Khảo sát ảnh hưởng của một số tá dược lên khả năng sống sót của l acidophilus trong quá trình tạo chế phẩm probiotic giọt uống khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI PHƯƠNG THU KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ TÁ DƯỢC LÊN KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA L.acidophilus TRONG QUÁ TRÌNH TẠO CHẾ PHẨM PROBIOTIC GIỌT UỐNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI PHƯƠNG THU Mã sinh viên: 1801664 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ TÁ DƯỢC LÊN KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA L.acidophilus TRONG Q TRÌNH TẠO CHẾ PHẨM PROBIOTIC GIỌT UỐNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Lê Ngọc Khánh ThS Kiều Thị Hồng Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghệ sinh học Dược Khoa Công nghệ sinh học HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội, người bảo truyền đạt cho em kiến thức quý báu suốt năm học tập rèn luyện trường Em xin chân thành cảm ơn thầy cô chị kỹ thuật viên môn Công nghệ sinh học Dược ln tạo điều kiện thuận lợi tận tình hướng dẫn em trình nghiên cứu, học tập Em xin chân thành cảm ơn ThS Lê Ngọc Khánh ThS Kiều Thị Hồng bảo tận tình giúp em định hướng từ ngày suốt trình thực nghiên cứu Những lời khuyên quý giá, quan tâm động viên thầy dành cho em gặp khó khăn, vướng mắc tiếp thêm động lực giúp em hồn thành khóa luận Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Đàm Thanh Xuân TS Nguyễn Khắc Tiệp, người thầy cô đầy tâm huyết truyền cảm hứng khích lệ em suốt q trình thực khóa luận Thầy ln theo sát, hỗ trợ giúp em hình thành lối tư nghiên cứu để em tự tin đường nghiên cứu khoa học Để hồn thành khóa luận em nhận nhiều giúp đỡ từ chị, bạn em phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học Dược Cảm ơn người nhiều ln sát cánh, đồng hành, cho lời khun động viên q giá, giúp có qng thời gian vui vẻ đáng nhớ đời Cuối cùng, em xin cảm ơn bố mẹ, người thân gia đình người bạn đặc biệt bên cạnh động viên em thời điểm khó khăn nhất, ln điểm tựa vững cho em suốt chặng đường Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Mai Phương Thu MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1.Đại cương probiotic 1.1.1 Khái niệm probiotic 1.1.2 Các chủng probiotic 1.1.3 Tác dụng chế tác dụng probiotic 1.2.Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 1.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, điều kiện ni cấy 1.2.2 Tác dụng Lactobacillus acidophilus với sức khỏe 1.3.Chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu 1.3.1 Sơ lược chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu 1.3.2 Thành phần hỗn dịch dầu chứa probiotic 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định vật lý hỗn dịch dầu chứa probiotic 10 1.3.4 Yêu cầu chất lượng chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu 11 1.3.5 Một số nghiên cứu nước quốc tế chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu 12 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 13 2.1.1 Nguyên liệu hóa chất 13 2.1.2 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 14 2.1.3 Môi trường 14 2.1.4 Dung dịch sử dụng nghiên cứu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1 Đánh giá ảnh hưởng số tá dược đến khả sống sót L acidophilus 15 2.2.2 Khảo sát hàm lượng tá dược gây phân tán ảnh hưởng đến độ ổn định vật lý hỗn dịch dầu chứa VSV 15 2.2.3 Đánh giá số tiêu chất lượng số công thức hỗn dịch dầu 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn dụng cụ, môi trường 15 2.3.2 Phương pháp tạo chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu 16 2.3.3 Phương pháp pha loãng liên tục định lượng VSV chế phẩm 16 2.3.4 Phương pháp đánh giá kích thước tiểu phân hỗn dịch 17 2.3.5 Phương pháp đánh giá độ lắng hỗn dịch 18 CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 Đánh giá ảnh hưởng số tá dược đến khả sống sót L acidophilus 19 3.1.1 Đánh giá ảnh hưởng số loại dầu đến tỷ lệ sống sót VSV 19 3.1.2 Đánh giá ảnh hưởng số tá dược gây phân tán đến tỷ lệ sống sót VSV 23 3.2 Khảo sát hàm lượng tá dược gây phân tán ảnh hưởng đến độ ổn định vật lý hỗn