Nghiên cứu quy trình chiết xuất và xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng của cao đậu đen khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NHƯ QUỲNH NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CAO ĐẬU ĐEN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NHƯ QUỲNH MÃ SINH VIÊN: 1801599 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CAO ĐẬU ĐEN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Hoàng Quỳnh Hoa DS Trần Ngọc Ánh Nơi thực hiện: Bộ môn Thực Vật HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ kính trọng lịng biết ơn tới TS Hồng Quỳnh Hoa – Trưởng môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội, người định hướng cho em ngày q trình giành nhiều thời gian, tâm huyết để hướng dẫn, bảo động viên em Em xin chân thành cảm ơn cho em nhận xét, góp ý để em hồn thiện khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Phạm Thị Linh Giang – Giảng viên môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội, người cho em góp ý, lời khuyên bổ ích giúp em giải vấn đề gặp phải trình nghiên cứu Em xin cảm ơn thầy cô, chị công tác môn Thực vật giúp đỡ em suốt trình Cảm ơn bạn Nguyễn Hà Phương, Bùi Thị Thúy, bạn nghiên cứu môn Thực vật đồng hành, động viên giúp đỡ suốt ngày tháng làm việc phịng thí nghiệm Em xin cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường, phịng ban tồn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho em thời gian qua Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè ln ủng hộ, động viên nguồn động lực to lớn để em học tập, rèn luyện nghiên cứu trường Đại học Dược Hà Nội Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thị Như Quỳnh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Đậu đen 1.1.1 Đặc điểm thực vật, sinh thái phân bố loài 1.1.2 Thành phần hóa học hạt Đậu đen 1.1.3 Tác dụng dược lý 1.1.4 Công dụng theo y học cổ truyền 1.2 Định lượng protein toàn phần theo phương pháp định lượng nitrogen từ hợp chất hữu 1.3 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất 1.4 Phương pháp điều chế cao đặc từ dược liệu yêu cầu chất lượng cao đặc 10 1.4.1 Định nghĩa cao thuốc từ dược liệu 10 1.4.2 Phương pháp điều chế cao đặc 10 1.4.3 Yêu cầu chất lượng cao thuốc 11 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .13 2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên liệu, thiết bị 13 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.1.2 Hóa chất, thiết bị phần mềm 13 2.2 Nội dung nghiên cứu .13 2.2.1 Nội dung 1: Thẩm định phương pháp định lượng protein toàn phần dược liệu Đậu đen 14 2.2.2 Nội dung 2: Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất cao từ hạt Đậu đen lựa chọn điều kiện chiết xuất 14 2.2.3 Nội dung 3: Khảo sát số tiêu chất lượng cao Đậu đen 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Phương pháp định lượng protein toàn phần .14 2.3.2 Phương pháp định lượng polyphenol toàn phần phương pháp Folin – Ciocalteu 15 2.3.3 Thẩm định phương pháp định lượng protein toàn phần 16 2.3.4 Phương pháp khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất 17 2.3.5 Phương pháp điều chế cao đặc Đậu đen 18 2.3.6 Phương pháp khảo sát số tiêu chất lượng cao Đậu đen 20 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Thẩm định phương pháp định lượng protein toàn phần dược liệu Đậu đen 21 3.2 Kết khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất 21 3.2.1 Khảo sát yếu tố chuẩn bị dược liệu 21 3.2.2 Khảo sát kích thước dược liệu 22 3.2.3 Khảo sát thời gian chiết xuất .23 3.2.4 Khảo sát tỉ lệ dược liệu/dung môi 24 3.2.5 Khảo sát pH dung môi chiết 25 3.2.6 Khảo sát số lần chiết 26 3.3 Kết lựa chọn điều kiện tối ưu cho q trình chiết xuất protein tồn phần từ Đậu đen 27 3.4 Kết điều chế cao đặc giàu protein toàn phần từ Đậu đen .28 3.4.1 Quy trình điều chế cao đặc giàu protein toàn phần từ Đậu đen 28 3.4.2 Kết .28 3.5 Một số tiêu chất lượng cao đặc giàu protein .29 3.5.1 Mô tả 29 3.5.2 Đo pH 29 3.5.3 Mất khối lượng làm khô .30 3.5.4 Định tính 30 3.5.5 Định lượng 32 3.6 Bàn luận .34 3.6.1 Về phương pháp chiết xuất protein toàn phần từ Đậu đen 34 3.6.2 Về nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết xuất protein tồn phần từ Đậu đen 34 3.6.3 Về kết trình chiết xuất protein toàn phần từ Đậu đen phương pháp tối ưu OFAT ứng dụng 36 3.6.4 Về thử tác dụng sinh học cao Đậu đen 37 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AOAC Hiệp hội nhà phân tích thống DC Dịch chiết OFAT Phương pháp thay đổi yếu tố (One factor at the time) KL Khối lượng RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) STT Số thứ tự TB Trung bình DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp định lượng protein 21 Bảng 3.2: Kết đánh giá độ lặp lại trình chiết theo điều kiện tối ưu 27 Bảng 3.3: Kết điều chế cao đặc Đậu đen 29 Bảng 3.4: Kết đo hàm ẩm cao đặc Đậu đen .30 Bảng 3.5: So sánh giá trị Rf hai sắc kí đồ 31 Bảng 3.6: Định lượng protein toàn phần cao đặc Đậu đen 32 Bảng 3.7: Nồng độ độ hấp thụ quang mẫu chuẩn axit gallic 32 Bảng 3.8: Kết định lượng polyphenol toàn phần cao Đậu đen .33 DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Ảnh chụp Đậu đen (Vigna unguiculata subsp cylindrica (L.) Verdc.) Hình 1.2: Bộ Kjeldahl sử dụng trình định lượng protein Hình 1.3: Phương pháp điều chế cao đặc 10 Hình 2.1: Quy trình chiết xuất cao đặc Đậu đen dự kiến 19 Hình 3.1: Kết khảo sát giai đoạn chuẩn bị dược liệu 22 Hình 3.2: Kết khảo sát kích thước dược liệu 23 Hình 3.3: Kết khảo sát thời gian chiết xuất 24 Hình 3.4: Kết khảo sát tỉ lệ dược liệu/dung môi .25 Hình 3.5: Kết khảo sát pH dung môi chiết 26 Hình 3.6: Kết định tính dịch chiết với thuốc thử Ninhydrin 26 Hình 3.7: Quy trình điều chế cao đặc giàu protein từ dược liệu Đậu đen .28 Hình 3.8: Ảnh cao đặc Đậu đen 29 Hình 3.9: Dung dịch cao đặc phản ứng với thuốc thử Ninhydrin 30 Hình 3.10: Kết sắc kí đồ dịch chiết cao Đậu đen .31 Hình 3.11: Phương trình đường chuẩn dung dịch chuẩn axit gallic .33 ĐẶT VẤN ĐỀ Đậu đen loại lương thực gần gũi quen thuộc với nhân dân ta Ngoài giá trị lớn dinh dưỡng, Đậu đen sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để làm thuốc chữa bệnh Theo y học cổ truyền, hạt Đậu đen sử dụng để trị phong nhiệt (phát sốt, sợ gió, nhức đầu ngực nóng khó chịu), thuốc bổ khí chữa thận gan hư yếu, thiếu máu, suy nhược [6] [3] Hạt Đậu đen rang dùng để chữa viêm dây thần kinh, ngủ, trí nhớ kém, ăn uống khơng tiêu, khó tiêu, chân tay có cảm giác kim châm, đánh trống ngực định kỳ, suy tim sung huyết [19] [48] Các nghiên cứu theo y học đại cho thấy hạt Đậu đen có tác dụng dược lý kháng khuẩn, kháng vi-rút, hạ lipid máu, hạ đường huyết, chống oxy hóa dược liệu tiềm điều trị số bệnh lý tim mạch, đái tháo đường [37] [48] Trong Đậu đen, protein nhóm hoạt chất quan trọng với nhiều tác dụng dược lý chống oxy hóa, hạ đường huyết, chống ung thư [37] [7] Hơn nữa, protein Đậu đen nghiên cứu có tác dụng bệnh tim mạch ức chế men chuyển, ức chế trình tổng hợp cholesterol [37] chúng có vai trị kiểm sốt bệnh đái tháo đường [8] Ngồi ra, protein Đậu đen chứng minh có hoạt tính kháng nấm kháng vi-rút [19] [47] Hiện nay, điều chế cao dược liệu với hàm lượng hoạt chất cao xu hướng phát triển dược phẩm Do đó, để ứng dụng dược liệu Đậu đen nhiều trình nghiên cứu phát triển chế phẩm chăm sóc sức khỏe, việc nghiên cứu bào chế cao bán thành phẩm giàu protein toàn phần từ Đậu đen cần thiết Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu quy trình chiết xuất xây dựng số tiêu chất lượng cao Đậu đen” thực với hai mục tiêu: Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng tối ưu hóa điều kiện chiết xuất protein toàn phần từ Đậu đen Bào chế xây dựng số tiêu chất lượng cao Đậu đen Nhận xét: Quan sát thấy sắc kí đồ dung dịch cao đặc có số vết màu sắc giống với vết dịch chiết Đậu đen, vết có Rf tương đương Do đó, thành phần protein cao Đậu đen giống với thành phần protein dược liệu dịch Đậu đen 3.5.5 Định lượng 3.5.5.1 Định lượng protein toàn phần cao đặc Đậu đen Kết định lượng thể bảng 3.6 Bảng 3.6: Định lượng protein toàn phần cao đặc Đậu đen STT KL dược liệu (g) KL cao điều chế (g) Hàm lượng protein toàn phần (%) 50,44 10,91 31,15 50,15 12,39 29,20 50,26 11,57 28,52 TB 29,62 SD 1,36 RSD (%) 4,6062 Nhận xét: Hàm lượng protein toàn phần cao 29,62 ± 1,36 % cao hàm lượng protein toàn phần dược liệu Đậu đen 22,87 ± 0,39% 3.5.5.2 Định lượng polyphenol toàn phần cao đặc Đậu đen Nồng độ độ hấp thụ quang chất chuẩn axit gallic thể bảng 3.7 Bảng 3.7: Nồng độ độ hấp thụ quang mẫu chuẩn axit gallic Mẫu Nồng độ axit gallic (µg/ml) 2,00 Độ hấp thụ quang (A) 0,164 4,00 0,273 6,00 0,414 8,00 0,537 10,00 0,609 Từ đó, xây dựng vẽ phương trình đường chuẩn dung chuẩn axit gallic Kết thể hình 3.11 32 0,7 y = 0,0577x + 0,0532 R² = 0,9904 Độ hấp thụ quang 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Nồng độ axit gallic (µg/ml) 10 12 Hình 3.11: Phương trình đường chuẩn dung dịch chuẩn axit gallic Phương trình đường chuẩn có R2 = 0,9904 > 0,99 đạt điều kiện AOAC [10] Phương trình tuyến tính thu được: y = 0,0577x + 0,0532 (1) Trong đó: y độ hấp thụ quang (A); x nồng