Nghiên cứu quy trình chiết xuất và tác dụng giải lo âu trên thực nghiệm của cao chiết từ cây ban di thực hypericum perforatum l

Đã có nghiên cứu về quy trình chiết xuất cao Ban di thực tại Việt Nam tuy nhiên chưa nghiên cứu sâu cũng như chưa có nghiên cứu về tác dụng giải lo âu của cao chiết cây Ban di thực này..

TRẦN ANH HOÀNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH

CHIẾT XUẤT VÀ TÁC DỤNG GIẢI

LO ÂU TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA CAO CHIẾT TỪ CÂY BAN DI THỰC

HYPERICUM PERFORATUM L

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

1 Bộ môn dược học cổ truyền

2 Viện dược liệu

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Để có được thành công của khóa luận này, lời đầu tiên em xin chân thành cảm

ơn sâu sắc đến TS Phạm Thị Nguyệt Hằng- Viện Dược liệu, người cô, người chị

luôn bên cạnh chỉ bảo cho em, hướng dẫn em trong quá trình thực hiện đề tài

Em cũng xin chân thành cảm ơn đến TS Đào Thị Thanh Hiền và ThS

Phạm Thái Hà Văn- Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội,

người cô và người thầy luôn hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện và đóng góp quý báu để

em hoàn thành tốt khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn đến các chị Nguyễn Thu Trang, chị Tạ Thị

Thủy- Khoa hóa thực vật 1 và các anh chị Khoa Dược lý Sinh hóa – Viện Dược liệu

đã động viên giúp đỡ em cả về vật chất lẫn tinh thần để em có thể hoàn thành tốt khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Đảng ủy nhà trường cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường đại học Dược Hà Nội đã trang bị đầy đủ kiến thức và động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn là chỗ dựa tinh thần, là những nguồn động viên to lớn đối với em ttrong cuộc sống và học tập

Hà Nội, tháng 5 năm 2015

Sinh viên Trần Anh Hoàng

MỤC LỤC

Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1.1 Nguyên liệu 15

2.1.2 Động vật thí nghiệm 15

2.1.3 Dung môi, hóa chất 15

2.1.4 Máy móc và dụng cụ 15

2.3.1 Phương pháp định lượng hypericin 16

2.3.2 Nghiên cứu hoàn thiện quy trình chiết xuất bán thành phẩm quy mô

phòng thí nghiệm

17

2.3.3 Nghiên cứu tác dụng giải lo âu trên chuột 19

3.2.1 Khảo sát dung môi chiết 22

3.2.2 Khảo sát tỷ lệ dược liệu/dung môi chiết xuất 23

3.2.3 Khảo sát lượng Vitamin C cho vào quy trình chiết 25

3.2.4 Khảo sát nhiệt độ chiết 26

3.2.5 Khảo sát thời gian chiết 27

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AIDS Acquired immunodeficiency syndrome (Hội chứng suy giảm miến dịch

SAD Seasonal affective disorder (trầm cảm theo mùa)

SSRI Selective serotonin reuptake inhibitor (nhóm thuốc ức chế tái hấp thu

chọn lọc serotonin)

USP United States Pharmacopoeia (Dược điển Hoa Kỳ)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Diện tích pic sắc ký của hypericin ở các nồng độ khác nhau 21

Bảng 3.2 Khối lượng và hàm lượng hypericin trong cao chiết bằng cồn

các nồng độ khác nhau

23

Bảng 3.3 Khối lượng và hàm lượng hypericin trong cao chiết ở các tỷ

lệ dược liệu/dung môi khác nhau

24

Bảng 3.4 Khối lượng và hàm lượng hypericin trong cao chiết khi cho

vào lượng vtamin C khác nhau

25

Bảng 3.5 Khối lượng và hàm lượng hypericin trong cao chiết ở các

nhiệt độ khác nhau

26

Bảng 3.6 Khối lượng và hàm lượng hypericin trong cao chiết với thời

gian chiết khác nhau

27

Bảng 3.7 So sánh quy trình chiết xuất Ban âu trong và ngoài nước 30

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm naphthodianthron 4

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm phloroglucinol 5

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học một số chất nhóm flavonoid 6

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học một số chất nhóm biflavonoid 7

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học một số chất nhóm phenylpropanoid 7