dịch dầu chứa VSV 26 3.3 Đánh giá số tiêu chất lượng chế phẩm hỗn dịch dầu bào chế 30 3.3.1 Đánh giá khả phân tán VSV hỗn dịch dầu 30 3.3.2 Khảo sát kích thước phân bố tiểu phân VSV hỗn dịch 31 3.3.3 Khảo sát số lượng VSV sống sót q trình bảo quản 34 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 4.1 Kết luận 37 4.2 Đề xuất 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT CFU (Colony - Forming Units) Số đơn vị khuẩn lạc EPS (Exopolysaccharide) Polysacarid ngoại bào FAO (Food and Agriculture Organization) Tổ chức nông lương giới GRAS (Generally recognized as safe) Được công nhận chung an tồn IBS (Irritable bowel syndrome) Hội chứng ruột kích thích ISAPP (International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics) Hiệp hội Khoa học Quốc tế Probiotics Prebiotics KTTP Kích thước tiểu phân LAB (Lactic acid bacteria) Nhóm vi khuẩn lactic L acidophilus Lactobacillus acidophilus LDL (Low density lipoprotein) Lipoprotein tỷ trọng thấp MCT (Medium chain triglycerides) Chuỗi triglycerid trung bình MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) Mơi trường MRS PBS (Phosphate buffered saline) Dung dịch đệm phosphat SD (Standard deviation) Độ lệch chuẩn TCCS Tiêu chuẩn sở TCNSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất TKHH Tinh khiết hóa học WHO (World Health Organization) Tổ chức Y tế giới VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên Trang Bảng 1.1 Một số vi sinh vật phổ biến sử dụng làm probiotic Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 13 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 2.3 Dụng cụ sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 2.4 Môi trường nuôi cấy sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 3.1 Số lượng VSV sống sót số loại dầu tiệt khuẩn UV sau thời điểm 0, 30, 60 ngày 20 Bảng 3.2 Số lượng VSV sống sót số loại dầu tiệt khuẩn nhiệt sau thời điểm 0, 30, 60 ngày 21 Bảng 3.3 Số lượng VSV sống sót tiếp xúc với số tá dược nhiệt độ 0-5°C sau 30 60 ngày 25 Bảng 3.4 Các công thức sử dụng nghiên cứu 27 Bảng 3.5 Kết đo độ lắng theo thời gian mẫu hỗn dịch 27 Bảng 3.6 KTTP trung bình số mẫu hỗn dịch dầu 34 Bảng 3.7 Số lượng VSV sống sót số mẫu hỗn dịch sau 30 ngày (log CFU/liều) 35 Bảng 3.8 Công thức tối ưu khóa luận đề xuất 36 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ STT Tên Trang Hình 1.1 Sơ đồ minh họa chế tác dụng probiotic Hình 1.2 Hình ảnh Lactobacillus acidophilus kính hiển vi điện tử Hình 1.3 Sản phẩm men vi sinh Enterogermina Hình 1.4 Sản phẩm men vi sinh Novofido Drops Hình 1.5 Cấu trúc hóa học Aerosil Hình 1.6 Cấu trúc hóa học Nhơm monostearat 10 Hình 1.7 Cấu trúc hóa học Nhơm tristearat 10 Hình 2.1 Hình minh họa hỗn dịch lắng xuống 18 Hình 3.1 Biểu đồ thể số lượng VSV sống sót số loại dầu tiệt khuẩn UV sau thời điểm 0, 30, 60 ngày 20 Hình 3.2 Biểu đồ thể số lượng VSV sống sót số loại dầu tiệt khuẩn nhiệt sau thời điểm 0, 30, 60 ngày 21 Hình 3.3 Biểu đồ thể số lượng VSV sống sót tiếp xúc với số tá dược nhiệt độ 0-5°C sau thời điểm ban đầu, 30 ngày 60 ngày 25 Hình 3.4 Hình ảnh độ lắng số mẫu hỗn dịch dầu sau ngày 30 ngày 28 Hình 3.5 Hình ảnh mẫu hỗn dịch dầu sau để yên phút 31 Hình 3.6 Hình ảnh số mẫu hỗn dịch dầu vật kính 10x 32 Hình 3.7 Đồ thị biểu thị phân bố KTTP số mẫu hỗn dịch dầu 33 Hình 3.8 Biểu đồ thể số lượng VSV sống sót trong số mẫu hỗn dịch 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đóng vai trị phức tạp quan trọng phát triển hệ miễn dịch chức tiêu hóa người, đặc biệt đối tượng trẻ em [37] Probiotic chứa vi sinh vật, hầu hết vi khuẩn tương tự vi khuẩn có lợi ruột người góp phần quan trọng việc trì trạng thái cân hệ vi sinh đường tiêu hóa [67] Do việc sử dụng probiotic mang lại lợi ích to lớn ngăn ngừa bệnh đường ruột ngày phổ biến thị trường Probiotic định nghĩa “những vi sinh vật sống, mà đưa vào thể với số lượng đủ lớn mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ” [30] Do vậy, khả sống sót yêu cầu then chốt chế phẩm chứa probiotic Hiện có nhiều dạng bào chế phát triển giúp bảo vệ probiotic tác động môi trường (nhiệt độ, độ ẩm, pH, oxy khơng khí,…) viên nén, viên