độ axit gallic chuẩn (C) Sử dụng đường chuẩn để tính nồng độ axit gallic toàn phần cao Đậu đen Pha dung dịch thử trình bày mục 2.2 Đo quang điều kiện với dung dịch chuẩn, thu độ hấp thụ quang dung dịch thử A = 0,344 Thay vào phương trình (1), thu nồng độ axit gallic là: 5,0399 µg/ml Sử dụng cơng thức mục 2.2 để tính hàm lượng polyphenol tồn phần theo axit gliac cao Đậu đen F= 𝐶×𝑉 𝑚 ×(100−𝑑)×100 Kết thể bảng 3.8 Bảng 3.8: Kết định lượng polyphenol toàn phần cao Đậu đen Khối lượng cao (g) 1,0092 Thể tích (ml) 100 Phương trình đường chuẩn y = 0,0577x + 0,0532 Độ hấp thụ quang đo A = 0,344 Nồng độ axit gallic dung dịch thử 5,0399 µg/ml Hàm lượng polyphenol toàn phần cao Đậu đen (g/g) 0,0691 g/g Nhận xét: Hàm lượng polyphenol cao đặc Đậu đen chiết 0,0691 (g/g) 33 3.6 Bàn luận 3.6.1 Về phương pháp chiết xuất protein toàn phần từ Đậu đen Dung môi chiết xuất lựa chọn nước Đây dung môi phân cực sử dụng để chiết hợp chất phân cực protein Mặt khác, nước dung môi phổ biến nhất, có sẵn, giá thành rẻ, khơng độc Việc sử dụng dung mơi nước thường cần chiết nóng để tăng hiệu suất chiết rút ngắn thời gian chiết so với ngâm lạnh, phương pháp chiết lựa chọn nghiên cứu phương pháp hầm (đun cách thủy) ngâm nhiệt độ cao nhiệt độ phịng nhiệt độ sơi dung mơi để tăng hiệu suất, giảm lượng protein bị biến tính trình chiết giúp rút ngắn thời gian chiết 3.6.2 Về nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết xuất protein tồn phần từ Đậu đen Về kết nghiên số ảnh hưởng đến trình chiết xuất: Chuẩn bị dược liệu Sử dụng dược liệu rang có hiệu suất chiết cao đáng kể với dược liệu không rang Đậu đen có thành phần tinh bột lớn Tinh bột khơng tan nước lạnh, tan nước nóng có tượng hồ hóa Chính q trình chiết, tinh bột trương nở làm cản trở thấm dung môi vào dược liệu, chúng làm chậm tốc độ hịa tan khuếch tán hoạt chất, ngồi ra, chúng ảnh hưởng đến q trình lọc, làm khó lọc dịch chiết chứa tinh bột dễ bị biến chất, hỏng Do đó, q trình chiết, tinh bột cản trở khuếch tán protein ngồi dung mơi, làm giảm hiệu suất chiết protein Quá trình rang giúp phần số hợp chất có phân tử lớn bị bẻ gãy thành phân tử nhỏ hơn, giúp biến tính phần tinh bột, nên giảm bớt ảnh hưởng tinh bột tới hiệu suất chiết protein Tuy nhiên, rang nhiệt độ cao protein Đậu đen bị ảnh hưởng, cố định điều kiện rang bếp hồng ngoại 200W rang 40 phút Kích thước dược liệu Theo kết khảo sát, dược liệu có kích thước bột thơ cho hiệu suất chiết cao Dược liệu Đậu đen để nguyên hạt diện tích tiếp xúc dung mơi dược liệu nhất, dung mơi thấm ướt bề mặt tế bào dược liệu hơn, làm giảm hịa tan ly giải chất tế bào nên hiệu suất chiết thấp Đậu đen vỡ hạt nghiền thành bột thơ có hiệu suất cao đáng kể so với dược liệu để nguyên hạt, lại có hiệu suất chiết tương đương 28,14% 29,63% Khi chia nhỏ dược liệu giúp làm tăng diện tích tiếp xúc dung mơi dược liệu, giảm quãng đường khuếch tán tăng tỉ lệ tế bào bị phá vỡ, tăng tốc độ chiết xuất tăng hiệu suất chiết 34 Trong trình, sau trình chiết Đậu đen vỡ hạt bột thô Đậu đen đem lọc để lấy dịch