Khổng thị ngọc anh nghiên cứu tạo nguyên liệu probiotic dạng vi nang phối hợp alginat và carrageenan khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI KHỔNG THỊ NGỌC ANH NGHIÊN CỨU TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC DẠNG VI NANG PHỐI HỢP ALGINAT VÀ CARRAGEENAN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI KHỔNG THỊ NGỌC ANH Mã sinh viên: 1801018 NGHIÊN CỨU TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC DẠNG VI NANG PHỐI HỢP ALGINAT VÀ CARRAGEENAN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Đàm Thanh Xuân Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghệ sinh học Dược Khoa Công nghệ sinh học HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Đề tài “ Nghiên cứu tạo nguyên liệu probiotic dạng vi nang phối hợp alginat carrageenan” thực hồn thành Bộ mơn Cơng nghệ sinh học Dược – Khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Dược Hà Nội Với tất kính trọng lịng biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn trân thành đến PGS.TS Đàm Thanh Xuân – người thầy tận tình hướng dẫn, dõi theo trình thực đưa lời khuyên bổ ích giúp em giải vấn đề gặp phải trình nghiên cứu đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Khắc Tiệp, ThS Lê Ngọc Khánh thầy cô, kỹ thuật viên học viên cao học môn Công nghệ sinh học Dược, khoa Công nghệ sinh học tạo điều kiện để em học tập, rèn luyện tích lũy kiến thức hồn thành khóa luận tốt nghiệp Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu tồn thể thầy giáo Trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ, truyền đạt kiến thức tảng, giúp em có hành trang vững bước chặng đường Lời cuối cùng, em xin bày tỏ cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân bạn bè động viên, ủng hộ em trình học tập sống Hà Nội, ngày 04 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Khổng Thị Ngọc Anh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương Probiotic 1.1.1 Khái niệm lịch sử Probiotic 1.1.2 Vai trò Probiotic với sức khỏe người 1.1.3 Loài Lactobacillus acidophilus 1.1.4 Tiềm loài Lactobacillus acidophilus 1.2 Đại cương vi nang probiotic 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Phương pháp vi nang hóa 1.2.3 Phương pháp vi nang hóa tách pha đơng tụ 1.3 Nguyên liệu tạo vi nang Probiotic 1.3.1 Chất mang Alginat 1.3.2 Chất mang Carrageenan 1.3.3 Một số nghiên cứu Carrageenan 11 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên liệu thiết bị 13 2.1.1 Vi sinh vật 13 2.1.2 Hóa chất, thiết bị dụng cụ 13 2.1.3 Các môi trường sử dụng nghiên cứu 14 2.1.4 Các dung dịch sử dụng nghiên cứu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1 Khảo sát trình tạo vi nang phối hợp Alginat Carrageenan 15 2.2.2 Nghiên cứu cải thiện thể chất đánh giá khả bao gói Lactobacillus acidophilus vi nang phối hợp Alginat Carrageenan 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn 16 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 16 2.3.3 Phương pháp nhỏ giọt đông tụ tạo vi nang phối hợp Alginat Carrageenan 17 2.3.4 Phương pháp đông khô 17 2.3.5 Phương pháp định tính tinh bột 17 2.3.6 Phương pháp phá hạt vi nang xác định số lượng VSV 18 2.3.7 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV 18 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 19 3.1 Khảo sát trình tạo vi nang phối hợp Alginat – Carrageenan đánh giá hình thái vi nang 19 3.1.1 Khảo sát khả tạo vi nang phối hợp sử dụng dung dịch đông tụ KCl 19 