Bounthavy phengsavatdy khảo sát khả năng vi nang hoá nấm men saccharomyces boulardii bằng nguyên liệu carrageenan khoá luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BOUNTHAVY PHENGSAVATDY KHẢO SÁT KHẢ NĂNG VI NANG HOÁ NẤM MEN Saccharomyces boulardii BẰNG NGUYÊN LIỆU CARRAGEENAN KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BOUNTHAVY PHENGSAVATDY MÃ SINH VIÊN: 1801545 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG VI NANG HOÁ NẤM MEN Saccharomyces boulardii BẰNG NGUYÊN LIỆU CARRAGEENAN KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Đàm Thanh Xuân TS Nguyễn Đức Thiện Nơi thực Bộ môn Công nghệ sinh học Dược Khoa Công nghệ sinh học HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Khóa luận thực hồn thành Bộ mơn Công nghệ sinh học Dược - Khoa Công nghệ sinh học Trong suốt thời gian thực khóa luận, em nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ thầy cơ, bạn bè gia đình Với tất kính trọng lịng biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Đàm Thanh Xuân TS Nguyễn Đức Thiện, người thầy tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ em từ ngày em hoàn thành khoá luận Em xin gửi lời cảm ơn tới cơng ty TNHH Sản xuất Thương mại Hồng Yến cung cấp nguyên liệu carrageenan cho em sử dụng suốt q trình thực khố luận Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Khắc Tiệp Ths Lê Ngọc Khánh, hai người thầy giúp đỡ, hỗ trợ cho em lời khuyên bổ ích suốt trình làm khố luận Em cảm ơn chị Phạm Thị Thanh Huyền, chị Nguyễn Thị Kim Chi - kỹ thuật viên; chị Trần Thị Minh Thu, chị Đỗ Thị Huyền Thương - học viên cao học khoá 27; bạn Nguyễn Thị Thu Trang, Khổng Thị Ngọc Anh, Vũ Thành Lập, Nguyễn Thị Lan Anh, Thân Đắc Hùng, Mai Phương Thu, Bùi Thị Phương Thanh Bùi Thị Mai Nhung - sinh viên nghiên cứu khoá 73, em khoá 74 nghiên cứu môn Công nghệ sinh học Dược đồng hành sẻ chia, giúp đỡ em thời gian làm khoá luận Hơn nữa, em xin cảm ơn thầy cô giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Vật lý, Bộ mơn Hố sinh, Bộ mơn Vi sinh Sinh học, Bộ môn Công nghiệp Dược, Bộ môn Dược lý Bộ mơn Kỹ thuật hố dược - chiết xuất tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho em thời gian học tập trường Cuối cùng, em xin bày tỏ cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân bạn bè ln động viên, ủng hộ em trình học tập sống Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Bounthavy PHENGSAVATDY MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ ……………………………………………………………………… CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan carrageenan 1.1.1 Nguồn gốc, cấu trúc phân loại 1.1.2 Tính chất vật lý 1.1.3 Tính chất tạo gel 1.1.4 Cơ chế tạo gel 1.2 Tổng quan vi nang 1.2.1 Khái niệm .7 1.2.2 Cấu tạo vi nang 1.2.3 Các phương pháp tạo vi nang 1.3 Tổng quan probiotics 1.3.1 Khái niệm probiotics 1.3.2 Các vi sinh vật probiotics phổ biến 1.3.3 Đặc tính probiotics .10 1.3.4 Một số phương pháp đánh giá đặc tính probiotics .10 1.4 Tổng quan loài Saccharomyces boulardii 11 1.5 Tình hình nghiên cứu sử dụng carrageenan nước giới 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 14 2.1.1 Chủng vi sinh vật 14 2.1.2 Nguyên liệu 14 2.1.3 Hoá chất .14 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 14 2.1.5 Môi trường sử dụng nghiên cứu 15 2.1.6 Dung dịch sử dụng nghiên cứu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1 Khảo sát số thơng số q trình tạo vi nang từ carrageenan 16 2.2.2 Đánh giá số đặc tính vi nang carrageenan chứa S boulardii 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn nhiệt ẩm .16 2.3.2 Phương pháp tạo vi nang phương pháp tách pha đông tụ 16 2.3.3 Phương pháp đo kích thước vi nang hình thành 17 2.3.4 Phương pháp đông khô .17 2.3.5 Phương pháp đánh giá thể chất bên cấu tạo bên vi nang 17 2.3.6 Phương pháp đánh giá độ rã vi nang điều kiện pH mô dịch dày, ruột non đại tràng .18 2.3.7 Phương pháp nuôi cấy S boulardii thu sinh khối .18 2.3.8 Phương pháp tạo vi nang tươi chứa S boulardii 19 2.3.9 Phương pháp phá hạt để xác định số lượng S boulardii vi nang tươi carrageenan 19 2.3.10.Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV vi nang .19 2.3.11.Phương pháp làm tiêu giọt ép để soi VSV 20 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Khảo sát số thơng số q trình tạo vi nang từ carrageenan 21 3.1.1 Khảo sát nồng độ dung dịch carrageenan, KCl CaCl2 để tạo vi nang .21 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng kích cỡ đầu nhỏ giọt đến kích thước vi nang hình thành 25 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng khoảng cách nhỏ giọt đến thể chất vi nang 27 3.1.4 Khảo sát thể chất hạt vi nang carrageenan đông khô 29 3.1.5 Khảo sát độ rã vi nang carrageenan đông khô điều kiện pH mô dịch dày, ruột non đại tràng .31 3.2 Đánh giá số đặc tính vi nang carrageenan chứa S boulardii 32 3.2.1 Đánh giá thể chất bên cấu tạo bên vi nang carrageenan chứa S boulardii 32 3.2.2 Đánh giá khả giải phóng S boulardii vi nang carrageenan đơng khơ điều kiện pH mô dịch dày, ruột non đại tràng 35 3.2.3 Đánh giá số lượng S boulardii vi nang tươi carrageenan 37 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 4.1 Kết luận 38 4.2 Đề xuất 38 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AIDS: B longum, B bifidum B megaterium CFU cP cs DĐVN V FAO : Hội chứng suy giảm miễn dịch người (Acquired Immunodeficiency Syndrome) : Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum : Bacillus megaterium : Số đơn vị khuẩn lạc (Colony – Forming Units) : Đơn vị độ nhớt Centipoise : Cộng : Dược điển Việt Nam V : Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization of the United Nations) g GRAS : Đơn vị đo khối lượng (gam) : Nhóm cơng nhận an toàn H pylori (Generally Recognized As Safe) : Helicobacter pylori HIV : Virus gây suy giảm hệ miễn dịch người (Human Immunodeficiency Virus) ISAPP : Hiệp hội khoa học quốc tế Probiotics Prebiotics (International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics) : Loại kappa-, iota-, lambda-carrageenan : Khối lượng/thể tích : Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei : Nồng độ mol : Đơn vị độ nhớt (Mega pascal) : Môi trường 1, Môi trường : Saccharomyces boulardii : Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) : Dịch dày mô (Simulated Gastric Juice) : Dịch ruột mô (Simulated Intestinal Juice) : Tiêu chuẩn sở : Tiêu chuẩn nhà sản xuất : Tinh khiết hóa học : Vi sinh vật : Tổ chức Y tế giới (World Heald Organization) κ-, ι-, λ-carrageenan kl/tt L acidophilus, L casei M MPa MT1, MT2 S boulardii SD SGJ SIJ TCCS TCNSX TKHH VSV WHO DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hố học carrageenan Hình 1.2 Cấu trúc hoá học loại carrageenan Hình 1.3 Sự hình thành gel kết hợp cấu trúc xoắn ốc hạ nhiệt độ dung dịch carrageenan nóng Hình 1.4 Cơ chế tạo gel κ-carrageenan có mặt ion kali Hình 1.5 Cơ chế tạo gel ι-carrageenan có mặt ion canxi Hình 1.6 Ba cấu tạo vi nang thường gặp Hình 1.7 Hình ảnh S boulardii quan sát kính hiển vi thường kính hiển vi điện tử quét 11 Hình 3.1 Hình ảnh vi nang hình thành từ carrageenan 1,0; 1,2; 1,5 2,0% với nồng độ dung dịch đông tụ KCl CaCl2 (2; 10%) .22 Hình 3.2 Các vi nang hình thành từ carrageenan 1,2%; sử dụng kích cỡ đầu nhỏ giọt D1, D2, D3 với nồng độ 3% dung dịch đông tụ KCl CaCl2 26 Hình 3.3 Các vi nang hình thành từ carrageenan 1,2% với KCl 3% CaCl2 3%; sử dụng khoảng cách nhỏ giọt 3; 10 cm 28 Hình 3.4 Vi nang đơng khơ hình thành từ carrageenan 1,2% với (a) KCl 3% (b) CaCl2 3% .29 Hình 3.5 Vi nang đơng khơ hình thành từ carrageenan 1,2% với (a) KCl 3% (b) CaCl2 3% kính lúp soi (độ phóng đại 16X) 30 Hình 3.6 Vi nang chứa sinh khối S boulardii hình thành từ carrageenan 1,2% với KCl 3%: (a) mẫu tươi; (b) mẫu đông khô 33 Hình 3.7 Vi nang chứa sinh khối S boulardii (carrageenan 1,2% - KCl 3%) 34 Hình 3.8 Kết thử độ rã qua pH đường tiêu hố mơ vi nang đông khô chứa S boulardii theo công thức carrageenan 1,2% - KCl 3% 35 Hình 3.9 Hình ảnh tế bào S boulardii sau pH 7,4 kính hiển vi quang học (độ phóng đại 100x) .36 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Hoá chất sử dụng 14 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 2.3 Các dụng cụ sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 3.1 Kết khảo sát nồng độ dung dịch carrageenan, KCl CaCl2 để tạo vi nang .21 Bảng 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng kích cỡ đầu nhỏ giọt đến kích thước vi nang carrageenan 1,2% (n=20) 25 Bảng 3.3 Độ rã vi nang đông khô carrageenan 1,2% với dung dịch KCl 3% CaCl2 3% điều kiện pH mô đường tiêu hoá 31 Bảng 3.4 Số lượng S boulardii vi nang tươi carrageenan 1,2% - KCl 3% 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Carrageenan polysacarit tự nhiên quan trọng mặt thương mại, chiết xuất từ loài rong đỏ sử dụng rộng rãi ngành công nghiệp thực phẩm [1] Tại vùng biển Việt Nam có 800 loài rong biển thuộc tất ngành rong đỏ công bố giới, số có gần 40 lồi rong đỏ chứa carrageenan với hàm lượng cao [20] Trong thập kỷ qua, nhờ tính chất hóa lý hấp dẫn carrageenan tính chất tạo gel nồng độ thấp, gel bền, ổn định,… [61]; tính thân thiện với mơi trường, tính tương thích sinh học độc tính thấp [68], carrageenan