, sinh học thần kinh và di truyền Trái ngược với thử nghiệm bơi bắt buộc, trong TST không có nguy cơ hạ thân nhiệt do để chìm trong nước [39] Thử nghiệm FST và TST thoạt nhìn tương tự nhau, nhưng có sự khác biệt về độ nhạy và hiệu suất của chúng và kết quả của một thử nghiệm có thể không nhất thiết phải được thể hiện trong thử nghiệm khác Ví dụ, ở chuột NIH-Swiss, tính bất động của chuột có sự khác biệt lên tới 7 lần giữa mô hình FST và TST Trong khi tính bất động của chuột C57Bl/6 là tương tự nhau trong cả hai mô hình Ở chuột C57Bl/6, imipramine tạo ra đường cong đáp ứng liều "hình chữ U" trong FST, trong khi không có bằng chứng về phản ứng hai pha trong TST với liều lên tới 45 mg / kg Trong mô hình FST, chất LY451646 gắn thụ thể AMPA đều thể hiện đáp ứng theo liều ở cả chuột C57Bl/6 và NIH-Swiss, nhưng ở liều hiệu quả tối thiểu (MED) ở chuột NIH-Swiss thể hiện đáp ứng cao hơn gấp 5 lần [9] Thử nghiệm đòi hỏi chí phí thấp, kết quả khá tin cậy và dễ dàng thiết lập cũng như thu thập

18

dữ liệu cho nên mô hình TST được sử đụng một cách phổ biến để nghiên cứu các thuốc trên mô hình trầm cảm, lo âu

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

1.2.1 Thành phần hoá học của chi Corydalis

Cho đến nay có rất nhiều thành phần hoá học của chi Corydalis được tìm thấy

và phân loại, nhưng thành phần hoá học chiếm tỷ lệ lớn và đem lại nhiều tác dụng tiềm năng là các isoquinoline alkaloid, bao gồm aporphine, protopine, protoberberine, phthalideisoquinoline, benzylisoquinoline, morphinan và spirobenzylisoquinoline [51] (Hình 1.3)

Hình 1.3: Các nhóm hợp chất isoquinoline alkaloid trong các loài

19

không có hiệu quả [52] Bicuculline là một ví dụ điển hình của alkaloid của Corydalis ức chế thụ thể GABA [47] Isocoryne (β-hydrastine), một alkaloid

phthalideisoquinolin phân lập từ C pseudoadunca, ức chế GABA tế bào thần

kinh chuột cống theo cách tương tự với bicuculline và corlumine, nhưng có hoạt tính ức chế mạnh hơn [47] DL-Tetrahydropalmatine, một alkaloid khác được phân lập từ nhiều loài Corydalis, cho thấy hoạt động ức chế cơn động kinh ở chuột gây ra bởi picrotoxin [46] Picrotoxin tác động theo cơ chế làm giảm các

ức chế trung gian GABA cũng như tăng giải phóng amygdaloid dopamine [46] Theo tác giả Chang và cộng sự đã chứng minh rằng DL-tetrahydropalmatine tác động tới sự ức chế giải phóng amygdaloid dopamine [46] Dùng đồng thời 30 mg/kg DL-tetrahydropalmatine với picrotoxin (liều 3 và 4 mg/kg, s.c.) giảm thời gian chuyển động theo phương ngang, thời gian chuyển động theo phương thẳng đứng, chuyển động quay hướng di chuyển, quãng đường di chuyển và thời gian bất động ở chuột so với nhóm đối chứng sử dụng nước muối thay vì DL-tetrahydropalmatine [46] Trong một nghiên cứu khác, tiêm DL- Tetrahydropalmatine liều 20 và 30 mg/kg, 30 phút trước khi kích thích bằng điện hàng ngày, làm giảm số lượng co người và các chuyển động phản ứng với tác động bị kích điện Tác giả Lin và cộng sự chỉ ra DL-tetrahydropalmatine như một tác nhân chống động kinh và chống co giật hiệu quả [53]

1.2.2.2 Tác dụng ức chế Acetylcholinesterase (AchE) và

butylcholinesterase (BchE)