3.1.2 Khảo sát khả tạo vi nang phối hợp sử dụng dung dịch đông tụ CaCl221 3.2 Bổ sung chất độn cải thiện thể chất đánh giá khả bao gói Lactobacillus acidophilus vi nang phối hợp Alginat Carrageenan 27 3.2.1 Bước đầu bổ sung tinh bột vào vi nang probiotic phối hợp đánh giá thể chất vi nang sau đông khô 27 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ tinh bột đến thể chất vi nang phối hợp sau đông khô 31 3.2.3 Đánh giá khả bao gói Lactobacillus acidophilus vi nang phối hợp Alginat, Carrageenan tinh bột 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Chú giải tiếng Anh Chú giải tiếng Việt Alg Alginate Alginat ATCC American Type Culture Collection Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ CFU Colony Forming Units số đơn vị khuẩn lạc đk FAO ISAPP KC đông khô Food and Agriculture Organization Tổ chức lương thực nông nghiệp of the United Nations Liên Hiệp Quốc International Scientific Association Hiệp hội khoa học quốc tế Probiotic for Probiotics and Prebiotics Prebiotic Kappa carrageenan Kappa carrageenan khối lượng/thể tích kl/tt LMP Low methoxyl pectin Pectin methoxy hóa thấp MRS De Man, Rosoga and Sharpe môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic môi trường MT SGF Stimulated Gastric Fluid dịch dày mô SIF Stimulated Intestinal Fluid dịch ruột mô TB tinh bột TCCS tiêu chuẩn sở TKHH tinh khiết hóa học VSV vi sinh vật VK vi khuẩn WHO World Health Organization Tổ chức Y tế giới DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tổng hợp tính chất loại Carrageenan 10 Bảng 2.1: Nguyên liệu hóa chất sử dụng 13 Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 2.3: Các dụng cụ sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 2.4: Thành phần môi trường MRS lỏng 14 Bảng 2.5: Các dung dịch sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 3.1: Tỷ lệ phối hợp nồng độ Carrageenan Alginat với KCl tạo vi nang 19 Bảng 3.2: Tỷ lệ phối hợp nồng độ Carrageenan Alginat với CaCl2 tạo vi nang 21 Bảng 3.1: Thể chất mẫu đông khô CA-C2 thay đổi nồng độ tinh bột 32 Bảng 3.2: Số lượng Lactobacillus acidophilus ba mẫu vi nang sau đông khơ 34 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Hình 1.2: Các mơ hình vi nang Hình 1.3: Vi nang kép trình vận chuyển đường tiêu hóa Hình 1.4: Mơ hình tạo vi nang probiotic phương pháp tách pha đơng tụ Hình 1.5: Cấu trúc Alginat: (A) monome, (B) chuỗi, (C) phân bố khối Hình 1.6: Minh họa liên kết tạo thành Alginat – Carrageenan 11 Hình 3.1: Hình ảnh vi nang CA-K1; CA-K2; CA-K3 tươi camera thường 20 Hình 3.2: Hình ảnh vi nang CA-C1; CA-C2; CA-C3 tươi đông khô camera thường 23 Hình 3.3: Hình ảnh vi nang CA-C1; CA-C2; CA-C3 bổ sung 1% TB tươi đông khô camera thường ( a.c.e: Mẫu tươi; b.d.f: Mẫu sau đông khô) 28 Hình 3.4: Kết thử định tính tinh bột sau ủ dịch SGF mẫu vi nang CA-C1 (C1), CA-C2 (C2), CA-C3 (C3) bổ sung 1% tinh bột (lần lượt từ trái sang phải): a dung dịch trước thử; b dung dịch sau thử 29 Hình 3.5: Hình ảnh vi nang CA-C2 bổ sung tinh bột sau đông khô nồng độ 0; 1; 4; 8% (lần lượt từ trái qua phải) 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Probiotic vi sinh vật sống mà đưa vào thể với lượng đủ lớn đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ [30] Nghiên cứu hai thập kỷ qua cung cấp chứng cho thấy việc bổ sung probiotic giúp tối ưu hóa hệ VSV đường ruột [36], ngăn ngừa điều trị số rối loạn đường ruột nhẹ tiêu chảy, táo bón, đầy đau bụng [72], có đến hai phần ba dân số trải qua nhiều rối loạn Nhận thức tác dụng tích cực vai trò probiotic sức khỏe, nhu cầu sử dụng chế phẩm probiotic người tiêu dùng tăng lên, thúc đẩy đầu tư, nghiên cứu phát triển sản phẩm lĩnh vực [13] Cho đến nay, nỗ lực nghiên cứu vi nang bao gói probiotic chủ yếu tập trung vào ba lĩnh vực là: (i) tìm kiếm vật liệu, nguyên liệu có khả tạo vi nang probiotic có nguồn gốc từ thiên nhiên, an tồn, lành tính [17]; (ii) tăng cường khả sống sót VSV mơi trường dịch tiêu hóa [12]; (iii) hướng giải phóng VSV vị trí đích đường tiêu hóa Thực tế, polyme sinh học có nguồn gốc từ rong biển như: alginat, agar, carrageenan phát triển ứng dụng nhiều lĩnh vực y sinh dược phẩm nói chung [22], [37] Các nguyên liệu từ rong biển đồng thời nghiên cứu sử dụng phổ biến bao gói VSV probiotic đặc tính bật bao gồm độc tính thấp, khả tương thích sinh học cao [23], khả phân hủy sinh học tốt dễ dàng điều chỉnh dựa số hóa lý [59] Tiếp nối hướng nghiên cứu nguyên liệu tiềm giúp bao gói tạo chế phẩm probiotic, đề tài “Nghiên cứu tạo nguyên liệu probiotic dạng vi nang phối hợp alginat carrageenan” tiến hành với mục tiêu sau: Khảo sát trình tạo vi nang phối hợp Alginat – Carrageenan đánh giá hình thái vi nang Bổ sung chất độn cải thiện thể chất đánh giá khả bao gói Lactobacillus acidophilus vi nang phối hợp Alginat Carrageenan 1CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương Probiotic 1.1.1 Khái niệm lịch sử Probiotic Probiotic có nguồn gốc từ Hy Lạp có nhiều định nghĩa khác năm qua Theo nghĩa gốc, “biotic” xuất phát từ chữ “life” có nghĩa đời sống “pro” thân thiện tiếng Hy Lạp, hiểu probiotic “thân thiện với đời sống người” Cho đến năm 1974, Parker sử dụng khái niệm “Các vi sinh vật chất góp phần cân hệ vi sinh vật đường ruột” Định nghĩa liên quan đến việc sử dụng men vi sinh hệ vi sinh đường ruột bao gồm chất nghĩa rộng kháng sinh Trong nỗ lực cải thiện định nghĩa, Fuller (1989) định nghĩa lại chế phẩm sinh học probiotic “Một chất bổ sung thức ăn có chứa vi sinh vật sống có ảnh hưởng có lợi đến vật chủ cách cải thiện cân hệ vi sinh vật đường ruột nó” [29] Mặc dù thuật ngữ probiotic có liên quan đến chất bổ sung thức ăn chứa vi sinh vật định nghĩa từ năm 1989 nhiên lịch sử chứng minh tồn từ hàng ngàn năm trước Những tranh tường có từ 2500 trước Cơng ngun cho người Sumari có thói quen dùng sữa lên men – coi thực phẩm có chứa VSV sống lên men [58] Thuật ngữ Probiotic Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) Tổ chức Nông lương Liên Hợp Quốc (FAO) đưa khái niệm hoàn chỉnh năm 2002 sau: “Probiotic vi sinh vật sống mà đưa vào thể với lượng lớn đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [30] Khái niệm trì Hiệp hội khoa học quốc tế Probiotic Prebiotic (ISAPP) sử dụng hầu hết ấn phẩm khoa học 1.1.2 Vai trò Probiotic với sức khỏe người Probiotic biết đến với định nghĩa “thân thiện với người” lợi ích đáng kể chứng minh Sự có mặt probiotic đường tiêu hóa có tác dụng cạnh tranh, ức chế loại trừ VSV có hại đường ruột, trì cân hệ vi sinh đường ruột [9] Ngoài tiềm điều trị bệnh lý đường tiêu hóa, Probiotic khai thác, nghiên cứu phát triển nhờ số tác động có lợi khác đến sức khỏe người Giảm nồng độ cholesterol máu: Theo kết nghiên cứu Pereira D.I.A cộng sự, sản phẩm chứa chủng probiotic thích hợp có khả làm hạ cholesterol máu hỗ trợ ngăn ngừa nguy tim mạch [54] Trong đó, lồi Nhận xét:  Về vi nang tươi: Có thể tạo ba mẫu vi nang