Hình 1.6 Sơ đồ quy trình chiết xuất cao chứa hypericin từ dược liệu

Ban Âu

14

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện

tích pic sắc ký của hypericin

21

Hình 3.2 Sơ đồ quy trình chiết xuất với các điều kiện đã khảo sát 29

Hình 3.3 Biểu đồ hình cột biểu diễn thời gian chuột ở vùng trung tâm

(giây)

31

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Ban Âu là một cây thuốc quý được sử dụng ở Châu Âu từ cách đây 2000 năm Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về cây Ban Âu với các thành phần chính như hypericin, hypeforin, flavonoid, [20][45][49][52][59] có tác dụng giải lo

âu qua đó làm mất các tình trạng u sầu, buồn chán, thất vọng lấy lại thăng bằng cuộc sống, do đó cây Ban Âu đang được sử dụng để điều trị bệnh trầm cảm thể nhẹ [15][30][37][40][42][54] Ngoài ra cây Ban Âu còn có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, kháng virus [9][21] Hiện nay tại Châu Âu, đã có rất nhiều sản phẩm từ cây Ban Âu được phép lưu hành thị trường dưới nhiều dạng bào chế khác nhau như thuốc mỡ, viên nén, viên nang

Cây Ban Âu khi di thực về Việt Nam với tên gọi là Ban di thực đã được Viện Dược liệu trồng thử nghiệm tại trạm nghiên cứu Sa Pa, Tam Đảo, Hà Nội và Tân Lạc - Hòa Bình cho thấy cây phát triển tốt, cho hàm lượng hypericin cao [1] Đã có nghiên cứu về quy trình chiết xuất cao Ban di thực tại Việt Nam tuy nhiên chưa nghiên cứu sâu cũng như chưa có nghiên cứu về tác dụng giải lo âu của cao chiết cây Ban di thực này

Vì vậy, việc nghiên cứu cây Ban di thực về Việt Nam là một vấn đề cần quan

tâm và có ý nghĩa thực tiễn Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu quy

trình chiết xuất và tác dụng giải lo âu trên thực nghiệm của cao chiết từ cây

Ban di thực Hypericum perforatum L.” Với 2 mục tiêu:

- Nghiên cứu quy trình chiết xuất cây Ban di thực để thu được sản phẩm có hàm lượng hypericin cao

- Đánh giá tác dụng giải lo âu của cao chiết trên chuột nhắt trắng

Chương 1 TỔNG QUAN

Cây Ban Âu hay cây cỏ Thánh John (St John’s Wort) có tên khoa học là

Hypericum perforatum L thuộc họ Ban (Hypericaceae) Cây có nguồn gốc tự nhiên

ở Châu Âu, Tây Á, Bắc Phi và cũng phân bố rộng rãi Bắc Mỹ và Australia Cây Ban

Âu là cây thuốc cổ truyền của các nước châu Âu và hiện là một cây thuốc có tiếng nhất trong điều trị trầm cảm trên thế giới

Bộ phận dùng: Phần trên mặt đất của cây

1.1 Lịch sử sử dụng cây Ban Âu [24]

Ban Âu đã được sử dụng để điều trị các chứng suy nhược cơ thể, làm lành vết thương từ hơn 2400 năm trước Bác sỹ người Hy Lạp ở thế kỷ thứ nhất Galen và Dioscorides đã giới thiệu nó là một loại thuốc lợi tiểu, chữa lành vết thương và điều hòa kinh nguyệt

Vào thế kỷ thứ 16, Paracelsus đã sử dụng Ban Âu để điều trị vết thương ngoài

da và làm dịu cơn đau Nó được coi như một loài thảo dược đặc biệt có những đặc

điểm bí ẩn Line là người phát hiện và đặt tên cho cây là Hypericum perforatum L

nhưng cây thường được biết đến qua tên St John’s Wort vì loại cây này nở hoa màu vàng rất đẹp vào ngày kỷ niệm sinh nhật Thánh John, 24 tháng Sáu mỗi năm Tên

chi Hypericum được bắt nguồn từ một từ Hy Lạp – Hyper là ở trên và eikon là bức

ảnh nói đến truyền thống sử dụng cây để phòng trừ quỷ dữ bằng cách treo cây trong nhà trong ngày lễ Thánh John Tên loài chỉ sự có mặt của tuyến dầu nhỏ trong lá,

mà khi giữ dưới ánh sáng nhìn nó giống như ô cửa sổ

Vào thời Trung cổ, Ban Âu đã được dùng để trừ ma qủy, làm trong sạch không khí Từ nhiều thế kỷ trước, nó được coi như có thể chữa được bệnh u sầu, nhiễm trùng đường tiểu, diệt vi trùng, làm lành vết thương ngoài da