nang, vi nang,…[15] Trong đó, chế phẩm dạng lỏng hỗn dịch dầu quan tâm chúng phù hợp cho trẻ sơ sinh trẻ nhỏ Tuy nhiên có báo khoa học giới Việt Nam công bố liên quan đến chế phẩm nên việc nghiên cứu xây dựng công thức quy trình bào chế cần thiết để đảm bảo độ ổn định khả đưa đủ tế bào sống tới đích Chính vậy, để góp phần phát triển chế phẩm probiotic dạng lỏng Việt Nam, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng số tá dược lên khả sống sót L.acidophilus trình tạo chế phẩm probiotic giọt uống” thực với mục tiêu cụ thể sau: Khảo sát ảnh hưởng số tá dược đến khả sống sót độ ổn định vật lý Lactobacillus acidophilus chế phẩm probiotic giọt uống Đánh giá số tiêu chất lượng chế phẩm hỗn dịch dầu chứa Lactobacillus acidophilus bào chế CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Đại cương probiotic 1.1.1 Khái niệm probiotic Thuật ngữ “probiotic” kết hợp hai từ Hy Lạp “pro” “bios”, có nghĩa “vì sống” Thuật ngữ sử dụng lần vào năm 1965 Lilly Stillwell để mô tả chất tiết sinh vật kích thích phát triển vi sinh vật khác [41] Năm 1974, Parker sửa đổi thuật ngữ “probiotic” thành “các sinh vật chất góp phần cân hệ vi sinh đường ruột” [48] Năm 2001, tham vấn chuyên gia tổ chức bảo trợ Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO) Tổ chức Y tế giới (WHO) đề xuất định nghĩa probiotic, định nghĩa sau Hiệp hội Khoa học Quốc tế Probiotics Prebiotics (ISAPP) tinh chỉnh lại vào năm 2014 sau: “là vi sinh vật sống, mà đưa vào thể với số lượng đủ lớn mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ” [30] Thời gian gần có gia tăng mạnh mẽ số lượng sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ probiotic, nhu cầu tìm kiếm loại probiotic theo mà tăng cao Để xác định xem vi sinh vật tiềm có phải probiotic hay không cần dựa tiêu chuẩn sau [16], [31]: - Có nguồn gốc rõ ràng, chủng (VSV phải phân lập tới cấp chủng, có - định danh xác, lưu trữ ngân hàng giống quốc tế) Không gây bệnh cho vật chủ, khơng sinh độc tố, nằm nhóm GRAS, đánh giá an tồn khơng gây độc tính - Có đặc tính probiotic (VSV phải có khả sống sót qua hệ tiêu hóa, có khả phát triển đường ruột) Ngồi ra, probiotic phải chứng minh có lợi thử nghiệm lâm sàng người theo tiêu chuẩn khoa học chung - Ổn định bảo quản dễ dàng bảo quản (VSV phải tồn sản phẩm với liều lượng hiệu suốt thời hạn sử dụng) Để mang lại hiệu tối ưu sử dụng, chế phẩm probiotic phải đạt đủ liều lượng tối thiểu Các thử nghiệm lâm sàng thường thực với liều 106-1011 CFU/ngày Trong công nghiệp thực phẩm, liều thường dùng ngày 109 CFU, liều tối thiểu 106 CFU tùy thuộc vào chủng [64] 1.1.2 Các chủng probiotic Có nhiều loại vi sinh vật probiotic sử dụng, nghiên cứu nhiều chi Lactobacillus, Bifidobacterium Enterococcus Một số vi sinh vật phổ biến sử dụng làm probiotic trình bày Bảng 1.1 [25] ❖ Nhận xét Kết Bảng 3.5 cho thấy độ lắng tất mẫu nói chung tăng dần theo thời gian Với mẫu HD, độ lắng sau 30 ngày < 50%, đáng ý mẫu HD HD có độ lắng thấp (lần lượt 2,5% 5,0%) Nhận thấy tăng hàm lượng tá dược Nhôm monostearat từ 1% đến 1,75% Aerosil từ 0,5% đến 1,5%, độ lắng mẫu có xu hướng giảm dần, ngoại trừ mẫu HD (hàm lượng Aerosil 1,5%, Nhơm monostearat 1,75%) có độ lắng lớn hẳn (43,90%) Với mẫu ĐN, độ lắng sau 30 ngày < 60%, bật mẫu ĐN ĐN có độ lắng thấp (lần lượt 5,0% 7,5%) Khi tăng hàm lượng Nhôm monostearat từ 1% đến 1,5%, độ lắng mẫu có xu hướng giảm, nhiên tiếp tục tăng lên 1,75% độ lắng tăng mạnh (mẫu ĐN 7, ĐN 8, ĐN lắng khoảng 40-50%) So sánh độ lắng mẫu HD ĐN có hàm lượng tá dược sau 30 ngày, nhận thấy đa phần mẫu ĐN có độ lắng thấp hơn, ngoại trừ mẫu ĐN 7, ĐN 8, ĐN có độ lắng cao so với mẫu HD tương ứng ❖ Bàn luận Sự kết hợp loại tá dược Aerosil Nhơm monostearat góp phần hạn chế làm giảm tốc độ sa lắng, giúp hỗn dịch bền vững hơn, nhiên chúng khơng có tác dụng chống sa lắng hồn tồn Đây lý mức độ lắng chế phẩm tăng dần theo thời gian Mức độ lắng mẫu có chênh lệch giải thích dựa vào độ nhớt môi trường phân tán Cả Aerosil Nhôm momostearat có tác dụng làm tăng độ nhớt dầu, ngồi Nhơm monostearat cịn có khả tạo gel dày dầu giúp lưu giữ VSV lơ lửng môi trường phân tán Do tăng