NGUYỄN THỊ HUYỀN KHẢO sát KHẢ NĂNG SINH ACID KOJIC của nấm mốc aspergillus oryzae KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HUYỀN KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH ACID KOJIC CỦA NẤM MỐC Aspergillus oryzae KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HUYỀN Mà SINH VIÊN: 1301193 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH ACID KOJIC CỦA NẤM MỐC Aspergillus oryzae KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Đàm Thanh Xuân ThS Đào Anh Hồng Nơi thực hiện: Bộ mơn Cơng nghiệp Dược HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ kính trọng lịng biết ơn chân thành tới PGS TS Đàm Thanh Xuân – người thầy truyền dạy cho học quý báu lòng yêu khoa học từ ngày đầu nghiên cứu tới nay, hết lòng hướng dẫn, tận tâm bảo giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn ThS Đào Anh Hồng cho tơi lời khun bổ ích, nhiệt tình hướng dẫn, giải đáp thắc mắc giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo anh, chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược, đặc biệt tổ Công nghệ Sinh học bảo, giúp đỡ giải khó khăn tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, phịng ban tồn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ, tạo môi trường tốt cho học tập nghiên cứu trường suốt năm Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè ln bên, tiếp cho động lực, giúp đỡ quãng đường học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 17 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thị Huyền MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Acid kojic 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Đặc điểm 1.1.3 Công dụng 1.2 Phương pháp sản xuất acid kojic 1.3 Vi sinh vật sinh acid kojic 1.3.1 Giới thiệu chung 1.3.2 Chi Aspergillus 1.3.3 Loài Aspergillus oryzae 10 1.4 Một số nghiên cứu khả sinh acid kojic Aspergillus oryzae 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 14 2.1.1 Nguyên vật liệu 14 2.1.2 Thiết bị sử dụng 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1 Định tính chiết tách acid kojic từ dịch ni cấy A oryzae 17 2.2.2 Lựa chọn điều kiện lên men Aspergillus oryzae 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Phương pháp giữ giống 17 2.3.2 Phương pháp lên men thu acid kojic 17 2.3.3 Phương pháp tách chiết tinh chế acid kojic từ dịch lên men 18 2.3.4 Phương pháp định tính acid kojic 18 2.3.5 Phương pháp Schoorl- Regenbogen định lượng đường 19 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Định tính chiết tách acid kojic từ dịch nuôi cấy A oryzae 21 3.1.1 Định tính acid kojic dịch lên men Aspergillus oryzae 21 3.1.2 Chiết tách acid kojic từ dịch ni cấy xác định đặc tính sản phẩm thu được…………………………………………………………………………… 23 3.2 Lựa chọn điều kiện lên men Aspergillus oryzae 29 3.2.1 Lựa chọn nồng độ glucose ban đầu môi trường nuôi cấy 29 3.2.2 Khảo sát khả tiêu thụ glucose Aspergillus oryzae theo thời gian 33 3.2.3 Lựa chọn thời điểm kết thúc trình lên men 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A oryzae ESI – MS FDA Aspergillus oryzae Phổ khối lượng ion hóa điện tử (Electrospray Ionization - Mass