Vào thế kỷ 19, King (1876) đã viết trong American Dispensatory về việc dùng Ban Âu để chữa ỉa chảy, bệnh vàng da, trầm cảm và u sầu Một dạng cồn thuốc từ Ban Âu đã được chính thức đưa vào sử dụng chữa đau cột sống, choáng, sốc, chứng kích động

Duke (1985) liệt kê các bệnh được điều trị bằng Ban Âu theo dân gian gồm có: hen phế quản, ỉa chảy, lỵ, suy nhược thần kinh, trầm cảm, kích động, bệnh dại, thiếu máu, giun sán, ung thư tử cung, ung thư đường niệu, ung thư dạ dày và u lympho

Từ những năm 1970 trở lại đây, Ban Âu đã trở thành một trong những cây thuốc được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất cả trong phòng thí nghiệm và trên lâm sàng Hàng loạt các nghiên cứu về sinh lý thực vật, hóa học, dược lý, dược động học đã được thực hiện Các thành phần hoạt chất chính đã được xác định là naphthodianthron, anthroglycosid, flavonoid và phloroglucin Cây thuốc này đã trở nên một cây thuốc phổ biến trong điều trị trầm cảm mức độ nhẹ và trung bình Các chế phẩm từ Ban Âu được bán ở khắp các siêu thị và nhà thuốc ở Mỹ và châu Âu

1.2 Thành phần hóa học

Thành phần các chất đã được xác định có trong cây Ban Âu bao gồm: naphthodianthron, phloroglucinol, flavonoid, biflavon, phenylpropanoid và proanthocyanidin Ngoài ra, còn có một lượng nhỏ tannin, xanthon, tinh dầu và acid amin

1.2.1 Naphthodianthron

Các hợp chất này là thành phần đặc trưng của chi Hypericum Chúng có màu

đỏ tươi và có tính quang động Hypericin và pseudohypericin là các chất chính thuộc nhóm này đã được phân lập từ ban Âu Các dẫn chất proto của chúng là protohypericin pseudoprotohypericin cũng đã được phân lập nhưng chúng không bền và dễ dàng chuyển thành hypericin và pseudohypericin [20][45][49]

OH OH

OH

H 3 C

OH R

OH OH

OH OH

O

O

Protohypericin R = CH 3 Pseudoprotohypericin R= CH 2 OH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm naphthodianthron

Hypericin và pseudohypericin có chủ yếu trong hoa và lá ban Âu Hàm lượng của chúng thay đổi theo thời kỳ sinh trưởng của cây và cao nhất khi cây ra hoa (từ 0,03% - 0,3% so với dược liệu khô) Hàm lượng pseudohypericin thường cao hơn hypericin 2 đến 4 lần [15]

Các hợp chất naphthodianthron này rất ít tan trong hầu hết các dung môi Hypericin tinh khiết hầu như không tan trong nước ở điều kiện thường Hypericin tan trong các dung dịch kiềm, các bazơ hữu cơ như pyridin và các dung môi hữu cơ phân cực như aceton, methanol, ethyacetat, ethyl methyl ceton Khi tan trong các dung dịch này, hypericin tạo ra các dung dịch màu đỏ có bước sóng phát xạ là 600nm [2]

Hypericin và dẫn chất là thành phần đặc trưng và đáng chú ý nhất trong ban

Âu do chúng có tác dụng chống ung thư, chống virus và chống trầm cảm Đặc biệt, hypericin là một trong những hợp chất tự nhiên nhạy cảm ánh sáng nhất Đặc tính này đã được khai thác sử dụng trong liệu pháp quang động điều trị ung thư vì hypericin kết hợp với ánh sáng rất hiệu quả trong việc gây chết theo chương trình hoặc gây hoại tử tế bào ung thư [3][6]