phát triển thành phương tiện vật liệu sinh học đa để phân phối thuốc [45] Trong đó, carrageenan sử dụng vật liệu bao bọc q trình vi nang hố [29] Nấm men Saccharomyces boulardii vi sinh vật (VSV) probiotics tìm thấy hệ VSV đường ruột người [36] Khi đưa vào thể với số lượng đủ lớn đem lại nhiều lợi ích cho người như: ức chế tác nhân gây bệnh ruột, bất hoạt độc tố VSV, tác dụng đến niêm mạc ruột, điều chỉnh hệ VSV bình thường, điều hồ hệ thống miễn dịch,… [52] Tuy nhiên, nấm men qua đường tiêu hố bị tác động bất lợi yếu tố pH dịch vị, enzym tiêu hố đó, khơng phát huy hết tác dụng điều trị [8] Để giải vấn đề trên, cơng nghệ vi nang hóa nấm men Saccharomyces boulardii nhờ hệ gel carrageenan phương pháp đơn giản phổ biến sản xuất chế phẩm probiotics, giúp bảo vệ nấm men khỏi tác động bất lợi di chuyển đường tiêu hóa [48] Hạt vi nang tạo thành cần có hình dạng cầu đều, bề mặt đồng nhất, có đồng kích thước phải chứa đủ lượng tế bào nấm men cần thiết Đồng thời, vi nang phải bảo vệ nấm men pH dày mơ phỏng, cần có khả giải phóng nấm men pH ruột mơ để phát huy tác dụng hệ tiêu hoá [34] Tính đến thời gian tại, số nghiên cứu tạo vi nang probiotics sử dụng carrageenan tiến hành giới [42], [67], [68] Tiếp nối nghiên cứu đó, đề tài: “Khảo sát khả vi nang hoá nấm men Saccharomyces boulardii nguyên liệu carrageenan” thực với mục tiêu: Khảo sát số thơng số q trình tạo vi nang từ carrageenan Đánh giá số đặc tính vi nang carrageenan chứa nấm men Saccharomyces boulardii VSV probiotics nói chung nhạy cảm với độ ẩm môi trường sống Độ ẩm cao làm giảm khả sống sót probiotics [54], [72] Do đó, vật liệu đóng gói probiotics phải đảm bảo độ ẩm xâm nhập tối thiểu giữ khơng đổi để đạt ổn định probiotics trình bảo quản lâu dài [28] Vì vậy, nguyên liệu probiotics dạng vi nang đơng khơ, hút ẩm dẫn đến giảm nhanh chóng tế bào sống probiotics bao gói Dựa nhận xét bàn luận trên, KCl 3% dung dịch đông tụ lựa chọn để vi nang hoá nấm men S boulardii 3.1.5 Khảo sát độ rã vi nang carrageenan đông khô điều kiện pH mô dịch dày, ruột non đại tràng Thực tạo vi nang tươi vi nang đông khô với phương pháp thông số giống mục 3.1.4 Thử độ rã 0,5g vi nang đông khô qua mơi trường mơ dịch tiêu hóa dày pH 1,2 (50 ml) 2h, ruột non pH 6,8 (50 ml) 3h đại tràng pH 7,4 (50 ml) thời gian lại theo phương pháp nêu mục 2.3.6 Kết Bảng 3.3 Độ rã vi nang đông khô carrageenan 1,2% với dung dịch KCl 3% CaCl2 3% điều kiện pH mơ đường tiêu hố Điều kiện pH Carrageenan 1,2% - KCl 3% Carrageenan 1,2% - CaCl2 3% pH 1,2 - Dung dịch thử suốt - Hạt suốt, không rã 2h - Dung dịch thử đục lên dần - Các hạt suốt rã nhỏ dần Hết 2h, hạt có kích thước nhỏ khơng đáng kể pH 6,8 - Dung dịch thử suốt - Hạt suốt, không rã 3h Không thực pH 7,4 - Dung dịch thử đục dần - Hạt rã hồn tồn sau 90 phút Khơng thực Chú thích: Hình ảnh kết thử độ rã trình bày phụ lục Nhận xét bàn luận Bảng 3.3 cho thấy, với hạt đơng khơ hình thành từ dung dịch đông tụ KCl 3%, sau 2h lắc dịch dày mô pH 1,2 chuyển tiếp vào dịch ruột non mô pH 6,8 (lắc 3h) tất hạt khơng rã, dung dịch thử sau pH 31 suốt Tuy nhiên tiếp tục chuyển hạt vào dịch đại tràng mơ pH 7,4 thấy hạt rã hồn tồn vịng 90 phút Nghiên cứu Sun Xiaoxiao cộng năm 2019, giải thích pH 1,2; ion sulfat κ-carrageenan bị proton hoá làm tăng tính kỵ nước κ-carrageenan nên ngăn hút nước vào hạt dẫn đến hạt không rã [70] Tại pH 6,8, khơng có tượng hồ tan nhóm sulfat κcarrageenan dẫn đến hạt tồn liên kết nội phân tử giữ cấu trúc hạt [64] Tại pH 7,4; nhóm sulfat κ-carrageenan bị khử proton, tạo cho hạt ưu nước, từ dung dịch nước xung quanh dễ dàng xâm nhập vào hạt dẫn đến hạt hút nước trương nở rã [70] Đối với hạt đông khô hình thành từ dung dịch đơng tụ CaCl2 3%, trình khảo sát, dung dịch pH 1,2 đục lên dần hạt rã nhỏ dần theo chế bào mịn Sau 2h, hạt có kích thước nhỏ khơng đáng kể Ngun nhân ion hố trị dịch dày mơ H+ thay vị trí ion Ca2+ có vi nang ιcarrageenan, từ phá vỡ tương tác Ca2+ nhóm sulfat dẫn đến độ bền gel giảm Dù vậy, thời gian khảo sát (lắc 2h), thay ion chưa diễn đầy đủ tất vị trí thay mạch polyme carrageenan, nên hạt rã nhỏ dần, mòn dần đến đủ 2h hạt cịn có kích thước nhỏ không đáng kể Dựa vào nhận xét bàn luận trên, KCl 3% dung dịch đông tụ lựa chọn để vi nang hoá nấm men S boulardii Sau khảo sát từ mục 3.1.1 đến 3.1.5, đề tài lựa chọn thơng số q trình vi nang hoá để cố định S boulardii vào vi nang carrageenan: - Carrageenan 1,2% - Dung dịch đông tụ: KCl 3% - Khoảng cách nhỏ giọt: cm - Kích cỡ đầu nhỏ giọt: pipet Pasteur (D2) - Thời gian ngâm đông tụ hạt: 15 - 20 phút 3.2 Đánh giá số đặc tính vi nang