Acetylcholine (Ach) là một chất trung gian vận chuyển đóng vai trò quan trọng với hệ thần kinh ngoại vi và trung ưng Theo giả thuyết về hệ cholinergic, bệnh lý Alzheimer (AD) là nguyên nhân chủ yếu gây ra chứng mất trí ở người già, đó là kết quả của việc giảm hàm lượng Ach trong vỏ não trước Hiện nay, việc ức chế AChE và BChE (là các enzyme chủ yếu loại bỏ acetylcholine) là

hướng tiếp cận chủ yếu trong điều trị AD Galantamine chiết từ loài Galanthus

wornowii là một trong những thuốc đầu tiên được FDA phê duyệt để điều trị AD

và tác dụng bằng cách ức chế AChE (ACheEI) Ở Đan Mạch và Trung Quốc

20

trong y học cổ truyền nhiều loài thuộc chi Corydalis đước sử dụng giúp tăng cường trí nhớ và nhiều nghiên cứu thực nghiệm sau này đã chứng minh hiệu quả [44, 61]

Năm 2006, Adsersen và cộng sự chỉ ra dung dịch và dịch chiết methanol của 11 dược liệu được sử dụng trong y học cổ truyền Đan Mạch và một số loài Corydalis cho thấy khả năng ức chế mạnh AChE [44] Dịch chiết methanol từ củ

của loài C solida (L.) Swartz ssp slivenensis và C intermedia (L.) Merat với

nồng độ 0,1 mg/ml cho thấy ức chế 97% hoạt độ enzyme Ngoài ra, dịch chiết

methanol từ củ của loài C solida (L.) Swartz ssp laxa và C cava (L.) Schw et

K ở nồng độ 0,1 mg/ml cho thấy lần lượt 96% và 92% ức chế hoạt độ enzyme [44] Trong số các alkaloid, dehydrocorydaline, coptisine, berberine,

jatrorrhizine, and palmatine chiết từ cây C yanhusuo cho thấy tác dụng mạnh ức

chế AChE với giá trị IC50 lần lượt là 0,62; 1,01; 0,47; 2,08 và 0,74 µM [60] Theo tác giả Bae và cộng sự (2008) sàng lọc một số dược liệu cổ truyền Hàn

Quốc dùng để tăng cường trí nhớ cũng cho thấy C turtschaninovii có tác dụng

ức chế AChE Nghiên cứu chỉ ra 16 alkaloid được phân lập, trong đó pseudoberberine được tiến hành thử nghiệm tác động ngăn ngừa mất trí ở chuột nhắt Nghiên cứu đã chứng minh pseudoberberine (liều 5,0 mg/kg) có tác động đối kháng lại suy giảm nhận thức do scopolamine (liều 1,0 mg/kg, i.p) gây ra [49] Ngoài ra các dữ liệu về các alkaloid chiết từ các loài Corydalis với tác dụng ức chế AChE và BChE được tổng hợp lại trong Bảng 1.1

21

Bảng 1.1: Hoạt tính ức chế AChE và BChE của một số alkaloid chiết

từ các loài Corydalis [51]

1.2.3 Về loài Cải cần - Corydalis balansae Prain

Cây Cải cần có tên khoa học là Corydalis balansae Prain., thuộc chi

Corydalis, phân họ Cựa ri (Fumariaceae), bộ Anh túc (Papaverales), phân bố chủ yếu ở Việt Nam, Lào và Nam Trung Quốc [3] Chi Corydalis có khoảng 300 loài thuộc họ thuốc phiện, phân bố chủ yếu ở Trung Quốc và miền Nam Châu Phi Thành phần hóa học chính của các loài thuộc chi này là các alkaloid như corydalis L, corydaline, tetrahydropalmatine, protopine… Nhiều nghiên cứu đã chứng minh các loài thuộc chi Corydalis có tác dụng giảm đau, đau bụng khi hành kinh, chống co giật, an thần

Ở Việt Nam, cây cải cần mọc hoang ở Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Bắc Giang đến Ninh Bình, Thanh Hóa Đây là loại cỏ sống hằng năm cao khoảng 50cm Thân khía dọc, không có lông Lá có phiến dài, 10-15cm, 2-3 lần kép, không long, lá phụ có thùy tròn, mặt dưới mốc mốc, gân phụ mảnh Hoa