1.2.2 Phloroglucinol

O O

Hyperfirin R = H Adhyperfirin R = CH 3

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm phloroglucinol

Hai hợp chất phloroglucinol đã xác định được trong Ban Âu là hyperforin (2,0% - 4,5%) và adhyperforin (0,2% - 1,9%) [20][24][33][45] Chúng chỉ tìm thấy trong hoa và quả: khoảng 2% trong hoa, 4,4% trong quả chín và 4,5% trong quả xanh [53] Furohyperforin và oxepahyperforin, các sản phẩm oxy hóa của hyperforin cũng được tìm thấy với hàm lượng thấp trong dược liệu Ban Âu [52][58] Hypefirin và adhyperfirin cũng được phân lập và xác định trong Ban Âu ở

Hy Lạp [20]

Hyperforin rất kém bền, đặc biệt trong dung dịch nước và khi tiếp xúc ánh sáng và nhiệt độ cao [32] Không thấy có hoặc có rất ít chất này trong các loại chế phẩm và trà từ Ban Âu

Hyperforin có tác dụng ức chế hoặc điều hòa một số hệ dẫn truyền thần kinh,

ức chế mạnh serotonin, dopamin và noradrenalin với IC50 khoảng 0,5mg/L [18] Do

đó có thể nó cũng có vai trò trong tác dụng chống trầm cảm của dược liệu Ban Âu Ngoài ra, hyperforin còn được chứng minh là chất chống ung thư [48], chống ký sinh trùng sốt rét [55]

1.2.3 Flavonoid

Flavonoid là một nhóm hoạt chất có hàm lượng 2-4% trong dược liệu Ban Âu Các flavonol aglycon đã phân lập được gồm có kaempferol, luteolin, myricetin và quercetin [20][35][36][45] Trong các glycosid phân lập được từ Ban Âu có hyperosid (hyperin) rutin, quercitrin, isoquercitrin, miquelianin và astilbin [16][20][45][46]

Các flavonoid trong Ban Âu cũng góp phần vào tác dụng chống trầm cảm của dược liệu này và được chứng minh là các chất hiệp đồng tăng cường tác dụng của các hoạt chất như hypericin [15][59]

Ngoài ra, các flavonoid trong Ban Âu cũng có hoạt tính kháng khuẩn [35]

O HO

OH

OH

OH

O OR

O HO

OH

O HO

OH

Amentoflavon

O HO

Acid chlorogenic được xác định có khoảng 1% trong cao chiết Ban Âu [20]

[36] Ngoài ra còn có acid caffeic, acid p-coumaric, acid ferulic, acid isoferulic, acid

gentisic và acid shikimic [24]

O

O OH HO

OH R

Acid chlorogenic R = OH

Acid p-coumaric R = H

OH

O RO

HO

Acid caffeic R = H Acid ferulic R = CH 3

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học một số chất nhóm phenylpropanoid

1.2.6 Tinh dầu

Tinh dầu của Ban Âu chứa các hợp chất aliphatic (2-methyl octan, nonan,

n-decan, n-unn-decan, n-tetradecanol, 2-methyl-decan và 2-methyl-dodecan) và

terpenoid (-pinen, -pinen, geraniol, -caryophyllen, -farnesen, humulen và

germacren D) [4]

1.2.7 Các thành phần khác

- Hợp chất xanthon: 1,3,6,7-tetrahydroxyxanthon và kielcorin C (0,01%)

- Carotenoid, choline, nicotinamid, -sitosterol, acid béo, aminoacid, vitamin

C, pectin, tannin hydroperoxycadiforin [24]

1.3 Tác dụng dƣợc lý

Cây Ban Âu có rất nhiều tác dụng điều trị bệnh khác nhau Những tác dụng dược lý của cây do các thành phần đa dạng của cây đem lại, đặc biệt là hai thành phần hypericin và hyperforin

1.3.1 Tác d ng iều trị trầm c m

Một trong những tác dụng rõ rệt nhất của Ban Âu phải kể đến là tác dụng chống trầm cảm, trong đó 2 thành phần hypericin và hyperforin được cho là những hoạt chất đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh này

Cơ chế tác dụng chống trầm cảm của hypericin là do ức chế sự tạo thành cytokine interleukin 6 và 1β ở bạch cầu đơn nhân, dẫn đến làm giảm giải phóng corticotropin, do đó giảm sự tạo thành cortisol [55] Hypericin cũng có thể ức chế tái thu hồi serotonin, norepinephrine và dopamine dẫn đến giảm mức độ biểu hiện của beta adrenoreceptor và tăng mức độ biểu hiện của receptor serotonin 5-HT2A và 5-

HT1A [37][42][54]