Spectrometry) Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) IR Hồng ngoại (Infrared) m Khối lượng w/v Khối lượng/ thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số dạng bào chế sản phẩm có chứa acid kojic Bảng 1.2 Độc tố số chủng giống nấm mốc thuộc chi Aspergillus Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng đề tài 14 Bảng 2.2 Các môi trường sử dụng đề tài 15 Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng .16 Bảng 3.1 Kết định tính acid kojic dịch lên men Aspergillus oryzae 22 Bảng 3.2 Kết sắc ký lớp mỏng sản phẩm thu mẫu acid kojic nguyên liệu .25 Bảng 3.3 Kết sắc ký lớp mỏng sản phẩm thu hệ dung môi khác .25 Bảng 3.4 Kết phân tích phổ hồng ngoại sản phẩm thu 26 Bảng 3.5 Kết phân tích phổ khối lượng 28 Bảng 3.6 Khả tiêu thụ glucose Aspergillus oryzae thay đổi nồng độ glucose môi trường 30 Bảng 3.7 Khả sinh acid kojic Aspergillus oryzae thay đổi nồng độ glucose môi trường 31 Bảng 3.8 Khả tiêu thụ glucose A oryzae môi trường theo thời gian 34 Bảng 3.9 Kết lượng sản phẩm acid kojic thu thời điểm kết thúc trình lên men khác 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Con đường sinh tổng hợp acid kojic Aspergillus flavus Hình 1.2 Aspergillus oryzae kính hiển vi quang học (a), (b) (mơi trường Czapek) kính hiển vi điện tử (c) 11 Hình 3.1 Hình ảnh sản phẩm thô thu 23 Hình 3.2 Hình ảnh sắc ký lớp mỏng sản phẩm thu hệ dung môi 1, 2, 24 Hình 3.3 Kết chồng phổ IR acid kojic chiết từ môi trường nuôi cấy acid kojic nguyên liệu 26 Hình 3.4 Tinh thể acid kojic kính hiển vi quang học vật kính 10 27 Hình 3.5 Biểu đồ so sánh tỉ lệ tiêu thụ glucose Aspergillus oryzae thay đổi nồng độ glucose môi trường 30 Hình 3.6 Biểu đồ so sánh tỉ lệ sản phẩm thu được/ lượng glucose tiêu thụ Aspergillus oryzae thay đổi nồng độ glucose môi trường 31 Hình 3.7 Biểu đồ biến thiên lượng glucose tiêu thụ theo thời gian A oryzae .34 Hình 3.8 Biểu đồ so sánh tỉ lệ sản phẩm thu được/ lượng glucose tiêu thụ kết thúc trình lên men thời điểm khác 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Sự lên men người ý từ thời cổ đại, chủ yếu dạng kinh nghiệm dân gian lưu truyền trình koji xuất từ sớm ví dụ điển hình Từ trình này, hợp chất phân lập vào năm 1907 tiến sĩ Saito (Nhật Bản) gọi acid kojic [12] Thị trường acid kojic phát triển từ năm 1955 với nỗ lực sản xuất thuộc công ty Pfizer (Mỹ) [38] Việc sản xuất acid hữu ngày tăng giá trị thương mại nhiều lĩnh vực khác nhau: y học, cơng nghiệp thực phẩm, nơng nghiệp, cơng nghiệp hóa chất đặc biệt ngành công nghiệp mỹ phẩm (Brtko cộng sự, 2004; Bentley, 2006) [12], [14], [16], [38] Mặc dù sản xuất quy mô công nghiệp, acid kojic nghiên cứu rộng rãi nhu cầu sử dụng ngày cao với nội dung nghiên cứu thường cải thiện chủng giống trình lên men [16], [38] Acid kojic tiết từ chủng vi nấm thuộc chi Penicillium, Mucor, Aspergillus,… vi khuẩn nhóm Gluconoacetobacter [15],[21] Trong đó, Aspergillus oryzae thu hút ý nhà khoa học giới khả sinh acid kojic với nhiều nghiên cứu báo cáo (Kwak Rhee, 1991; Wakisaka cộng sự, 1998) không sinh aflatoxin [32], [35], [50] Tuy nhiên Việt Nam nghiên cứu vấn đề Mặt khác, theo Hazaa (2013), khả sinh acid kojic