hàm lượng tá dược giúp giảm mức độ lắng VSV Kết phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Diệu Lý (2022) ảnh hưởng chất tạo gel lên trình tạo hỗn dịch chứa probiotic [7] Tuy nhiên tăng hàm lượng Nhôm monostearat lên 1,75%, độ lắng số mẫu tăng cao ví dụ mẫu ĐN 7, ĐN 8, ĐN 9, HD Điều giải thích nồng độ Nhơm monostearat cao khó phân tán vào mơi trường phân tán, kết hợp thêm Aerosil khó tạo gel dầu, không giữ VSV lơ lửng hỗn dịch làm tăng tốc độ sa lắng Đa số mẫu ĐN có độ lắng thấp so với mẫu HD có hàm lượng tá dược tương đương giải thích dầu đậu nành có tỷ trọng 922,7 kg/m3, cao so với dầu hướng dương 919,6 kg/m3 Tỷ trọng môi trường phân tán cao mức độ chênh lệch với tỷ trọng pha phân tán nhỏ, pha phân tán dễ lơ lửng ổn định, giảm tốc độ lắng đọng VSV 29 Kết thực nghiệm cho thấy với mẫu hỗn dịch chứa dầu hướng dương, hàm lượng tá dược cho thể chất ổn định là: 1-1,5% Aerosil 1,75% Nhôm monostearat (công thức HD HD 8); với mẫu hỗn dịch chứa dầu đậu nành, hàm lượng tá dược phù hợp là: 0,5% Aerosil 1,5% Nhôm monostearat 1,5% Aerosil 1,5% Nhôm monostearat (công thức ĐN ĐN 6) Thông qua kết mục 3.1 3.2, thấy cơng thức ĐN 4, ĐN 6, HD 7, HD cho độ ổn định vật lý tốt Ngoài ra, mẫu chứa dầu đậu nành có tiềm cải thiện tỷ lệ sống sót VSV so với cơng thức chứa dầu hướng dương 3.3 Đánh giá số tiêu chất lượng chế phẩm hỗn dịch dầu bào chế Chọn công thức ĐN 4, ĐN 6, HD 7, HD để tiến hành đánh giá sơ số tiêu như: khả phân tán VSV, kích thước tiểu phân hỗn dịch khả sống sót VSV qua thời gian bảo quản 3.3.1 Đánh giá khả phân tán VSV hỗn dịch dầu Theo Dược điển Việt Nam V, yêu cầu chất lượng chung hỗn dịch thuốc hỗn dịch để yên dược chất rắn phân tán tách riêng phải trở lại trạng thái phân tán đồng chất dẫn lắc nhẹ phút đến phút giữ nguyên trạng thái vài phút [3] Trong đề tài này, phân tán tiểu phân chế phẩm đánh giá thông qua trạng thái phân tán quan sát mắt thường sau lắc nhẹ mẫu phút ❖ Tiến hành Sử dụng mẫu ĐN 4, ĐN 6, HD 7, HD bào chế mục 3.2 Sau thời gian bảo quản, lắc nhẹ mẫu phút để yên phút Quan sát trạng thái phân tán mẫu ❖ Kết 30 Hình 3.5 Hình ảnh mẫu hỗn dịch dầu sau để yên phút ❖ Nhận xét Tất mẫu ĐN 4, ĐN 6, HD 7, HD dễ dàng phân tán sau lắc, khơng có thượng đóng bánh, vón cục giữ nguyên trạng thái đồng sau phút ❖ Bàn luận Tất công thức khảo sát đạt yêu cầu khả phân tán hỗn dịch nêu Dược điển Việt Nam V So sánh với kết nghiên cứu tác giả Lê Thị Phương Linh (2022) [6] nhận thấy công thức đề tài khơng có tượng lắng cặn có khả phân tán tốt có tỷ lệ MCT cao (70%) hàm lượng tá dược tương đương Ngun nhân giải thích khác biệt quy trình bào chế: nghiên cứu thực phân tán VSV vào MCT trước thêm loại dầu khác, nghiên cứu trước phân tán VSV vào hỗn hợp dầu Theo Shao Weiliang cộng (2016) [56], MCT có khả lan rộng thấm ướt bề mặt VSV đồng thời tạo lớp vỏ solvat hóa góp phần giảm sức căng bề mặt pha phân tán, sau thêm loại dầu khác vào làm tăng độ ổn định hỗn dịch Từ cho thấy phương pháp bào chế đề tài có tiềm việc cải thiện khả phân tán độ ổn định vật lý hỗn dịch dầu chứa probiotic 3.3.2 Khảo sát kích thước phân bố tiểu phân VSV hỗn dịch Kích thước tiểu phân VSV hỗn dịch yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến độ ổn định vật lý chế phẩm Kích thước tiểu phân (KTTP) lớn, tốc độ tách VSV khỏi môi trường phân tán nhanh, hỗn dịch dễ bị sa lắng đóng bánh Để đánh giá ảnh hưởng loại dầu, hàm lượng tá dược nguyên liệu đến KTTP vi sinh vật hỗn dịch, đề tài thực khảo sát mẫu ĐN 4, ĐN 6, HD 7, HD chế phẩm Kids Smart Drops lưu hành thị trường 31 ❖ Tiến hành Chuẩn bị mẫu ĐN 4, ĐN 6, HD 7, HD Kids Smart Drops Lắc nhẹ mẫu phút, hút 30L dịch vị trí cách bề mặt thoáng hỗn dịch 2cm tiến hành đánh giá kích thước phân bố tiểu phân VSV mẫu theo phương pháp ghi mục 2.3.4 ❖ Kết Hình 3.6 Hình ảnh số mẫu hỗn dịch dầu vật kính 10x Chú thích: a) Mẫu ĐN d) Mẫu HD b) Mẫu ĐN c) Mẫu HD e) Mẫu Mẫu Kids Smart Drops 32 a) Mẫu ĐN b) Mẫu ĐN c) Mẫu HD d) Mẫu HD e) Mẫu Kids Smart Drops Hình 3.7 Đồ thị biểu thị phân bố KTTP số mẫu hỗn dịch dầu 33 Bảng 3.6 KTTP trung bình số mẫu hỗn dịch dầu Mẫu Kích thước tiểu phân trung bình (m) ĐN (x̅ ± SD) 104,86 ± 43,37 ĐN 136,22 ± 55,30 HD 101,31 ± 46,55 HD 120,21 ± 56,49 Kids Smart Drops 55,56 ± 29,78 ❖ Nhận xét Kết Hình 3.7 Bảng 3.6 cho thấy, KTTP VSV mẫu ĐN 4, ĐN 6, HD HD gần tương tự tuân theo phân phối chuẩn (Sig > 0,05), với giá trị trung bình 104,86 ± 43,37 m, 136,22 ± 55,30 m, 101,31 ± 46,55 m 120,21 ± 56,49 m Với mẫu Kids Smart Drops, giá trị KTTP trung bình 55,56 ± 29,78 m, nhỏ nhiều so với mẫu bào chế Tuy nhiên phân bố KTTP mẫu lại không tuân theo phân phối chuẩn (Sig < 0,05) ❖ Bàn luận Sự khác biệt phân bố KTTP mẫu Kids Smart Drops so với mẫu bào chế đề tài giải thích KTTP nguyên liệu đầu vào Chế phẩm Kids Smart Drops sử dụng lợi khuẩn Bifidobacterium animalis, chế phẩm đề tài sử dụng lợi khuẩn L acidophilus Mặc dù kích thước loại vi khuẩn khơng có khác biệt lớn (khoảng vài m), nhiên kích thước ngun liệu đầu vào cịn ảnh hưởng nhiều yếu tố khác kĩ thuật sản xuất (đông khô, phun sấy, ), tá dược, tạp chất,… Nguyên liệu khác dẫn đến KTTP mẫu khác Các chế phẩm đề tài có KTTP phân bố theo phân phối chuẩn khơng có nhiều khác biệt mẫu Nói chung, việc sử dụng dung môi dầu hàm lượng tá dược khác gần không ảnh hưởng đến KTTP VSV hỗn dịch Tuy nhiên giá trị kích thước trung bình mẫu cịn lớn so với chế phẩm lưu hành thị trường Vì để cải thiện độ ổn định vật lý chế phẩm cần tìm phương pháp giảm KTTP tìm nguồn nguyên liệu phù hợp 3.3.3 Khảo sát số lượng VSV sống sót q trình bảo quản Để chế phẩm probiotic đạt hiệu với sức khỏe người, số lượng VSV sống chứa đơn vị liều phải trì ổn định trình bảo quản sử dụng Vì vậy, đề tài thực theo dõi số lượng VSV sống sót chế phẩm probiotic giọt uống sau 30 ngày bảo quản nhiệt độ phòng 34 ❖ Tiến hành Bào chế số mẫu HD 7, HD 8, ĐN ĐN theo công thức nêu mục 3.2 Bảo quản mẫu ống nghiệm đế có nắp, xếp vào chỗ tối nhiệt độ phịng Tiến hành xác định số lượng VSV sống sót sau thời điểm 30 ngày sau bào chế theo phương pháp ghi mục 2.3.3 ❖ Kết Căn vào số lượng VSV nguyên liệu ban đầu hàm lượng VSV công thức, số lượng VSV ban đầu liều chế phẩm (0,25 ml) theo tính tốn 2,36108 CFU, tương đương với log CFU/liều = 8,37 Bảng 3.7 Số lượng VSV sống sót số mẫu hỗn dịch sau 30 ngày (log CFU/liều) Mẫu HD HD ĐN ĐN 6,70 6,70 7,00 7,00 6,81 6,48 7,02 7,16 6,71 6,57 6,88 7,01 Trung bình 6,74  0,06 6,58  0,11 6,97  0,08 7,06  0,09 Lần Số lượng VSV (logCFU/liều) 8,5 8,37 8,37 8,37 8,37 7,5 6,97 6,5 6,74 7,06 6,57 5,5 HD ĐN HD ngày ĐN 30 ngày Hình 3.8 Biểu đồ thể số lượng VSV sống sót trong mẫu HD 7, HD 8, ĐN 4, ĐN 35 ❖ Nhận xét Từ kết Bảng 3.7 Hình 3.8 cho thấy sau 30 ngày, số lượng VSV sống sót mẫu hỗn dịch bào chế giảm rõ rệt Cụ thể với mẫu HD giảm 42,66 lần, mẫu HD giảm 63,10 lần, mẫu ĐN giảm 25,12 lần, mẫu ĐN giảm 20,42 lần Các mẫu ĐN có số lượng VSV sống sót khoảng log CFU/liều, cao so với mẫu HD (khoảng 6,6 log CFU/liều) ❖ Bàn luận Sau 30 ngày, chế phẩm đạt yêu cầu tối thiểu số lượng VSV cịn sống cơng thức (6 log CFU/liều) So sánh với nghiên cứu Nguyễn Diệu Lý (2022) [7] Lê Thị Phương Linh (2022) [6], nhận thấy có tương đồng số lượng VSV sống sót sau tháng (còn khoảng – log CFU/liều) Số lượng VSV sống cịn có xu hướng giảm thêm q trình bảo quản, cần thêm nghiên cứu để cải thiện khả sống sót VSV dầu Kết định lượng VSV sống mẫu ĐN cao so với mẫu DH phù hợp với kết luận đưa mục 3.1.1, cho thấy mơi trường dầu có sử dụng dầu đậu nành cho tính ổn định VSV tốt so với dầu hướng dương Từ kết trình bày trên, đề tài đề xuất cơng thức tối ưu phù hợp với tiêu đánh giá công thức ĐN ĐN 6: Bảng 3.8 Cơng thức tối ưu khóa luận đề xuất Thành phần ĐN ĐN Bột đông khô chứa Lactobacillus acidophilus (g) 2 Aerosil (g) 0,5 1,5 Nhôm monostearat (g) 1,5 1,5 Dầu đậu nành (ml) 30 30 MCT (ml) 70 70 36 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Từ kết thí nghiệm, đề tài đưa kết luận sau: Đã khảo sát ảnh hưởng số tá dược đến khả sống sót độ ổn định vật lý Lactobacillus acidophilus chế phẩm probiotic giọt uống ✓ Lựa chọn phương pháp gia nhiệt để tiệt khuẩn dầu nhận thấy dầu đậu nành cho tỷ lệ sống sót VSV cao so với dầu hướng dương, dầu gạo lứt MCT ✓ Lựa chọn phối hợp tá dược Aerosil Nhôm monostearat để cải thiện