22

mọc thành bông đối diện với lá Lá bắc hình mũi mác, dài hơn cuống hoa Hoa

xếp về một phía của chùm, màu trắng hay hơi vàng, hình trụ 2 lá đài, khía răng

nhỏ 4 cánh hoa; cánh hoa ngoài kéo dài ở dưới các lá dài thành một cái túi,

ngọn có một cái hố nhỏ hình quả trám; cánh hoa tiếp theo đối diện với cánh

trước, gốc thót lại thành móng; hai cánh hoa trong đối diện với nhau 6 nhị, hàn

liền với nhau bởi chỉ nhị thành hai nhóm, mỗi nhóm 3 nhị Nhụy hẹp, dài bằng

nhị, thuôn dần ở ngọn thành vòi hình sợi chỉ, đầu nhụy 2 thùy; nhiều noãn Quả

loại quả cải, tự mở thành 2 mảnh vỏ Hạt hình thận đen nhánh, áo hạt hay

mồng hình thuyền Cây ra hoa từ tháng 1-4 và ra quả từ tháng 3-6 hàng năm Ở

Trung Quốc, loài cây thuốc này được dùng làm thuốc trị sưng lở và bệnh viêm

da mạn tính [3]

Hình 1.4: Hình ảnh loài Cải cần (Corydalis balansae Prain.)

(Nguồn: http://www.zhiwutong.com)

Theo tác giả Andrew Chevallier (2006), Cải cần có 3 tác dụng chính: giảm

đau, chống co giật và an thần Tác dụng giảm đau của cải cần bằng 10% so với

morphin, chất làm giảm đau mạnh nhất là corydalin Một alkaloid khác được

phân lập từ loài cây thuốc này là l-Tetrahydropalmatin có tác dụng giảm đau, an

thần, đồng thời ngăn chặn hấp thu acid amin trong hệ thần kinh trung ương, kich

thích tuyến yên sản sinh ra hormon adrenocorticotropic có tác dụng giảm stress

Ngoài ra, còn có khoảng 20 loại alkaloid khác cũng đã được phát hiện ở cải cần

[5]

23

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu tác dụng giải lo âu trên chuột nhắt cô lập cộng đồng và bước đầu nghiên cứu cơ chế của cao chiết

ethanol toàn phần từ cây Cải cần (Corydalis balansea Prain.)

Bước đầu nghiên cứu cơ chế tác động của cao chiết

ethanol toàn phần từ cây cải cần trên tế bào thần kinh

trung ương

Đánh giá tác dụng giải lo âu của cao chiết ethanol cải cần trên chuột cô lập cộng đồng

Đánh giá khả năng dọn gốc tự

do superoxide

Đánh giá tác dụng giải lo

âu trên mô hình mê lộ chữ thập

Đánh giá tác dụng trên mô hình treo đuôi chuột

Đánh giá tác dụng trên mô hình bơi cưỡng bức Đánh giá sự thay đổi

biểu hiện của gen BNIP3

24

2.2 Nguyên vật liệu và đối tượng nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cao ethanol chiết từ toàn cây Cải cần (Corydalis balansae Prain.)

2.2.1.1 Nguồn gốc

Cải cần được thu hái tại Cao Bằng (tháng 4/2018) Dược liệu được PGS.TS Phạm Thị Thanh Huyền (Trưởng khoa Tài nguyên dược liệu – Viện Dược liệu) giám định mẫu và lưu mẫu tại Viện Dược liệu Dược liệu thu hái được phơi khô, sau đó được nghiền thành bột thô để chiết thu cao ethanol tổng phục vụ cho nghiên cứu

2.2.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Điều chế cao chiết được thực hiện bởi Khoa Hóa Phân tích, Viện Dược liệu Quy trình chiết cao ethanol cải cần được mô tả tóm tắt như sau (Hình 2.1): Dược liệu cải cần được thu hái đem phơi khô Dược liệu được ngâm trong dung môi ethanol 90% Sau đó chiết dược liệu hai lần với ethanol 70%, mỗi lần chiết trong

3 giờ Dịch chiết thu được đem lọc và thu hồi dung môi Cô đến khi khối lượng không đổi với hiệu suất 22,4%, và hàm ẩm 11,65% Mẫu cao chiết này được hòa tan trong nước để cho chuột uống trong suốt quá trình nghiên cứu

25

Hình 2.1: Sơ đồ chiết cao toàn phần Cải cần bằng ethanol

Cao thu được a (g) chiếm tỷ lệ 22,4 % so với dược liệu khô với hàm ẩm là 11,65% được gọi là cao cải cần (CC) Phương pháp định lượng được ghi trong phụ lục 1 và 2