tươi CA-C1, CA-C2, CA-C3 bổ sung 1% tinh bột, vi nang tạo thành có bề mặt nhẵn mịn, khơng kéo đi, kích thước tương đồng với vi nang tươi mục 3.1.2 So sánh kết nhận thấy có khác biệt màu sắc độ trong, vi nang sau bổ sung tinh bột có màu trắng đục đặc trưng  Về vi nang sau q trình đơng khơ: Về hình dạng, vi nang khơng có tinh bột có hình dạng dúm dó tạo vảy, cấu trúc xốp, rỗng, hút ẩm mạnh gây dính vào đĩa petri gây khó tách riêng Khi bổ sung tinh bột, vi nang sau đơng khơ tạo hạt khơ, bề mặt xù xì, hút ẩm lấy khỏi đĩa Về kích thước, có khác biệt ba mẫu CA-C1, CA-C2, CA-C3 sau q trình đơng khơ, nhận thấy hạt CA-C3 có kích thước to CA-C1 CA-C2 Ngồi ra, hạt CA-C3 có kích thước khơng đồng đều, số hạt to có bề mặt nhẵn, màu trắng đục hơn; hạt kích thước nhỏ có bề mặt xù xì hơn, màu ngả vàng  Kết định tính tinh bột vi nang đông khô sau ủ SGF a Trước nhỏ thuốc thử Lugol b Sau nhỏ thuốc thử Lugol Hình 3.4: Kết thử định tính tinh bột sau ủ dịch SGF mẫu vi nang CA-C1 (C1), CA-C2 (C2), CA-C3 (C3) bổ sung 1% tinh bột (lần lượt từ trái sang phải): a dung dịch trước thử; b dung dịch sau thử Nhận xét: Sau ủ mẫu vi nang đông khô môi trường SGF, dịch ủ suốt, mẫu vi nang có tượng trương nở sau ủ giữ cấu trúc cầu đều, chưa thấy vết nứt vỡ bề mặt vi nang Dịch sau ủ hai mẫu CA-C1 CA-C2 âm tính với phép thử định tính tinh bột Sau 15 phút thực thí nghiệm, nhận thấy đáy ống nghiệm dịch ủ CAC3 có xuất vẩn đục màu xanh tím đặc trưng, nhận thấy có thất tinh bột mẫu CA-C3 sau ủ môi trường mô dịch dày (SGF) 29 3.2.1.3 Bàn luận  Về thể chất vi nang sau bổ sung tinh bột: Theo kết hình thái hạt sau đơng khơ cho thấy, việc bổ sung tinh bột với nồng độ 1% (kl/tt) khơng gây ảnh hưởng lớn đến q trình tạo vi nang, mặt khác giúp cải thiện rõ ràng hai vấn đề: (i) Vi nang sau đông khô hạn chế tình trạng co rút thể tích, hạt bổ sung tinh bột có hình cầu, kích thước lớn hơn, bề mặt xù xì; (ii) Vi nang giảm rõ rệt tình trạng hút ẩm, hạt khơ, khơng cịn dính vào đĩa petri, dễ dàng bảo quản Kết đồng với nghiên cứu trước đây, điều lý giải tinh bột chiếm lấy khoảng không gian trống mà tinh thể nước thăng hoa để lại [14] Ngoài ra, việc kết hợp tinh bột Alginat nghiên cứu giúp tăng độ ổn định vi nang, làm tăng độ bền vững liên kết ion Ca2+ Alginat, cản trở khuếch tán ion Ca2+ bên vi nang vào bên vi nang để tạo phức với acid lactic vi khuẩn sinh [61] Khi sơ khảo sát bổ sung tinh bột vào hỗn hợp nguyên liệu, nhận thấy mẫu CA-C3 có kích thước màu sắc không đồng đều: xuất hạt to màu trắng sữa hạt kích thước nhỏ màu ngả vàng Có thể trình khuấy từ, tinh bột chất rắn không tan phân tán hỗn dịch chứa VSV q trình phân tán khơng làm số hạt chứa lượng tính bột tạo hạt kích thước nhỏ, vi nang chứa nhiều tinh bột tạo hạt to hơn, bề mặt nhẵn Kết lặp lại tất lần thí nghiệm, điều lý giải mẫu CA-C3 có độ nhớt cao nhất, tinh bột khó phân tán thời gian cố định Từ đó, đặt vấn đề cần tối ưu hóa thời gian tốc độ khuấy từ mẫu có độ nhớt khác  Về kết định tính tinh bột vi nang sau đơng khơ: Thí nghiệm định tính tinh bột thiết kế nhằm khảo sát khả lưu giữ tinh bột vi nang môi trường mơ dịch dày (SGF), từ sơ suy đoán khả bảo vệ VSV dày Kết cho thấy, vi nang CA-C1 CA-C2 ổn định dịch mô dày (pH 1,2) mẫu vi nang CA-C3 sau ủ có tượng thất tinh bột, tạo phản ứng với thuốc thử Lugol Điều lý giải tính chất vật lý khác biệt Alginat Carrageenan, Alginat có tính kháng acid [50], ngược lại, Carrageenan ổn định pH >7, phân hủy pH