Những nghiên cứu gần đây cũng đã chỉ ra rằng hyperforin cũng có thể là thành phần có tác dụng chống trầm cảm [15][30] Rất nhiều cơ chế chống trầm cảm khác nhau của hypeforin đã được giả định, bao gồm ức chế sự tái thu hồi serotonin, norepinephrine và acetylcholine Một số nghiên cứu khác lại chỉ ra rằng hyperforin tác động đến serotonin, dopamin, norepinephrine, acid γ-aminobutyric, và L-glutamate, mặc dù serotonin được cho là đóng vai trò quan trọng nhất [43] Ngoài ra còn có một số cơ chế khác như giảm biểu hiện beta adrenoreceptor ở vỏ não và receptor 5-HT2 và giải phóng synaptosome [42]

Một số thành phần khác của Ban Âu như flavonoid cũng có tác dụng ức chế monoamine oxidase A [10][42][56]

Các chiết xuất từ các loại thảo dược wort St John (Hypericum perforatum) đã

được sử dụng trong nhiều thế kỷ ở nhiều dân gian và thảo dược Hiện nay ở châu Âu,

nó được sử dụng rộng rãi để điều trị trầm cảm nhẹ đến trung bình Ở Hoa Kỳ, nó là một trong các sản phẩm thực vật bán chạy hàng đầu Trong một thử nghiệm 8 tuần liên quan đến 340 bệnh nhân được chẩn đoán với trầm cảm nặng, wort St John đã được so sánh với một SSRI phổ biến và giả dược (viên đường) Cuộc thử nghiệm thấy rằng wort St John là không có hiệu quả hơn việc giả dược trong điều trị trầm cảm nặng Tuy nhiên, việc sử dụng Wort St John cho trầm cảm nhẹ hoặc vừa phải có thể có hiệu quả hơn [40]

Ban Âu được sử dụng điều trị trầm cảm theo mùa Nghiên cứu cho thấy rằng điều trị bằng thuốc với Ban Âu có thể là một liệu pháp hiệu quả ở những bệnh nhân

bị rối loạn tình cảm theo mùa [34]

Nói chung, có rất nhiều công trình nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh tác dụng chống trầm cảm của Ban Âu so với giả dược (Placebo) và thuốc chuẩn Theo thống

kê, có khoảng 35 – 40 bài báo nghiên cứu lâm sàng, trong đó có 26 nghiên cứu được

so sánh với giả dược và 14 nghiên cứu so sánh với thuốc chuẩn điều trị trầm cảm Phần lớn các nghiên cứu đều chỉ ra rằng Ban Âu có hiệu quả chống trầm cảm được so sánh với amitryptilin, imipramin, fluoxetin [22][34][50][60]

Hiện nay Ban Âu được biết đến nhiều nhất như một thảo dược để điều trị bệnh trầm cảm Ở một số nước như Đức, Ailen thông thường nó được dùng để điều trị bệnh trầm cảm nhẹ, đặc biệt đối với trẻ em, thanh thiếu niên và những vùng dân nghèo

Trường đại học Duke được Viện Quốc Gia Bệnh Tâm Thần trợ cấp trên 4 triệu đôla để thực hiện dự án trong 3 năm nghiên cứu sự an toàn và công hiệu của Ban Âu trong việc trị bệnh trầm cảm

Tại Châu Âu, đặc biệt ở Đức, Ban Âu thường là loại thuốc được các bác sĩ kê đơn cho bệnh nhân bị bệnh trầm cảm mức độ nhẹ và vừa

Hiện nay ở Hoa Kỳ, Ban Âu được rất nhiều người dùng để chữa trầm cảm vì được coi là an toàn, công hiệu, rẻ tiền và không cần bác sĩ kê đơn

1.3.2 Tác d ng làm gi m s thoái h a thần kinh g y ra i ệnh parkinson

Trong những năm gần đây, nhiều người cho rằng quá nhiều gốc tự do trong cơ thể hoặc một số yếu tố môi trường khác như các thuốc diệt côn trùng, đặc biệt là rotenon có thể dẫn đến Parkinson Vì vậy, với đặc tính chống oxi hóa, cây Ban Âu được lựa chọn thử nghiệm trên mô hình động vật mắc bệnh Parkinson gây ra bởi rotenon Để xác định thành phần nào trong cây có hoạt tính chống oxi hóa thần kinh, nhóm nghiên cứu ở Đại học Complutense tại Madrid (UCM) đã tiến hành nhiều thí nghiệm với các chiết xuất từ ban Âu Kết quả cho thấy dịch chiết từ loài thực vật này

có tác dụng làm giảm tác hại của rotenon trên mô hình động vật Các thông số về nồng độ các enzym chống oxy hóa như superoxid dismutase, catalase, glutathione peroxidase chứng tỏ dịch chiết từ Ban Âu làm tăng nồng độ các loại enzym này Tác động bảo vệ neuron thần kinh ở vùng chất đen trong não (Substantia Nigra) cao nhất