chủng phụ thuộc nhiều vào đặc tính chủng điều kiện ni cấy [25] Với lý đồng thời mong muốn góp phần vào nghiên cứu sản xuất acid kojic, đề tài “Khảo sát khả sinh acid kojic nấm mốc Aspergillus oryzae” tiến hành với mục tiêu sau: - Định tính chiết tách acid kojic từ dịch nuôi cấy Aspergillus oryzae - Lựa chọn điều kiện lên men Aspergillus oryzae CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Acid kojic 1.1.1 Định nghĩa Acid kojic acid hữu cơ, tạo theo phương pháp sinh học, cụ thể từ loài nấm vi khuẩn trình lên men với nhiều nguồn chất chứa carbon khác [49] 1.1.2 Đặc điểm Công thức tổng quát: C6H6O4 Tên khoa học: 5-hydroxy-2-(hydroxymethyl)pyran-4-one Thành phần: C 50,70%; H 4,23%; O 45,07% Khối lượng phân tử: 142,11 g/mol Cơng thức cấu tạo: OH O HO O Tính chất lý hóa acid kojic: Acid kojic kết tinh dạng tinh thể hình que, lăng trụ khơng màu, không mùi, tan nước (43,85 g/L), tan tốt ethanol, aceton, ethyl ether, không tan benzen, cloroform [14], [16], [38] Nhiệt độ nóng chảy: dao động từ 150 – 160℃ [8], [30] Hằng số phân ly: pKa 7,90 8,03 [15], [51] Acid kojic có cực đại hấp thụ tia cực tím bước sóng 270 nm Acid kojic phân loại ℽ-pyron đa chức năng, dễ phản ứng với tính acid yếu Nó phản ứng vị trí vịng tạo số sản phẩm có giá trị cơng nghiệp hóa học, ví dụ chelat kim loại, pyridon, pyridin, ether, azodyes, mannich base, sản phẩm cyanoethyl hóa [27], [51] Ở vị trí cacbon 5, nhóm hydroxyl hoạt động acid yếu, có khả tạo thành muối với số kim loại natri, kẽm, đồng, canxi, niken cadimi [16], [38] vi nấm phát triển dạng pellet tròn có bám dính vào thành bình mặt thống mơi trường ni cấy, ảnh hưởng tới cấp khí cho tế bào vi nấm (phụ lục 1) Hoặc điều kiện hơ hấp lựa chọn q trình ni cấy (150 vịng/ phút) chưa phải tối ưu Như vậy, trình tiêu thụ glucose Aspergillus oryzae chủ yếu diễn ngày đầu (% lượng glucose tiêu thụ 71,80%), sau ngày thứ 8, trình diễn chậm 3.2.3 Lựa chọn thời điểm kết thúc trình lên men Thời gian lên men có ảnh hưởng định không tới khả sinh sản phẩm vi sinh vật mà ảnh hưởng đến lượng tạp chất tạo thành từ ảnh hưởng đến hiệu tinh chế Thời gian lên men ngắn vi sinh vật chưa kịp sinh sản phẩm lượng sản phẩm sinh Thời gian lên men dài làm tiêu tốn nhiều lượng để trì điều kiện nuôi cấy Thời điểm tốt để thu sản phẩm thời điểm ngắn thu nhiều sản phẩm hạn chế tạp kèm theo Do đó, việc lựa chọn thời điểm kết thúc trình lên men hợp lý cần thiết Kết hợp với kết đạt khảo sát khả tiêu thụ glucose Aspergillus oryzae theo thời gian, số thời điểm kết thúc trình lên men lựa chọn để khảo sát thí nghiệm tiếp theo: ngày, 10 ngày, 12 ngày 14 ngày  Mục tiêu: Lựa chọn thời điểm kết thúc trình lên men phù hợp vừa cho nhiều sản phẩm vừa tiết kiệm thời gian  Tiến hành: Lên men Aspergillus oryzae bình nón 250 ml có chứa 100 ml mơi trường lên men (công thức bảng 2.2) với nồng độ glucose lựa chọn 10%, điều kiện hô hấp hiếu khí (tốc độ lắc 150 vịng/ phút) 30oC ngày, 10 ngày, 12 ngày, 14 ngày Sau thời gian nuôi cấy mẫu, lấy mẫu dịch lọc định lượng glucose, tiến hành song song với mẫu dịch lên men thời điểm ban đầu, theo phương pháp định lượng glucose trình bày mục 2.3.5 Đồng