carrageenan chứa S boulardii Thực cố định S boulardii vào vi nang theo thông số lựa chọn Đánh giá thể chất bên ngoài, cấu tạo bên hạt đánh giá số đặc tính probiotics vi nang carrageenan chứa S boulardii 3.2.1 Đánh giá thể chất bên cấu tạo bên vi nang carrageenan chứa S boulardii Cách tiến hành Tất thao tác thực tủ cấy vô trùng a Tạo vi nang tươi chứa nấm men S boulardii: thực nuôi cấy nấm men S boulardii theo phương pháp nêu mục 2.3.7 Hết thời gian ni cấy, ly tâm dịch ni 32 cấy 4000 vịng/phút 10 phút để thu sinh khối Trộn sinh khối S boulardii với 20 ml dung dịch carrageenan 1,2% hấp tiệt trùng để nguội đến nhiệt độ phòng Khuấy từ thu hỗn dịch đồng Sử dụng pipet Pasteur hấp tiệt trùng nhỏ giọt hỗn dịch carrageenan - S boulardii vào 100ml dung dịch KCl 3% hấp tiệt trùng (dung dịch KCl đựng cốc có mỏ hấp tiệt trùng) Khoảng cách nhỏ giọt cm Tốc độ nhỏ giọt: 60 - 80 giọt/phút [16] Thực nhiệt độ phòng Ngâm vi nang KCl khoảng 15 - 20 phút Sau đó, vớt hạt rửa lần dung dịch NaCl 0,9% hấp tiệt trùng Quan sát thể chất vi nang tươi theo phương pháp nêu mục 2.3.5.a b Tạo vi nang đông khô chứa nấm men S boulardii: vi nang tươi hình thành từ mục (a) đem tiền đông đông khô theo phương pháp nêu mục 2.3.4 Quan sát thể chất vi nang đông khô theo phương pháp nêu mục 2.3.5.a c Tạo lát cắt mỏng vi nang tươi đem đông khô: lấy ngẫu nhiên - hạt vi nang tươi hình thành từ mục (a), sau sử dụng dao lam tạo - lát cắt mỏng, đem đông khô quan sát kính hiển vi 4X theo phương pháp nêu mục 2.3.5.b Kết quả: Từ hình 3.6 hình 3.7, mơ tả kết khảo sát sau: Thể chất bên - Vi nang tươi carrageenan 1,2% KCl 3%: Hạt cầu đều, màu trắng đục, kích thước đồng đều, bền cứng bề mặt hạt đồng - Vi nang đông khô carrageenan 1,2% KCl 3%: Hạt teo, cứng chắc, khô, bề mặt nhăn nhúm xù xì Cấu tạo bên trong: vỏ nhân vi nang khơng phân biệt rõ ràng (Hình 3.7.c) (a) (b) Hình 3.6 Vi nang chứa sinh khối S boulardii hình thành từ carrageenan 1,2% với KCl 3%: (a) mẫu tươi; (b) mẫu đông khô 33 (a) (b) (c) Hình 3.7 Vi nang chứa sinh khối S boulardii (carrageenan 1,2% - KCl 3%) (a) Mẫu tươi kính lúp soi (độ phóng đại 16X) (b) Mẫu đơng khơ kính lúp soi (độ phóng đại 16X) (c) Lát cắt mỏng sau đơng khơ kính hiển vi quang học (độ phóng đại 4X) Nhận xét bàn luận Về thể chất bên Kết cho thấy hạt vi nang tươi chất tương tự trước cố định nấm men vào, hình dạng cầu đều, bền cứng, bề mặt hạt đồng có đồng kích thước Tuy nhiên, hạt có màu trắng đục sinh khối S boulardii phối hợp vào Các hạt vi nang hình thành theo ngun tắc tách pha đơng tụ hố muối (cịn gọi ngun tắc ion hố tạo gel) KCl carrageenan, trình bày cụ thể mục 3.1.1, tạo thành hạt đông tụ dạng gel [15] Các hạt gel hình thành theo chế tạo gel κ-carrageenan với có mặt ion kali, kết hình thành mạng lưới chiều vững từ việc kết hợp cấu trúc xoắc ốc κ-carrageenan, từ tạo thành hạt bền cứng, cụ thể chế hình thành trình bày mục 3.1.1 Năm 2020, Một nghiên cứu cố định B megaterium vào hạt carrageenan – KCl giải thích việc sử dụng dung dịch KCl trình hình thành hạt tạo hình thành cấu trúc chiều cấu trúc xoắn ốc, từ tạo thành hạt vi nang cứng bền [42] Sau đơng khơ, kết cho thấy hạt chất tương tự trước phối hợp nấm men vào, hạt bị teo đi, cứng chắc, bề mặt nhăn nhúm, xù xì khơ Ngun nhân dẫn đến thể chất trình bày cụ thể mục 3.1.4 Các kết phù hợp với số cơng bố vi nang có thành phần carrrageenan Năm 2014, Cristian Dima cộng nghiên cứu bao lớp κ-carrageenan vào hạt vi cầu chitosan cho lớp bao κ-carrageenan hình thành màng không [31] Năm 2021, Samir Nasser cộng nghiên cứu hình thái gel κ-carrageenan chứa Bacillus thuringiensis israelensis cho bề mặt κ-carrageenan gồ ghề với diện lỗ xốp không [55] Về cấu tạo bên hạt Hình 3.7.c cho thấy, bề mặt lát cắt mỏng hạt vi nang, vỏ nhân vi nang không phân biệt rõ ràng nên vi nang hình thành có cấu tạo bên matrix, 34 κ-carrageenan sử dụng chất cố định nấm men cố định vào matrix κ-carrageenan theo phương pháp bẫy [25], [42], [48], [63] Cụ thể là, mạng lưới chiều bên vi nang tạo thành theo chế tạo gel κcarrageenan với có mặt ion kali trình bày mục 3.1.1 Sau đó, theo phương pháp bẫy, nấm men S boulardii nhốt vào mạng lưới phân tán khắp vi nang [11] 3.2.2 Đánh giá khả giải phóng S boulardii vi nang carrageenan đông khô điều kiện pH mô dịch dày, ruột non đại tràng Thực tạo vi nang tươi vi nang đông khô với thông số giống mục 3.2.1.a 3.2.1.b Thử độ rã 0,5 g vi nang đông khô qua môi trường mô dịch dày pH 1,2 (50 ml) 2h; dịch ruột non pH 6,8 (50 ml) 3h dịch đại tràng pH 7,4 (50 ml) thời gian lại theo phương pháp nêu mục 2.3.6 Kết thúc thử độ rã, môi trường pH 