khả sống sót VSV tạo hỗn dịch dầu đạt độ ổn định vật lý với hàm lượng sau: o Công thức chứa dầu hướng dương: HD HD o Công thức chứa dầu đậu nành: ĐN ĐN Đánh giá số tiêu chất lượng chế phẩm hỗn dịch dầu chứa Lactobacillus acidophilus bào chế ✓ Về khả phân tán: công thức HD 7, HD 8, ĐN 4, ĐN đạt yêu cầu khả phân tán ✓ Về kích thước phân bố tiểu phân: KTTP công thức ĐN 4, ĐN HD 7, HD gần tương tự ( khoảng 100 - 120m) tương đối lớn so với chế phẩm Kids Smart Drops ✓ Về khả sống sót VSV: Sau 30 ngày, mẫu đạt đạt yêu cầu tối thiểu số lượng VSV sống ( 6-7 log CFU/liều) Các cơng thức chứa dầu đậu nành có số lượng VSV sống cao so với công thức chứa dầu hướng dương ✓ Lựa chọn công thức hỗn dịch tối ưu nhất: ĐN ĐN 4.2 Đề xuất Đề tài xin đề xuất số hướng phát triển nghiên cứu sau: ✓ Nghiên cứu biện pháp làm tăng khả sống sót Lactobacillus acidophilus hỗn dịch dầu bổ sung chất chống oxy hóa, cải tiến quy trình bào chế để chế phẩm hạn chế tiếp xúc với khơng khí ✓ Khảo sát ảnh hưởng nguyên liệu (đông khô, vi nang hóa, phun sấy) đến khả sống sót độ ổn định vật lý VSV hỗn dịch dầu 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Thị Vân Anh (2022), Khảo sát số thông số phương pháp đánh giá khả sống sót Lactobacillus acidophilus chế phẩm probiotic dạng dầu, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội (2020), Bào chế sinh dược học 1, Nhà xuất Y học, pp 172-182 Bộ Y tế (2017), Dược Điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2013), Kỹ thuật bào chế sinh học dược dạng thuốc - Tập 1, Nhà xuất Y học, Hà Nội, pp 273-286 Nguyễn Thị Hoa (2021), Đánh giá khả sống sót Lactobacillus acidophilus dầu, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Lê Thị Phương Linh (2022), Khảo sát ảnh hưởng số loại dầu lên trình tạo chế phẩm probiotic chứa Lactobacillus acidophilus, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Diệu Lý (2022), Khảo sát ảnh hưởng chất tạo gel lên trình tạo hỗn dịch probiotic chứa Lactobacillus acidophilus cho trẻ em, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội Trung tâm Thông tin Khoa học Công nghệ TP HCM (2015), "Xu hướng nghiên cứu ứng dụng chủng lợi khuẩn Probiotic Y học thực phẩm chức năng", Sở Khoa học Công nghệ TP-HCM Tài liệu Tiếng Anh Altermann E., Russell W M., et al (2005), "Complete genome sequence of the probiotic lactic acid bacterium Lactobacillus acidophilus NCFM", Proceedings of National Academy of Sciences USA, 102(11), pp 3906-12 10 American Oil Chemists' Society (2011), "Smoke, Flash and Fire Points Cleveland Open Cup Method", Official methods and recommended practices of the AOCS, ( 9a-48) 11 Amirreza Khalighi, Reza Behdani, et al (2016), "Probiotics: A Comprehensive Review of Their Classification, Mode of Action and Role in Human Nutrition", Probiotics and Prebiotics in Human Nutrition and Health, Venketeshwer Rao,Leticia G Rao, IntechOpen, Rijeka, pp Ch 12 Ana M P Gomes., Malcata F Xavier (1999), "Bifidobacterium spp and Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics", Trends in Food Science & Technology, 10(4), pp 139-157 13 Auke de Vries, Gomez Yuly Lopez, et al (2017), "The effect of oil type on network formation by protein aggregates into oleogels", RSC Advances, 7(19), pp 11803-11812 14 Bai Long, Lv Shanshan, et al (2019), "Oil-in-water Pickering emulsions via microfluidization with cellulose nanocrystals: Formation and stability", Food Hydrocolloids, 96 15 Baral K C., Bajracharya R., et al (2021), "Advancements in the Pharmaceutical Applications of Probiotics: Dosage Forms and Formulation Technology", International Journal of Nanomedicine, 16, pp 7535-7556 16 Binda S., Hill C., et al (2020), "Criteria to Qualify Microorganisms as "Probiotic" in Foods and Dietary Supplements", Frontiers in Microbiology, 11, pp 1662 17 Boateng L., Ansong R., et al (2016), "Coconut oil and palm oil's role in nutrition, health and national development: A review", Ghana Medical Journal, 50(3), pp 189196 18 Bull Matthew, Plummer Sue, et al (2013), "The life history of Lactobacillus acidophilus as a probiotic: a tale of revisionary taxonomy, misidentification