thời, thu sản phẩm theo phương pháp tách chiết trình bày mục 2.3.3.1, xác định khối lượng sản phẩm thu cân kỹ thuật  Kết thực nghiệm trình bày bảng 3.9 hình 3.8 36 Bảng 3.9 Kết lượng sản phẩm acid kojic thu thời điểm kết thúc q trình lên men khác Thời gian ni cấy ngày 10 ngày 12 ngày 14 ngày Lượng glucose tiêu thụ (g) 7,01 7,74 7,72 7,73 Lượng sản phẩm thu (g/ 100 ml) 0,68 0,94 1,22 0,85 Tỉ lệ sản phẩm/ glucose tiêu thụ (%) 9,70 12,14 15,80 11,00 Tỉ lệ sản phẩm/ glucose tiêu thụ (%) 20 15,8 16 12,14 12 11 9,7 8 ngày 10 ngày 12 ngày 14 ngày Thời điểm kết thúc Hình 3.8 Biểu đồ so sánh tỉ lệ sản phẩm thu được/ lượng glucose tiêu thụ kết thúc trình lên men thời điểm khác  Nhận xét bàn luận: Kết từ bảng 3.9 hình 3.8 cho thấy lượng sản phẩm acid kojic thu thời điểm khác trình lên men Aspergillus oryzae khác Từ thời điểm sau ngày đến sau 12 ngày, lượng acid kojic tăng dần nhiên đến sau 14 ngày lượng sản phẩm thu lại giảm Kết thúc trình lên men sau 12 ngày cho lượng acid kojic nhiều (1,22 g/ 100 ml) đồng thời tỉ lệ acid kojic/ glucose tiêu thụ đạt giá trị cao 15,80%, gấp 1,63 lần kết thúc trình lên men sau ngày 37 (9,70%), gấp 1,30 lần kết thúc trình lên men sau 10 ngày (12,14%) gấp 1,43 lần kết thúc trình lên men sau 14 ngày (11%) Từ kết bảng 3.8 hình 3.7, tiêu thụ glucose vi nấm từ ngày thứ 12 đến ngày thứ 14 diễn chậm Tuy nhiên lượng sản phẩm thu sau 12 ngày lại cao sau 14 ngày Nguyên nhân thời gian lên men kéo dài, tế bào vi nấm bị hạn chế tiếp xúc với glucose bắt đầu sử dụng acid kojic, chuyển hóa thành chất khác đồng thời giải phóng lượng trì sống Mặt khác, tạo thành acid kojic bị cản trở pH mơi trường giảm khơng có điều chỉnh q trình ni cấy với già hóa tế bào kéo dài thời gian dẫn đến gây bất lợi cho trình trao đổi chất tế bào Theo Ogawa cộng (1995) với nghiên cứu sản xuất acid kojic từ lên men chủng Aspergillus oryzae NRRL484, nuôi cấy điều kiện lắc, nồng độ acid kojic tăng dần theo thời gian đạt mức tối đa khoảng 12 mg/ ml vào ngày thứ 8, sau giảm dần [42] Trong nghiên cứu phân tích acid kojic (1957), Ronald Bentley tiến hành nuôi cấy chủng nấm mốc thuộc nhóm Aspergillu flavus-oryzae bình nón 10 ngày thu lượng acid kojic đạt 1,5 g – 2,0 g/ 200 ml [13] Ở Việt Nam, nhóm tác giả Trương Phương (2013) lựa chọn thời gian lên men Aspergillus oryzae sản xuất acid kojic 15 ngày Thời điểm kết thúc trình lên men sinh acid kojic tác giả nghiên cứu công bố có khác biệt khác với kết đề tài đạt (12 ngày) Kết lý giải lên men Aspergillus oryzae phương pháp lắc thông thường Ogawa sử dụng chủng giống Aspergillus oryzae NRRL484, thành phần môi trường lên men bổ sung KCl FeSO4.7H2O so với môi trường lên men đề tài sử dụng tốc độ lắc nghiên cứu Ogawa 120 vòng/ phút tốc độ lắc đề tài 150 vòng/ phút, đồng thời khác với tốc độ lắc nghiên cứu tác giả Trương Phương 200 vịng/ phút Ngồi sử dụng KCl FeSO4.7H2O, Ronald Bentley cịn bổ sung thêm NaNO3 vào mơi trường ni cấy Điều phù hợp với nghiên cứu Hazaa (2013) khả sinh acid kojic chủng phụ thuộc nhiều vào đặc tính chủng điều kiện nuôi cấy: chủng Aspergillus oryzae var effusus NRC 14 cho 25,5 g/l – 42,0 g/l acid kojic chủng Aspergillus oryzae