ở lô thí nghiệm với dịch chiết chứa 0,3% hypericin Điều này cho thấy hoạt tính chống oxi hóa của cây do nhiều thành phần hợp thành [1]

1.3.3 Tác d ng iều trị ung thư

Hypericin là thành phần có tác dụng điều trị ung thư Cơ chế tác động của hypericin là kính thích hình thành các gốc tự do dưới tác dụng của ánh sáng và chính

sự sản xuất các gốc tự do này dấn tới phản ứng gây độc cho tế bào ung thư Do đó, nó được dùng trong liệu pháp quang động điều trị ung thư [3][5][6][25]

Hypericin có tác dụng chống ung thư trong liệu pháp quang động dưới sự có mặt của ánh sáng [6], hoạt động chống ung thư trong bóng tối của hypericin cũng đã được nghiên cứu [11][25][56]

Những nghiên cứu về hyperforin cũng đã chứng minh rằng hoạt chất này có tác dụng chống khối u trên động vật và in vitro [25] Hyperforin có tác dụng ức chế sự sinh trưởng đối với ung thư vú ở người và ở động vật in tro cũng như trên các dòng tế bào ung thư tế bào sừng, ung thư hắc tố, ung thư hạch bạch huyết tốt hơn hoặc bằng

những thuốc chống ung thư như camptothecin, paclitaxel và vincristin Hyperforin gây chết tế bào khối u theo chương trình thông qua sự hoạt hóa ty thể, giải phóng cytochrome c và hoạt hóa capase [46]

1.3.4 Tác d ng ch ng virus

Ban Âu được các chuyên viên về bệnh AIDS của Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ nghiên cứu vì hoạt chất của cây này có tác dụng chống một vài loại virus, trong đó có HIV

Hypericin là thuốc thử chống virus mạnh và được dùng để ức chế Murinecyomegalo virus (MCMV), Sindbis virus, HIV loại 1[9], đặc biệt trong khi

có mặt của ánh sáng huỳnh quang

Tác dụng chống virus H5N1 đã được các nhà khoa học Trung Quốc tiến hành nghiên cứu và thu được kết quả rất tốt Kết quả cho thấy chất hypericin được chiết xuất từ thảo dược có thể chữa khỏi 100% gia cầm nuôi bị cấy virus H5N1 và cũng

có tác dụng phòng chống đối với virus cúm gia cầm týp A H9N2 [2][9]

1.3.5 Các tác d ng khác

Theo truyền thống Hy Lạp, cây Ban Âu còn được sử dụng để chống viêm Cơ chế chống viêm là do sự ức chế prostaglandin E2 Tác dụng chống viêm do nhiều thành phần quyết định [9][21] Ngoài ra, câu Ban Âu còn kìm hãm, ức chế sự phát triển của vi khuẩn [35][47]

Dầu của cây Ban Âu còn được sử dụng để làm liền sẹo, làm thuốc chống viêm, làm lành vết thương và làm dịu chỗ đau nhanh chóng [9] Nó dùng để điều trị sẹo, bong gân, vết bỏng, sưng tấy da bên ngoài hay những vết thương của mô thần kinh Chính phủ Đức cho phép các chất của Ban Âu được gắn nhãn mác để điều trị các vết thương trầy da hay các cơn đau, chứng đau cơ, vết bỏng Kết quả điều trị bằng dược liệu này đều cho tác dụng tốt

Do hiệu quả điều trị chống trầm cảm của cây Ban Âu và thực tế cho thấy cả trầm cảm và chứng nghiện rượu đều có chung những chất dẫn truyền thần kinh nên loại thực vật này cũng đã được nghiên cứu về tác dụng có lợi đối với những người

nghiện rượu Những khảo sát trên người tình nguyện đã cho thấy mức độ uống rượu

ở những đối tượng này đã giảm đáng kể sau khi dùng cao chiết Ban Âu[44]