and commercial success", FEMS Microbiology Letters, 349(2), pp 77-87 19 Chen Yingyang., Li Peijuan., et al (2015), Lactobacillus reuteri drops and method for preparing same, Google Patents 20 Choudhary Monika, Grover Kiran (2013), "Quality Evaluation of Blended Rice bran and Mustard oil", Journal of Krishi Vigyan, 2, pp 45-51 21 Diamante Lemuel M., Lan Tianying (2014), "Absolute Viscosities of Vegetable Oils at Different Temperatures and Shear Rate Range of 64.5 to 4835 s-1", Journal of Food Processing, 2014, pp 234583 22 El-Deeb N M., Yassin A M., et al (2018), "A novel purified Lactobacillus acidophilus 20079 exopolysaccharide, LA-EPS-20079, molecularly regulates both apoptotic and NF-kappaB inflammatory pathways in human colon cancer", Microbial Cell Factories, 17(1), pp 29 23 El Khatib Salwa A., Hanafi Samia A., et al (2018), "Hydrotreating rice bran oil for biofuel production", Egyptian Journal of Petroleum, 27(4), pp 1325-1331 24 Gao H., Li X., et al (2022), "The Functional Roles of Lactobacillus acidophilus in Different Physiological and Pathological Processes", Journal of Microbiology and Biotechnology, 32(10), pp 1226-1233 25 Georgieva M, Andonova L, et al (2014), "Probiotics–Health benefits, classification, quality assurance and quality control–Review", 61(4), pp 22-31 26 Goldin B R., Gorbach S L (1984), "The effect of milk and lactobacillus feeding on human intestinal bacterial enzyme activity", The American Journal of Clinical Nutrition, 39(5), pp 756-61 27 Gian Paolo Strozzi., Luca Mogna (2010), Oily suspension containing probiotic bacteria for paediatric uses, Google Patents 28 Hamenu Louis, Lee Young-Gi, et al (2013), "Suppression of Aluminum Corrosion in Lithium Bis(trifluoromethanesulfonyl)imide-based Electrolytes by the Addition of Fumed Silica", Bulletin of the Korean Chemical Society, 34 29 Harold G Garman (1957), Process for a stable oil suspension, Google Patents 30 Hill C., Guarner F., et al (2014), "Expert consensus document The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics consensus statement on the scope and appropriate use of the term probiotic", Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 11(8), pp 506-14 31 ISAPP (2018), "Minimum Criteria for Probiotics [Online]." 32 Jadhav H B., Annapure U S (2023), "Triglycerides of medium-chain fatty acids: a concise review", J Food Sci Technol, 60(8), pp 2143-2152 33 Jenifer A Heydinger, Dilip K Nakhasi (1996), "Medium chain triacylglycerols", Journal of Food Lipids, 3(4), pp 251-257 34 Jonathon T.B (1990), "Final Report of the Safety Assessment of Lithium Stearate, Aluminum Distearate, Aluminum Stearate, Aluminum Tristearate, Ammonium Stearate, Calcium Stearate, Magnesium Stearate, Potassium Stearate, Sodium Stearate, and Zinc Stearate", Journal of the American College of Toxicology, 1(2), pp 143-177 35 Kailasapathy K., Chin J (2000), "Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp", Immunology & Cell Biology, 78(1), pp 80-88 36 Kiepś Jakub, Dembczyński Radosław (2022), "Current Trends in the Production of Probiotic Formulations", Foods, 11(15), pp 2330 37 Kligler Benjamin, Hanaway Patrick, et al (2007), "Probiotics in Children", Pediatric Clinics of North America, 54(6), pp 949-967 38 Kozlowska M., Gruczynska E (2018), "Comparison of the oxidative stability of soybean and sunflower oils enriched with herbal plant extracts", Chemicke Zvesti, 72(10), pp 2607-2615 39 Khalesi S., Bellissimo N., et al (2019), "A review of probiotic supplementation in healthy adults: helpful or hype?", European Journal of Clinical Nutrition, 73(1), pp 24-37 40 Lee Yuan Kun, Salminen Seppo (2009), Handbook of probiotics and prebiotics, John Wiley & Sons 41 Lilly D M., Stillwell R H (1965), "Probiotics: Growth-Promoting Factors Produced by Microorganisms", Science, 147(3659), pp 747-8 42 Maria Remes Troche J., Coss Adame E., et al (2020), "Lactobacillus acidophilus LB: a useful pharmabiotic for the treatment of digestive disorders", Therapeutic Advances in Gastroenterology, 13, pp 1756284820971201 43 Maszewska M., Florowska A., et al (2018), "Oxidative Stability of Selected Edible Oils", Molecules, 23(7) 44 Michiels Jan, Maarten Fauvart (2016), "Bacterial Persistence: Methods and Protocols", pp 26 45 National Center for Biotechnology Information (2023), "PubChem Compound Summary for CID 12496, Aluminum stearate" 46 National Center for Biotechnology Information (2023), "PubChem Compound Summary for CID 16682987, Aluminum monostearate" 47 Oh J K., Kim Y R., et al (2021), "Prevention of Cholesterol Gallstone Formation by Lactobacillus acidophilus ATCC 43121 and Lactobacillus fermentum MF27 in Lithogenic Diet-Induced Mice", Food Science of Animal Resources, 41(2), pp 343-352 48 Parker R.B (1974), "Probiotics, the other half of the antibiotic story", Animal Nutrition and Health, 29, pp 4-8 49 Rani S., Joy M L., et al (2015), "Evaluation of physiochemical and tribological properties of rice bran oil – biodegradable and potential base stoke for industrial lubricants", Industrial Crops and Products, 65, pp 328-333 50 Rojas Edwin E Garcia, Coimbra Jane S R., et al (2013), "Thermophysical Properties of Cotton, Canola, Sunflower and Soybean Oils as a Function of Temperature", International Journal of Food Properties, 16(7), pp 1620-1629 51 Rowe R.C., Sheskey P.J., et al (2009), "Aluminum Monostearat", Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th ed, Pharmaceutical Press, pp 35-37 52 Rowe R.C., Sheskey P.J., et al (2009), "Colloidal Silicon Dioxide", Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th ed, Pharmaceutical Press, pp 185-188 53 Seema K Mody., Syed H NAQVI (2017), Stable probiotic suspensions, Google Patents 54 SeHyeok Kim, SungHwa Kim, et al (2022), "Evaluation of the effects of amphiphilic compounds on oxygen solubility in bulk oil", International Journal of Food Science & Technology, 57(9), pp 6082-6089 55 Shah Syed Nasrullah, Mahesar Sarfaraz Ahmed, et al (2018), "Influence of commercial refining on some quality attributes of sunflower oil", Ukrainian food journal, (7, Issue 2), pp 234-243 56 Shao Weiliang., Hang Xiaomin., et al (2016), Probiotic lipid suspension drop and preparation method thereof, Google Patents 57 Shi L H., Balakrishnan K., et al (2016), "Beneficial Properties of Probiotics", Tropical Life Sciences Research, 27(2), pp 73-90 58 Singh Asha, Sarma P (2010), "Removal of Arsenic(III) from Waste Water Using Lactobacillus acidophilus", Bioremediation Journal, 14, pp 92-97 59 Sreeja V, Prajapati Jashbhai B (2013), "Probiotic formulations: Application and status as pharmaceuticals—A review", Probiotics Antimicrobial Proteins, 5, pp 81-91 60 Sunde Erik P., Setlow Peter, et al (2009), "The physical state of water in bacterial spores", Proceedings of the National Academy of Sciences, 106(46), pp 19334-19339 61 Tong Wang (2011), "Soybean Oil", Vegetable Oils in Food Technology, Frank D Gunstone., Blackwell Publishing, pp 59-105 62 Totani N., Yawata M., et al (2013), "Oxygen Content and Oxidation in Frying Oil", Journal of Oleo Science, 62(12), pp 989-995 63 ĩỗok Gamze, Sert Durmu (2022), "Trial productions of freeze-dried Lactobacillus plantarum culture using dairy by-products as cryoprotectants: Viability and characterization of cultures", Food Bioscience, 46, pp 101541 64 Verma Mahima, Rout Pramod Kumar (2022), "Probiotics: Promising Opportunity for Future Functional Foods", Recent Advances in Food Biotechnology, Singapore, pp 75-96 65 Vygantas Kirejevas, Aram Kazarjan (2010), Probiotic oil suspension and use thereof, Google Patents 66 Watkins C., Murphy K., et al (2018), "The viability of probiotics in water, breast milk, and infant formula", European Journal of Pediatrics, 177(6), pp 867-870 67 Wilkins T., Sequoia J (2017), "Probiotics for Gastrointestinal Conditions: A Summary of the Evidence", American Family Physician, 96(3), pp 170-178 68 Zawistowski Jerzy, Kopeć Aneta (2022), "Chapter 13 - Effect of functional food ingredients on nutrient absorption and digestion", Nutrition and Functional Foods in Boosting Digestion, Metabolism and Immune Health, Bagchi Debasis,Ohia Sunny E., Academic Press, pp 173-189