EMCC 163 cho 0,3 g/l – 4,0 g/l acid kojic [25] 38 Như vậy, 12 ngày thời gian lên men hợp lý lựa chọn cho trình sinh tổng hợp acid kojic Aspergillus oryzae: tạo nhiều sản phẩm tỉ lệ sản phẩm/ lượng glucose tiêu thụ cao nhất, không dài tiết kiệm thời gian, chi phí trì điều kiện lên men, hạn chế gia tăng sản phẩm phụ gây trở ngại cho trình tách chiết tinh chế, hạn chế nguy nhiễm trùng ni cấy Tóm lại, quy mơ phịng thí nghiệm, q trình sinh tổng hợp acid kojic từ Aspergillus oryzae phương pháp lên men môi trường lỏng 30℃ với điều kiện hô hấp hiếu khí (tốc độ lắc 150 vịng/ phút) lựa chọn nồng độ glucose thích hợp mơi trường nuôi cấy 10%, thời gian nuôi cấy 12 ngày với lượng acid kojic thu điều kiện 1,22 g/ 100 ml, tỉ lệ sản phẩm/ glucose tiêu thụ đạt 15,80% 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Sau thời gian thực hiện, đề tài hoàn thành mục tiêu đạt kết sau: 1.1 Aspergillus oryzae có khả sinh tổng hợp acid kojic q trình ni cấy với mơi trường lỏng gồm 10% glucose, 0,25% cao nấm men, 0,1% KH2PO4 0,05% MgSO4.7H2O 30℃, điều kiện hô hấp hiếu khí (tốc độ lắc 150 vịng/ phút): pH mơi trường sau 14 ngày lên men giảm từ 6,5 xuống 5,5; kết tinh thu 0,85 g sản phẩm dạng kim hình lăng trụ, khơng màu, nhiệt độ nóng chảy từ 153,2℃ - 154,9℃, kết sắc ký lớp mỏng, phổ IR, phổ MS phù hợp với đặc tính tương ứng acid kojic 1.2 Tại quy mơ phịng thí nghiệm, thời gian lên men 12 ngày nồng độ glucose 10% môi trường điều kiện nuôi cấy lựa chọn cho trình sinh tổng hợp acid kojic Aspergillus oryzae với lượng acid kojic thu 1,22 g/ 100 ml, tỉ lệ sản phẩm/ glucose tiêu thụ đạt 15,80% Đề xuất Do thời gian nghiên cứu cịn hạn chế đồng thời để có tính ứng dụng thực tế, xin đưa số đề xuất sau: 1.1 Tiếp tục nghiên cứu khả sinh tổng hợp acid kojic Aspergillus oryzae điều kiện pH môi trường lên men khác để lựa chọn điều kiện pH nuôi cấy tốt 1.2 Tăng qui mô nghiên cứu, khảo sát lựa chọn nguồn nitơ nồng độ nguồn nitơ ni cấy Aspergillus oryzae để tiếp tục hồn thiện điều kiện ni cấy tối ưu quy mơ phịng thí nghiệm 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Văn Bá (2009), Đại cương nấm mốc, OpenStax_CNX Phạm Văn Hùng (1975), Phân loại nấm mốc Aspergillus số điểm miền Bắc Việt Nam số ứng dụng thực tiễn, Luận án chuyên khoa II, Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội, tr 3-32 Từ Minh Koóng (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 26-40 Lê Thị Phương Lan (2011), Bước đầu tìm hiểu nghiên cứu tổng quan quy trình sản xuất nước tương nấm mốc Aspergillus oryzae, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh, tr 17-23 Nguyễn Đình Luyện (2015), Thực tập kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Trường đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 44-56 Trương Phương, Trần Cát Đông, Nguyễn Tri Thành (2013), "Nghiên cứu điều chế kojic dipalmitat Phần 1: Sàng lọc chủng Aspergillus oryzae nghiên cứu điều kiện lên men thu nhận acid kojic", Tạp chí Dược học, 8, tr 35-41 Tài liệu tiếng Anh Arnstein HRV, Bentley R (1953), "The biosynthesis of kojic acid Production from [1-14C] and [3: 4-14C2] glucose and [2-14C]-1: 3-dihydroxyacetone", Biochemical