1.3.6 Tác d ng không mong mu n

Khi sử dụng Ban Âu để điều trị trầm cảm, có thể sẽ có một số tác dụng phụ không phổ biến hoặc nhẹ như khô miệng, chóng mặt, táo bón, vấn đề về dạ dày - ruột, và nhầm lẫn [51]

Hypericin là chất có tính nhạy cảm với ánh sáng mạnh vì vậy một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng Ban Âu có thể gây ảnh hưởng đến da và mắt do tính nhạy cảm với ánh sáng [13][23][31]

Ngoài ra, dịch chiết của Ban Âu có xảy ra tương tác thuốc khi sử dụng một số liệu pháp điều trị khác Tương tác của những thuốc này thông qua enzyme CYP-450-3A4 trong gan làm giảm hoạt tính của một vài thuốc như warfarin, cyclosporin, thuốc tránh thai, theophylline [7][35][36] Do vậy, cảnh báo đối với những bệnh nhân dương tính với HIV đang điều trị chất ức chế protease, bệnh nhân ung thư đang được điều trị hóa trị liệu, và những bệnh nhân ghép cơ quan đang điều trị thuốc ức chế miễn dịch không nên dùng kết hợp với Ban Âu Không nên dùng kết hợp giữa Ban Âu với thuốc chống trầm cảm ức chế chọn lọc thu hồi serotonin SSRI [26]

1.4 Các quy trình chiết xuất Ban Âu trong và ngoài nước

1.4.1 Các quy trình chi t u t an u trong nư c

Viện Dược liệu đã nghiên cứu di thực thành công cây Ban Âu Hypericum

perforatum L trong đề tài cấp Bộ Y tế “Nghiên cứu di thực và quy trình trồng

trọt cây ban Hypericum perforatum L để chiết xuất sản phẩm chứa hypericin”

từ năm 2007 – 2011 Kết quả của đề tài cho thấy cây Ban Âu phù hợp với điều kiện khí hậu và đất đai của các vùng có khí hậu mát như Tam Đảo, Mai Châu, Mộc Châu, Sa Pa Cây Ban di thực này có hàm lượng hoạt chất hypericin khá cao (> 0,1% trong khi tiêu chuẩn dược điển châu Âu là 0,08% và tiêu chuẩn Mỹ USP 25 là 0,04%)[57] Quy trình chiết xuất dùng cồn 60-70% làm dung môi chiết dược liệu

Việc loại tạp nâng cao hàm lượng hypericin được thực hiện bằng cách dùng aceton Dịch chiết aceton sau đó được cô áp suất giảm và sấy chân không đến khô kiệt thu được cao khô tơi màu nâu sẫm Sản phẩm chứa > 0,7% hypericin từ dược liệu di thực (hình 1.6)

1.4.2 Các quy trình chi t u t ngoài nư c

Đã có nhiều tác giả ở các nước đăng ký bản quyền phát minh sáng chế các quy trình chiết xuất hoạt chất chống trầm cảm từ Ban Âu

Theo Erdelmeier et al (2001), từ 1 kg dược liệu Ban Âu, chiết với cồn 70% có thể thu được 0,44 kg cao chiết toàn phần Khi chiết bằng n-heptan thì hiệu suất sản phẩm cao thu được là 5,25% so với dược liệu ban đầu nhưng sản phẩm chứa hàm lượng hyperforin cao hơn chiết cồn (1,7% so với 0,37%) [19] Phương pháp chiết bằng CO2 siêu tới hạn cũng được Erdelmeier et al (2001) và Castor et al (2001) sử dụng, cho sản phẩm khá ổn định với hiệu suất chiết sản phẩm là 2,6%, chứa 1,9% hyperforin [17][19]

Bombardelli et al (2002) không dùng cao chiết toàn phần mà xây dựng quy trình chiết xuất dược liệu bằng methanol hoặc aceton và sau đó loại tạp để nâng cao hàm lượng các hoạt chất trong sản phẩm bằng cách hòa cao toàn phần với nước và chiết theo phương pháp ngược dòng với dung môi hữu cơ (ethyl acetat hoặc butyl acetat) Sản phẩm cao chiết thu được từ pha dung môi hữu cơ được tiếp tục tinh chế bằng dung dịch acid citric loãng trong cồn 95% thu được sản phẩm chứa 20% hyperforin, 0,9% hypericin và 1% diapigenin với hiệu suất 8% so với dược liệu ban đầu [12] Một phương pháp loại tạp và tinh chế khác đã được Koch et al (2007) sử dụng là đưa cao toàn phần lên cột Diaion HP-20, rửa giải bằng ethanol 92% và aceton 100% thu được sản phẩm chứa 6,3% hyperforin, 0,5% hypericin và 6,4% flavon [28]