7,4 sử dụng làm tiêu giọt ép theo phương pháp nêu mục 2.3.11 để quan sát có mặt tế bào S boulardii Kết quả: Từ hình 3.8, kết thử độ rã mơ tả sau: - Qua pH 1,2: sau 2h thử, dung dịch thử suốt, hạt có màu trắng khơng rã - Chuyển hạt sang pH 6,8: sau 3h thử, dung dịch thử suốt, hạt có màu trắng không rã - Chuyển hạt sang pH 7,4: Dung dịch thử đục trắng dần, hạt bị bào mòn nhỏ dần, sau 90 phút hạt rã hoàn toàn thu dung dịch đục trắng Kết soi kính hiển vi 100X thấy mật độ tế bào S boulardii vi trường cao có tượng sinh sản nảy chồi (hình 3.9) (1) (3) (2) Hình 3.8 Kết thử độ rã qua điều kiện pH mô đường tiêu hố vi nang đơng khơ chứa S boulardii theo công thức carrageenan 1,2% - KCl3% (1) Dung dịch pH 1,2 (2h) (2) Dung dịch pH 1,2 (2h) chuyển tiếp sang pH 6,8 (3h) (3) Dung dịch pH 1,2 (2h) chuyển tiếp sang pH 6,8 (3h) sang pH 7,4 (90 phút) 35 Hình 3.9 Hình ảnh tế bào S boulardii sau pH 7,4 kính hiển vi quang học (độ phóng đại 100x) Nhận xét bàn luận So với độ rã hạt vi nang đông khô chưa cố định S boulardii (kết mục 3.1.5), kết khảo sát trường hợp cố định S boulardii cho liệu tương tự Đó là, sau 2h lắc dịch dày mô pH 1,2 chuyển tiếp vào dịch ruột non mô pH 6,8 lắc 3h tất hạt không rã, dung dịch thử sau pH suốt Khi tiếp tục chuyển hạt vào dịch đại tràng mơ pH 7,4 thấy dung dịch thử đục dần hạt nhỏ dần Sau 90 phút hạt rã hồn tồn Tuy nhiên, mơi trường pH 7,4 sau thời gian lắc vi nang, dung dịch thử chuyển sang màu trắng đục sinh khối S boulardii bên hạt bị ngồi với thành phần muối kali carrageenan Khi làm tiêu soi kính hiển vi (độ phóng đại 100x) thấy mật độ tế bào S boulardii diện tích vi trường cao Hình 3.9 cho thấy sau 90 phút qua pH 7,4; S boulardii có tượng sinh sản nảy chồi nên chứng tỏ S boulardii cịn sống vi nang Điều giải thích việc cố định S boulardii vi nang carrageenan giúp bảo vệ S boulardii khỏi điều kiện bất lợi đường tiêu hoá pH 1,2 giải phóng vị trí có lợi đại tràng pH 7,4 [62] Năm 2014, Kunyeit Lohith Appaiah Anu thử in vitro đặc tính probiotics nhóm nấm men cho S boulardii có khả phát triển mơi trường pH 6,8 đến 7,5 thời gian khảo sát 2h đến 48h [50] S boulardii VSV kỵ khí tuỳ tiện phát triển tốt nhiệt độ thể người [62] Các điều kiện thử độ rã máy lắc ổn nhiệt (pH 7,4; nhiệt độ 37°C khí O2 tạo từ chuyển động tròn máy) điều kiện S boulardii phát triển tốt Vì vậy, vi nang đông khô chứa nấm men S boulardii (carrageenan 1,2% KCl 3%) có khả giữ cho S boulardii sống sót qua pH 1,2 (dịch dày mơ phỏng), có khả giải phóng S boulardii khỏi hạt pH 7,4 (dịch đại tràng mô phỏng) để phát huy tác dụng cho vật chủ, đáp ứng đặc tính chế phẩm probiotics [35] 36 Các giải thích cấu trúc hạt đơng khơ carrageenan 1,2% - KCl 3% nguyên sau qua pH 1,2 (2h) pH 6,8 (3h) rã hoàn toàn pH 7,4 sau cùng, trình bày cụ thể mục 3.1.5 3.2.3 Đánh giá số lượng S boulardii vi nang tươi carrageenan Cách tiến hành - Tất bước thực tủ cấy vô trùng - Chuẩn bị môi trường pha lỗng NaCl 0,9% mơi trường thạch MT2 theo phương pháp nêu mục 2.3.10 - Thực tạo vi nang tươi chứa nấm men S boulardii với thông số phương pháp giống mục 3.2.1.a - Phá hạt vi nang tươi 0,5g 50 ml NaCl 0,9% máy khuấy từ thu dung dịch phá hạt đồng - - Hút xác 0,5 ml dung dịch phá hạt thực pha loãng liên tục với NaCl 0,9% (tỷ lệ 1:9) đến thu 5,0 ml dung dịch có nồng độ pha loãng 10-6 theo phương pháp nêu mục 2.3.10 Hút xác 10µl nồng độ pha loãng cấy bề mặt thạch MT2 Đặt tủ ấm 30°C, sau 24 - 36h tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc mọc đĩa tính tốn số lượng S boulardii 1g vi nang tươi theo công thức - nêu mục 2.3.10 Thực lặp lại lần lấy kết trung bình Kết Bảng 3.4 Số lượng S boulardii vi nang tươi carrageenan 1,2% - KCl 3% Số lần thử X (CFU/g) Log CFU/g Lần 1,97 × 10( 9,29 Lần 2,07 × 10( 9,32 Lần Trung bình 1,91 × 10( 1,98 × 10( 9,28 9,30 ± 0,02 Nhận xét bàn luận: Từ bảng 3.4 thấy số lượng S boulardii bao gói 1g vi nang tươi nằm khoảng 9,28 đến 9,32 log CFU/g nên carrageenan có khả cố định S boulardii với số lượng cao Để trở thành chế phẩm probiotics dạng thuốc phát huy tác dụng cho vật chủ, vi nang tươi cần tiến hành đông khơ để giữ khả sống sót S boulardii đạt số lượng tối thiểu 106 -107 CFU/g [35] 37 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Sau thời gian nghiên cứu, đề tài giải mục tiêu đặt sau: 4.1.1 Đã khảo sát số thơng số q trình tạo vi nang từ carrageenan Các thông số lựa chọn để tạo vi nang là: - Nồng độ carrageenan 1,2% - Dung dịch đơng tụ KCl 3% - Kích cỡ đầu nhỏ giọt: pipet Pasteur (d = mm) - Khoảng cách nhỏ giọt cm - Tốc độ nhỏ giọt: 60 - 80 giọt/phút - Nhiệt độ nhỏ giọt: nhiệt độ phịng - Thời gian ngâm đơng tụ hạt: 15 - 20 phút Hạt vi nang tươi thu có hình dạng cầu đều, bề mặt hạt đồng hạt có đồng kích thước Các hạt sau đơng khơ chất cứng chắc, bền 2h điều kiện pH 1,2 (dạ dày mơ phỏng) rã hồn tồn pH 7,4 (đại tràng mô phỏng) sau qua pH 1,2 (2h) pH 6,8 ruột non mô (3h) 4.1.2 Đã cố định S boulardii vào vi nang carrageenan 1,2% - KCl 3% đánh giá số đặc tính vi nang - S boulardii cố định vào vi nang theo phương pháp bẫy, tạo thành hạt có cấu tạo Matrix Hạt tươi có hình dạng cầu đếu Hạt đơng khơ chất cứng - Vi nang đơng khơ có khả bảo vệ S boulardii khỏi tác động bất lợi pH 1,2 (dịch dày mơ phỏng), có khả giải phóng S boulardii khỏi hạt pH 7,4 (dịch đại tràng mô phỏng) để phát huy tác dụng cho vật chủ, đáp ứng đặc tính chế phẩm probiotics theo FAO/WHO - Vi nang tươi cố định số lượng S boulardii cao, số lượng S boulardii nằm khoảng từ 9,28 đến 9,32 log CFU/g 4.2 Đề xuất Bên cạnh kết đạt được, thời gian nghiên cứu có hạn nên đề tài xin đưa số đề xuất nhằm hoàn thiện nâng cao tính ứng dụng thực tế sau: - Đánh giá số lượng S boulardii vi nang đông khơ carrageenan - Khảo sát tỷ lệ sống sót S boulardii vi nang theo thời gian bảo quản 38 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Vũ Ngọc Ban, Trần Nho Bốn, cs (2007), "Nghiên cứu ứng dụng carrageenan từ rong đỏ Eucheuma gelatinae làm phụ gia chế biến thực phẩm", Tạp chí Hố học, 45(6A), tr 146-149 Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V Tập 2, Nhà xuất Y học, Hà Nội Phạm Thị Cúc, Tạ Văn Tùng (2008), Vật lý đại cương, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, Hà Nội, tr 23-42 Nguyễn Lân Dũng (2012), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội, tr 221-228 Nguyễn Phan Dũng (2018), Xác suất thống kê, Bộ mơn Tốn - Tin, Trường đại học Dược Hà Nội, tr 94-99 Nguyễn Thị Thanh Duyên (2020), Giáo trình Thực tập Kỹ thuật sản xuất Dược phẩm, Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr 65-70 Phạm Hông Hải, Nguyễn Xuân Nguyên, cs (2007), "Một số ứng dụng carrageenan khả sử dụng kappa-carrageenan từ rong biển Việt Nam 10 11 12 13 14 bảo quản chế biến thực phẩm", Tạp chí Khoa học Công nghệ, 45(4), tr 87-93 Nguyễn Trọng Hiệp, Bùi Tùng Hiệp (2009), "Bàn việc đảm bảo khả sống sót vi sinh vật sản phẩm probiotic", Tạp chí Dược học, 393, tr 2-5 Đào Trọng Hiếu (2007), "Tối ưu hóa quy trình cơng nghệ tách chiết carrageenan từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii)", Tạp chí Khoa học Công nghệ, 7, tr 2529 Kim Sovanna (2021), Khảo sát ảnh hưởng số thơng số đến tính chất vi nang alginat - tinh bột chứa Saccharomyces boulardii, Khoá luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 18-19 Từ Minh Koóng, Nguyễn Đình Luyện, cs (2015), Kỹ thuật sản xuất Dược phẩm, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 181-185 Nguyễn Văn Long (2005), Một số chuyên đề bào chế đại, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 112-128 Lương Đức Phẩm (2017), Công nghệ lên men, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, Hà Nội, tr 9-10, 72-76 Lương Đức Phẩm (2009), Nấm men công nghiệp, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 9-10, 29-44, 56-57 15 16 17 18 19 Phạm Thị Phương (2015), Nghiên cứu bào chế vi nang probiotics phương pháp đơng tụ, Khố luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr 910 Phạm Thị Phương, Nguyễn Thị Thùy Trang, cs (2016), "Nghiên cứu bào chế vi nang probiotics phương pháp đông tụ", Tạp chí Dược học, 56(5), tr 61-64 Đỗ Ngọc Quang (2015), Giáo trình thực tập sinh học, Bộ mơn Vi sinh Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr 6-7 Nguyễn Thị Thu (2011), Bước đầu nghiên cứu sản xuất carrageenan từ rong sụn kappaphycus alvarezii, Khoá luận tốt nghiệp Đại học, Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ, TP HCM, tr 14-22 Nguyễn Thị Thu Thùy, Lê Thị Liên Thanh (2015), "Nghiên cứu chiết tách carrageenan từ rong sụn Ninh Thuận", Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Đại học 20 Đà Nẵng, 11(96), tr 114–118 Trần Đình Toại, Châu Văn Minh (2004), Tiềm rong biển Việt Nam, Nhà 21 xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 10-20 Đàm Thanh Xuân, Nguyễn Mai Hương, cs (2016), "Đánh giá vai trò tinh bột sữa gầy đến trình tạo vi nang probiotic chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ATCC 4356", Tạp chí Dược học, 487(56), tr 8-11 Tài liệu tiếng Anh 22 Abadias M., Benabarre A., et al (2001), "Effect of freeze drying and protectants on viability of the biocontrol yeast Candida sake", International Journal of Food Microbiol, 65(3), pp 173-182 23 Afzaal