Journal, 54(3), pp 493 Arnstein HRV, Bentley R (1953), "The biosynthesis of kojic acid The incorporation of labelled small molecules into kojic acid", Biochemical Journal, 54(3), pp 517 Bajpai Pratima, Agrawala PK, et al (1981), "Enzymes relevant to kojic acid biosynthesis in Aspergillus flavus", Microbiology, 127(1), pp 131-136 10 Basappa SC, Sreenivasamurthy V, et al (1970), "Aflatoxin and kojic acid production by resting cells of Aspergillus flavus Link", Microbiology, 61(1), pp 81-86 11 Beard Raimon L, Walton Gerald S (1969), "Kojic acid as an insecticidal mycotoxin", Journal of Invertebrate Pathology, 14(1), pp 53-59 12 Bentley Ronald (2006), "From miso, sake and shoyu to cosmetics: a century of science for kojic acid", Natural product reports, 23(6), pp 1046-1062 13 Bentley Ronald (1957), "Preparation and analysis of Kojic acid", pp 238-241 14 Brtko J, Rondahl L, et al (2004), "Kojic acid and its derivatives: history and present state of art", Central european journal of public health, 12(SUPP), pp S16-S17 15 Burdock George A, Soni Madhusudan G, et al (2001), "Evaluation of health aspects of kojic acid in food", Regulatory toxicology and pharmacology, 33(1), pp 80-101 16 Chaudhary Jignesh, Pathak AN, et al (2014), "Production technology and applications of kojic acid", Annual Research & Review in Biology, 4(21), pp 3165 17 Chen Jon S, Wei Cheng-i, et al (1991), "Inhibitory effect of kojic acid on some plant and crustacean polyphenol oxidases", Journal of Agricultural and food Chemistry, 39(8), pp 1396-1401 18 Clevström Gunnel, Ljunggren Hans (1985), "Aflatoxin formation and the dual phenomenon in Aspergillus flavus Link", Mycopathologia, 92(3), pp 129-139 19 Dobias J, Nemec P, et al (1977), "The inhibitory effect of kojic acid and its two derivatives on the development of Drosophila melanogaster [insecticidal effect]", Biologia 20 Dowd Patrick F (1988), "Toxicological and biochemical interactions of the fungal metabolites fusaric acid and kojic acid with xenobiotics in Heliothis zea (F.) and Spodoptera frugiperda (JE Smith)", Pesticide Biochemistry and Physiology, 32(2), pp 123-134 21 El-Aziz Amany B Abd (2013), "Improvement of kojic acid production by a mutant strain of Aspergillus flavus", Journal of Natural sciences Research, 3(4), pp 31-41 22 Eyong Kenneth O, Ambassa Pantaleon, et al (2012), "A new source of kojic acid isolated from Kingella africana: A possible precursor for quinine biosynthesis", Rasayan journal of chemistry, 5(4), pp 477-480 23 Futamura Takafumi, Okabe Mitsuyasu, et al (2001), "Improvement of production of Kojic acid by a mutant strain Aspergillus oryzae, MK107-39", Journal of bioscience and bioengineering, 91(3), pp 272-276 24 Garcia Alicia, Fulton James E (1996), "The combination of glycolic acid and hydroquinone or kojic acid for the treatment of melasma and related conditions", Dermatologic surgery, 22(5), pp 443-447 25 Hazzaa MM, Saad AM, et al (2013), "High Production of Kojic acid crystals by isolated Aspergillus oryzae var effuses NRC14", J Appl Sci Res, 9(3), pp 17141723 26 Hudecová D, Jantová S, et al (1996), "New