2.2.2 Động vật thí nghiệm

Động vật được sử dụng trong nghiên cứu là chuột nhắt trắng chủng Swiss, giới đực, trọng lượng trung bình 18 - 20 g được cung cấp bởi Viện vệ sinh dịch

tễ Trung ương Chuột được chăm sóc và nuôi trong phòng thí nghiệm với nhiệt

độ duy trì 22 ± 1°C, ăn uống đầy đủ, chu kỳ sáng tối là 12/12 h (chu kỳ sáng từ 7:00 - 19:00) Chuột được nuôi ổn định 5 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm

22,4 g cao khô, hàm ẩm 11,65 %

26

2.2.3 Hoá chất và trang thiết bị

 Hóa chất

- Imipramin (Sigma - Aldrich, USA) được hòa tan bằng nước muối sinh lý để

sử dụng theo đường tiêm phúc mạc (i.p.), liều sử dụng là 8 mg/kg

- DPPH (1,1-Diphenyl – 2-picrylhydrazyl), Methanol, DMSO

- Tris–HCl, Nitroblue tetrazolium (NBT), NADH, Phenazine methosulfate (PMS)

- Taq polymerase, dNTP, Reverse Transcriptase M-MuLV, DTT, oligo dT (random hexamer), ARNase Inhibitor, RT buffer

- NaCl 0,9%

 Trang thiết bị

- Dụng cụ pha chế và chăm sóc chuột: chày, cối sứ, kim đầu tù, kim tiêm, găng tay, cồn, acid picric, cồn, cốc có mỏ, ống falcon, nước cất

- Ống PCR, pippet man, đầu côn các loại, khay đựng ống

- Hệ thống phân tích hành vi ANY-Maze (Stoelting Co., Wood Dale, IL)

- Máy Realtime-PCR, máy RT-PCR

- Máy ELISA

- Cân phân tích, cân kỹ thuật

- Mô hình mê lộ chữ thập nâng cao (EPM): Dụng cụ thí nghiệm được cấu tạo gồm 2 tay kín kích thước 30 x 5 x 15 cm (dài x rộng x cao), hai tay mở kích thước 30 x 5 x 0,25 cm vuông góc với nhau, trung tâm kích thước 5 x 5 cm Cường độ chiếu sáng 9-11 lux

- Mô hình treo đuôi (TST): hộp có kích thước Cao 55 cm x Rộng 60 cm x Sâu 11,5 cm và được chia làm 3 ngăn Thanh sắt tròn được vắt ngang trên đỉnh hộp có kích thước Ø 1 cm x dài 60 cm Có màn chắn giữa các chuột

27

- Mô hình bơi cưỡng bức (FST): bể chứa bằng thuỷ tinh (cao 20 cm x Ø 10 cm)

chứa nước có độ cao 10 cm, giữ ở nhiệt độ 25 oC Có màn chắn giữa các bể

thủy tinh

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu tác dụng giải lo âu cao chiết ethanol từ cải cần

2.3.1.1 Trên mô hình chuột cô lập

• Phương pháp tiến hành

Mô hình chuột cô lập được áp dụng theo phương pháp đang được tiến hành

tại phòng thí nghiệm Dược lý, Đại học Toyama, Nhật Bản, do GS Kinzo

Matsumoto nghiên cứu [27] Chia chuột ngẫu nhiên thành 5 lô (mỗi lô 10-12

con) như sau:

Lô 1: Chứng sinh lý (chuột bầy đàn), uống nước

Lô 2: Chứng bệnh lý (chuột cô lập), uống nước

Lô 3 - 4: Chuột cô lập, uống mẫu nghiên cứu với 2 mức liều là

1,12 g/kg và 2,24 g/kg

Lô 5: Chuột cô lập, uống Imipramin liều 8 mg/ kg

Gây stress cho chuột bằng phương pháp cô lập trong 5 tuần, sau đó cho

chuột uống mẫu nghiên cứu hoặc nước (nhóm chứng), hoặc uống đối chứng

dương (Imipramin) trong 2 tuần liên tiếp Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 2

lần, lấy kết quả trung bình và xử lý số liệu

Hình 2.2: Tiến trình thực hiện thí nghiệm [22, 27]

Ngày 0

- Ăn uống đầy đủ

- Cải cần 1,12 hoặc 2,24 g/kg, p.o

- Imipramine 8 mg/kg, i.p

Ngày 35

49 Chuột

Tách lấy não

và thu máu

Thử nghiệm TST

Thử nghiệm EPM

Tiến hành thử mẫu nghiên cứu