Muhammad, Saeed Farhan, et al (2020), "Survival and stability of free and encapsulated probiotic bacteria under simulated gastrointestinal and thermal conditions", International Journal of Food Properties, 23(1), pp 1899-1912 24 Amir Mortazavian, Hadi Razavi Seyed, et al (2007), "Principles and methods of microencapsulation of probiotic microorganisms", Iranian Journal of Biotechnology, 5, pp 1-15 25 Asgari Shadi, Pourjavadi Ali, et al (2020), "Polymeric carriers for enhanced delivery of probiotics", Advanced Drug Delivery Reviews, 161-162, pp 01-21 26 Bartkowiak A., Hunkeler D (2001), "Carrageenan-oligochitosan microcapsules: optimization of the formation process", Colloids Surf B Biointerfaces, 21(4), pp 285-298 27 Benita Simon (2006), Microencapsulation Methods and Industrial Applications, CRC Press, Israel, pp 64-150 28 29 30 31 32 Chávez B E., Ledeboer A M (2007), "Drying of Probiotics: Optimization of Formulation and Process to Enhance Storage Survival", Drying Technology, 25(7-8), pp 1193-1201 Christine Wandrey, Artur Bartkowiak, et al (2009), Materials for Encapsulation, University of Nottingham, United Kingdom, pp 31-100 Czerucka D., Rampal P (2002), "Experimental effects of Saccharomyces boulardii on diarrheal pathogens", Microbes and Infection, 4, pp 733–739 Dima Cristian, Cotârlet Mihaela, et al (2014), "Microencapsulation of essential oil of pimento [Pimenta dioica (L) Merr.] by chitosan/κ-carrageenan complex coacervation method", Innovative Food Science & Emerging Technologies, 22, pp 203-211 Edwards-Ingram L., Gitsham P., et al (2007), "Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae", Appl Environ Microbiol, 73(8), pp 2458-2467 33 Élie Metchnikoff (1907), The prolongation of life - Optimistic studies, Heinemann, London, pp 161-183 34 FAO/WHO (2002), Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food - Report of a Joint FAO/WHO Working Group, FAO/WHO, London and Ontario, pp 39- 35 36 37 38 39 40 41 44 FAO/WHO (2001), Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria – Joint FAO/WHO Expert Consultation, FAO/WHO, Cordoba, pp 2-12 Fijan S (2014), "Microorganisms with claimed probiotic properties: an overview of recent literature", International Journal of Environ Res Public Health, 11(5), pp 4745-4767 Fuller R (1991), "Probiotics in human medicine", Gut, 32(4), pp 439-442 Fuller R (1989), "Probiotics in man and animals", Jourrnal of Applied Bacteriol, 66(5), pp 365-378 Ghanbarzadeh Mehrnaz, Golmoradizadeh Asma, et al (2018), "Carrageenans and carrageenases: versatile polysaccharides and promising marine enzymes", Phytochemistry Reviews, 17, pp 3-6 Guarner F., Khan A G., et al (2012), "World Gastroenterology Organisation Global Guidelines: probiotics and prebiotics October 2011", Journal of Clinical Gastroenterol, 46(6), pp 468-481 Gulrez Syed, Al-Assaf Saphwan, et al (2011), Hydrogels: Methods of Preparation, Characterisation and Applications, Wrexham Glyndwr University, United Kingdom, pp 127, 142 42 43 44 45 46 Hamdani Syarif, Nurlatifah Sri, et al (2020), "Immobilization of Bacillus megaterium in Carrageenan from Maluku Sea and Their Effect on Protease Production", Rocznik Ochrona Środowiska (Annual Set The Environment Protection Journal), 22, pp 60-69 Hamilton-Miller J.M.T (2004), "Probiotics and prebiotics in the elderly", Postgraduate Medical Journal, 80, pp 447-451 Jadupati Malakar, Tanmay Das, et al (2012), "Microencapsulation: An indispensable technology for drug delivery system", International research journal of pharmacy, 3(4), pp 8-13 Jingjing Liu, Xiudan Zhan, et al (2015), "Review for carrageenan-based pharmaceutical biomaterials: Favourable physical features versus adverse biological effects", Carbohydrate Polymers, 121, pp 27-36 Kara Selim, Arda Ertan, et al (2006), "Phase transitions of kappa-carrageenan gels in various types of salts", Journal of Applied Polymer Science, 102, pp 47 3008-3016 Kumar H., Salminen S (2016), Probiotics, Academic Press, Oxford, pp 510- 48 515 Liliana Serna Cock, Vladimir Vallejo Castillo (2013), "Probiotic encapsulation", 49 50 51 52 53 54 55 African journal of microbiology research, 7, pp 47-43 Lilly D M., Stillwell R H (1965), "Probiotics: growth-promoting factors produced by microorganisms", Science, 147(3659), pp 747-748 Lohith Kunyeit, Anu Appaiah (2014), "In vitro probiotic characterization of yeasts of food and environmental origin", International Journal of Probiotics and Prebiotics, 9, pp 87-92 Masakuni Tako (2015), "The Principle of Polysaccharide Gels", Advances in