azidometalkojates and their biological activity", Folia microbiologica, 41(6), pp 473-476 27 Ichimoto Itsuo, Fujii Kichitaro, et al (1965), "Studies on Kojic Acid and its Related γ-Pyrone Compounds: Part IX Synthesis of Maltol from Kojic Acid (Synthesis of Maltol (3))", Agricultural and Biological Chemistry, 29(4), pp 325-330 28 International Agency for Research on Cancer (2001), IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, IARC, Lyon France, pp 607-618 29 Kayahara Hiroshi, Shibata Norihisa, et al (1990), "Amino acid and peptide derivatives of kojic acid and their antifungal properties", Agricultural and Biological Chemistry, 54(9), pp 2441-2442 30 Kitada Makio, Ueyama Hideo, et al (1967), "Studies on Kojic Acid Fermentation:(I) Cultural Conditions in Submerged Culture", Journal of fermentation technology, 45(12), pp 1101-1107 31 Kotani Takashi, Ichimoto Itsuo, et al (1976), "Bacteriostatic activities and metal chelation of kojic acid analogs", Agricultural and Biological Chemistry, 40(4), pp 765-770 32 Kwak Moo Young, Rhee Joon Shick (1992), "Cultivation characteristics of immobilized Aspergillus oryzae for kojic acid production", Biotechnology and bioengineering, 39(9), pp 903-906 33 Lee HF, Boltjes B, et al (1950), "Kojic acid as an inhibitor of tubercle bacilli", American Review of Tuberculosis and Pulmonary Diseases, 61(5), pp 738-41 34 Lee Yong Sup, Park Jang Hyun, et al (2006), "Synthesis of tyrosinase inhibitory kojic acid derivative", Archiv der Pharmazie, 339(3), pp 111-114 35 Liljegren K, Svendsen A, et al (1988), "Mycotoxin and exoenzyme production by members of Aspergillus section flavi", JSM Mycotoxins, 1988(1Supplement), pp 35-36 36 Lim Joyce Teng Ee (1999), "Treatment of melasma using kojic acid in a gel containing hydroquinone and glycolic acid", Dermatologic surgery, 25(4), pp 282-284 37 Machida Masayuki, Asai Kiyoshi, et al (2005), "Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae", Nature, 438(7071), pp 1157 38 Mohamad Rosfarizan, Mohamed Mohd Shamzi, et al (2010), "Kojic acid: Applications and development of fermentation process for production", Biotechnology and Molecular Biology Reviews, 5(2), pp 24-37 39 Nakajima Nobuyoshi, Ishihara Kohji, et al (2001), "Functional glucosylation of kojic acid and daidzein with the Eucalyptus membrane-associated UDPglucosyltransferase reaction system", Journal of bioscience and bioengineering, 92(5), pp 469-471 40 Noh Jin-Mi, Kwak Seon-Yeong, et al (2009), "Kojic acid–amino acid conjugates as tyrosinase inhibitors", Bioorganic & medicinal chemistry letters, 19(19), pp 5586-5589 41 Novory L, Ruko P, et al (1999), "Kojic acid–a new leading molecule for a preparation of compounds with an anti-neoplastic potential", Neoplasma, 46, pp 42 Ogawa Akinori, Wakisaka Yasushi, et al (1995), "Production of kojic acid by membrane-surface liquid culture of Aspergillus oryzae NRRL484", Journal of fermentation and bioengineering, 80(1), pp 41-45 43 Rosfarizan Mohamad, Arbakariya Ariff, et al (2002), "Importance of carbon source feeding and pH control strategies for maximum kojic acid production from sago