Các biện pháp ổn định sản phẩm, chống oxy hóa hoạt chất đã được Erdelmeier

et al (2001), Koch et al (2007) sử dụng gồm có: sục khí trơ cho dung môi chiết, tránh ánh sáng, dùng chất phụ gia chống oxy hóa như acid ascorbic [19][28]

Hình 1.6 Sơ đồ quy trình chiết xuất cao chứa hypericin từ dược liệu Ban Âu.

Bột dược liệu (1 kg)

10 lít cồn chiết ở 55ºC/1h lọc dịch chiết qua vải

10 lít cồn chiết ở 55ºC/1h lọc dịch chiết qua vải

Cô áp suất giảm, tº< 50ºC đến dịch đặc thêm EtOH 70% thành 0,5 lít, khuấy kỹ

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Phần trên mặt đất của cây Ban di thực từ Nhật Bản được trồng tại Trạm nghiên cứu cây thuốc Tam Đảo mùa vụ 2013-2014 được thu hoạch khi cây bắt đầu ra hoa vào tháng 8/2014 Dược liệu sau khi phơi khô có:

2.1.3 Dung môi, h a ch t

- Dung môi chiết xuất được sử dụng để chiết suất là EtOH công nghiệp cất lại

- Dung môi dùng để pha chế định lượng là dung môi tinh khiết Trung Quốc: acetonitril, methanol

- Dung dịch Hypericin chuẩn của phytolab – Đức

2.1.4 Máy m c và d ng c

- Dụng cụ bình cầu, bình nón, bình chiết quả lê, phễu lọc, của các hãng Bomex, IsoLAB

- Bếp cách thủy các cỡ cho bình chiết từ 100ml, 250ml, 500ml, 1 lít

- Máy xay dược liệu

- Cân kỹ thuật Sarturius TE612

- Cân phân tích Sarturius CPA 224S- Viện Dược liệu

- Máy cất quay Rotavapor R-200 của hãng Buchi- Viện Dược liệu

- Máy xác định độ ẩm Presica HA60 – Viện Dược liệu

- Máy HPLC Shimadzu - Viện Dược liệu

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết cao Ban di thực để thu được bán thành phẩm có hàm lượng hypericin cao thông qua khảo sát các yếu tố: dung môi, nhiệt

độ chiết, thời gian chiết, tỷ lệ dược liệu/dung môi, chất chống oxy hóa

- Nghiên cứu tác dụng giải lo âu của cao chiết trên chuột nhắt trắng bằng thử nghiệm hành vi khám phá không gian

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp ịnh lượng hypericin

Tham khảo Dược điển Châu Âu và Dược điển Hoa Kỳ [57], ta tiến hành phương pháp HPLC định lượng hypericin bằng phương pháp đường chuẩn

*Nguyên tắc:

Nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó

*Chuẩn bị mẫu thử

- Với dược liệu: Cân chính xác khoảng 1 (g) dược liệu vào bình cầu tối màu

(tránh ánh sáng), bổ sung chính xác 50 ml hỗn hợp dung môi Acetonitril : methanol (tỷ lệ 1:1), để yên khoảng 5 phút, đem cân thu được khối lượng m1 Tiến hành chiết hồi lưu ở 60ºC trong 2 giờ, sau đó để yên về nhiệt độ phòng, đem cân và bổ sung đến khối lượng m1 bằng hỗn hợp dung môi chiết Tiến hành lọc thu được dịch chiết, dịch chiết được lọc qua màng cellulose 0,45 µm thu được dịch phân tích HPLC có nồng độ chính xác khoảng 20 mg/ml

- Với cao chiết: Cân chính xác khoảng 0,2g cao, cho vào bình định mức 10ml

Bổ sung chính xác hỗn hợp dung môi Acetonitril : methanol (tỷ lệ 1:1) Lọc qua màng lọc cellulose 0,45 µm thu được dung dịch phân tích