Bioscience and Biotechnology, 6, pp 22-36 McFarland L.V (2017), "Common Organisms and Probiotics - Saccharomyces boulardii", The Microbiota in Gastrointestinal Pathophysiology, University of Washington, United States, pp 145–164 McFarland L.V., Bernasconi P (1993), "Saccharomyces boulardii: A review of an innovative biotherapeutic agent", Microbial Ecology in Health and Disease, 6, pp 157-171 Min M., Bunt C R., et al (2017), "Effect of Non-Dairy Food Matrices on the Survival of Probiotic Bacteria during Storage", Microorganisms, 5(3), pp 43 Nasser Samir, Costa Marcia Parente Melo da, et al (2021), "Kappa-carrageenanBacillus thuringiensis israelensis hydrogels: A promising material to combat larvae of the Aedes aegypti mosquito", Carbohydrate Polymer Technologies and Applications, 2, pp 100-125 56 59 Nitika Agnihotri, Ravinesh Mishra, et al (2012), "Microencapsulation – A Novel Approach in Drug Delivery: A Review", Indo Global Journal of Pharmaceutical Sciences, 2(1), pp 1-20 Núñez-Santiago M C., Tecante Alberto, et al (2011), "Rheology and microstructure of κ-carrageenan under different conformations induced by several concentrations of potassium ion", Food Hydrocolloids, 25(1), pp 32-41 Peng Wu, Masanao Imai (2012), Novel Biopolymer Composite Membrane Involved with Selective Mass Transfer and Excellent Water Permeability, InTechOpen, Rijeka (Croatia), pp 59-60 Phillips G O., Williams P A (2009), Handbook of hydrocolloids, Woodhead 60 Publishing Limited, United Kingdom, pp 1-22, 164-185 Popa E G., Gomes M E., et al (2011), "Cell Delivery Systems Using Alginate– 57 58 Carrageenan Hydrogel Beads and Fibers for Regenerative Medicine Applications", Biomacromolecules, 12(11), pp 3952-3961 61 Popescu Corina, Iordan Maria, et al (2007), Structure and properties of carragenan, Valahia University of Tărgovişte, Romania, pp 28-31 62 Prajapati Priyanka, Patel Miral, et al (2013), "Saccharomyces boulardii - A probiotic of choice", CIBTech Journal of Biotechnology, 2(2), pp 1-6 Prakram Chauhan, Arunika Saxena (2016), "Bacterial carrageenases: an overview of production and biotechnological applications", Biotech, 6, pp 118 Pratiwi Pudjiastuti, Siti Wafiroh, et al (2020), "Disintegration, In vitro Dissolution, and Drug Release Kinetics Profiles of Kappa-carrageenan-based Nutraceutical Hard-shell Capsules Containing Salicylamide", Open Chemistry, 18, pp 226-231 Rhein Knudsen, Le M T N., et al (2015), "Seaweed hydrocolloid production: an update on enzyme assisted extraction and modification technologies", Mar Drugs, 13(6), pp 3340-3359 Şen Murat, Erboz Esra Nazan (2010), "Determination of critical gelation conditions of κ-carrageenan by viscosimetric and FT-IR analyses", Food Research International, 43(5), pp 1361-1364 Setijawati D., Nursyam H., et al (2018), "Carrageenan: the difference between PNG and KCL gel precipitation method as Lactobacillus acidophilus encapsulation material", IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, 137(1), pp 12-73 63 64 65 66 67 68 Setijawati Dwi (2014), "Carrageenan from Eucheuma sp and concentration difference as encapsulation material toward Lactobacillus acidophilus viability 71 at simulation GI Tract pH condition", Journal of Basic and Applied Scientific Research, 4(6), pp 261-268 Solanki H K., Pawar D D., et al (2013), "Development of Microencapsulation Delivery System for Long-Term Preservation of Probiotics as Biotherapeutics Agent", BioMed Research International, 62, pp 7-19 Sun Xiaoxiao, Liu Chao, et al (2019), "Dual-layered pH-sensitive alginate/chitosan/kappa-carrageenan microbeads for colon-targeted release of 5fluorouracil", International journal of biological macromolecules, 132, pp 487494 Tomičić Z M., Čolović R R., et al (2016), "Beneficial properties of probiotic 72 yeast Saccharomyces boulardii", Food and Feed Research, 43(2), pp 103-110 Tripathi M K., Giri S K (2014), "Probiotic functional foods: Survival of 69 70 probiotics during processing and storage", Journal of Functional Foods, 9, pp 225-241 73 Vivek K B (2013), "Use of encapsulated probiotics in dairy based foods", International Journal of Food, Agriculture and Veterinary Sciences, 3(1), pp 188-199 PHỤ LỤC Phụ lục Kết thử độ rã qua pH đường tiêu hố mơ vi nang đơng khơ carrageenan 1,2% với dung dịch đông tụ KCl 3% v CaCl2 3% (1) Mẫu KCl, hạt qua pH 1,2 (2h) (2) Mẫu KCl, hạt qua pH 1,2 (2h) chuyển tiếp sang pH 6,8 (3h) (3) Mẫu KCl, hạt qua pH 1,2 (2h); chuyển sang pH 6,8 (3h) sang pH 7,4 (90 phút) (4) Mẫu CaCl2, hạt qua pH 1,2 (2h) (2) (1) (1) (4) (2) (3)