starch by Aspergillus flavus", Journal of bioscience and bioengineering, 94(2), pp 99-105 44 Saito K (1907), "Über die Säurebildung bei Aspergillus Oryzœ", Shokubutsugaku Zasshi, 21(240), pp 7-11 45 Saleh Rashad M, Kabli Saleh A, et al (2011), "Screening and production of antibacterial compound from Trichoderma spp against human-pathogenic bacteria", African Journal of Microbiology Research, 5(13), pp 1619-1628 46 Saruno Rinjiro, Kato Fumio, et al (1979), "Kojic acid, a tyrosinase inhibitor from Aspergillus albus", Agricultural and Biological Chemistry, 43(6), pp 1337-1338 47 Son SM, Moon KD, et al (2001), "Inhibitory effects of various antibrowning agents on apple slices", Food Chemistry, 73(1), pp 23-30 48 Synytsya Andriy, Blafková Petra, et al (2008), "Conjugation of kojic acid with chitosan", Carbohydrate polymers, 72(1), pp 21-31 49 Takamizawa Kazuhiro, Nakashima Shinobu, et al (1996), "Optimization of kojic acid production rate using the Box-Wilson method", Journal of Fermentation and bioengineering, 82(4), pp 414-416 50 Wakisaka Yasushi, Segawa Takayuki, et al (1998), "Development of a cylindrical apparatus for membrane-surface liquid culture and production of kojic acid using Aspergillus oryzae NRRL484", Journal of fermentation and bioengineering, 85(5), pp 488-494 51 Wilson Benjamin J (1971), "Miscellaneous Aspergillus toxins", Microbes toxins, fungal toxins, pp 235-250 52 Yasunobu Terabayashi et al (2010), "Identification and characterization of genes responsible for biosynthesis of kojic acid, an industrially important compound from Aspergillus oryzae", Fungal Genetics and Biology, 47(12), pp 953-961 PHỤ LỤC Phụ lục Hình thái sinh khối Aspergillus oryzae sau 14 ngày ni cấy (b) (a) Phụ lục Hình ảnh dịch nuôi cấy Aspergillus oryzae trước (a) sau (b) phản ứng với sắt (III) clorid 3% Phụ lục Hình ảnh phản ứng acid kojic (hịa tan ethanol) với sắt (III) clorid 3% Phụ lục Kết phổ ESI - MS (+) Phụ lục Kết phổ ESI - MS (-) Phụ lục Bảng xác định đường theo phương pháp Schoorl- Regenbogen Tiêu thụ Na2S2O3 Glucose Tiêu thụ Na2S2O3 Glucose 0,1N (ml) 0,1N (ml) (mg) (mg) 3,2 13 42,4 3,1 6,3 3,4 14 45,8 3,1 9,4 3,5 15 49,3 3,2 12,6 3,5 16 52,8 3,3 15,9 3,5 17 56,3 3,3 19,2 3,5 18 59,8 3,2 22,4 3,5 19 63,3 3,2 25,6 3,6 20 66,9 3,3 28,9 3,8 21 70,7 3,4 10 32,3 3,8 22 74,5 3,4 11 35,7 4,0 23 78,5 3,4 12 39,0 4,1 24 82,6 3,4 4,0 25 86,6 Phụ lục Hình ảnh phổ IR acid kojic chiết từ mơi trường ni cấy Phụ lục Hình ảnh phổ IR acid kojic nguyên liệu ...BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HUYỀN Mà SINH VIÊN: 1301193 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH ACID KOJIC CỦA NẤM MỐC Aspergillus oryzae KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS... cứu sản xuất acid kojic, đề tài ? ?Khảo sát khả sinh acid kojic nấm mốc Aspergillus oryzae? ?? tiến hành với mục tiêu sau: - Định tính chiết tách acid kojic từ dịch ni cấy Aspergillus oryzae - Lựa... kết luận sản phẩm kết tinh thu từ dịch nuôi cấy Aspergillus oryzae acid kojic hay Aspergillus oryzae có khả sinh acid kojic q trình ni cấy Tóm lại, Aspergillus oryzae có khả sinh tổng hợp acid kojic