lọc, nhận thấy dịch chiết bột thơ Đậu đen khó lọc có nhiều chất nhầy tinh bột bị giữ lại bơng Vì thế, việc làm nhỏ kích thước dược liệu Đậu đen làm cho dịch chiết lẫn nhiều tạp tinh bột nên chúng gây ảnh hưởng trình chiết trình lọc, khơng lựa chọn khảo sát kích thước nhỏ Tuy nhiên, ưu điểm làm nhỏ dược liệu giúp tăng hiệu suất với dược liệu nghiền thành bột thơ Vì vậy, dược liệu nghiền thành bột thô để sử dụng chiết tối ưu cao giàu hoạt chất Thời gian chiết xuất Thông thường, hoạt chất cần thời gian để khuếch tán từ dược liệu môi trường Khi đạt cân chiết (hàm lượng hoạt chất dược liệu cân với mơi trường), q trình khuếch tán dừng lại Lúc hiệu suất chiết cao Ngoài ra, hoạt chất thường có khối lượng phân tử nhỏ tạp chất nên khuếch tán nhanh đạt cân chiết sớm Nên thời gian chiết lâu, hàm lượng hoạt chất chiết không tăng mà tăng tỉ lệ tạp chất, gây ảnh hưởng đến chất lượng dịch chiết hiệu suất chiết Trong trình chiết, nhận thấy thời gian chiết lâu, dịch chiết có độ nhớt tăng cao tinh bột bị hồ hóa nhiều Vì thế, thời gian chiết lâu lại làm tăng ảnh hưởng tinh bột đến trình chiết, q trình lọc, hoạt chất bị giữ lại bị cản trở chất nhầy tinh bột Kết cho thấy, thời gian chiết xuất cho hiệu suất protein toàn phần cao nhất, kéo dài thời gian chiết hiệu suất chiết giảm, phù hợp với lý thuyết Tỉ lệ dược liệu/dung môi Khi tăng tỉ lệ dược liệu/dung mơi lượng hoạt chất hịa tan tăng, từ làm tăng hiệu suất chiết Tuy nhiên, dùng nhiều dung môi chiết, dịch chiết lỗng dẫn đến khó thu sản phẩm, tốn dung mơi thời gian loại dung mơi, ngồi ảnh hưởng tới độ ổn định hoạt chất Do đó, cần nghiên cứu để tối ưu hóa tỉ lệ/dung môi chiết, để thu dịch chiết với nồng độ tối ưu, đồng thời tiết kiệm thời gian dung môi chiết Theo kết nghiên cứu hàm lượng protein chiết với tỉ lệ 1/20 30,37% tăng tỉ lệ dược liệu/dung môi 1/25 1/30 hiệu suất giảm cịn 27.00% 26,82% Như vậy, dùng nhiều dung môi chiết làm cho dịch chiết lỗng, ảnh hưởng làm giảm hiệu suất chiết protein tồn phần pH dung mơi chiết 35 pH dung môi ảnh hưởng tới độ tan, độ ổn định hoạt chất tính chọn lọc dung mơi Vì thế, chúng ảnh hưởng đến hiệu suất chiết, loại lượng tạp chất, chất lượng, thành phần, hàm lượng, tỷ lệ hàm lượng hoạt chất dịch chiết Theo số nghiên cứu khảo sát độ ảnh hưởng pH dung môi đến hiệu suất chiết protein, pH – protein kết tủa nhiều nhất, pH base -10 độ tan protein tăng hiệu suất chiết cao [24] Vì lựa chọn pH yếu tố khảo sát Tuy nhiên, hạn chế thiết bị, quy trình khó khăn nên cố định pH dung mơi ban đầu trước chiết mà khơng trì pH trình trình chiết Chiết đo pH định lượng protein toàn phần dịch chiết Kết thể mục 3.2.5, pH dịch chiết tương đương 6,21; 6,23; 6,36 Nhận thấy, sau chiết pH dung dịch tương đương bình Và kết định lượng protein toàn phần ba dịch chiết ba giá trị pH 5,04; 7,12; 9,15 tương đương là: 28,15%; 29,10%; 29,37% Như vậy, pH khác dung môi trước chiết không ảnh hưởng tới hiệu suất chiết protein Để thuận tiện tiết kiệm thời gian, sử dụng dung mơi nước cất có pH trung tính ⁓ để chiết tối ưu Nghiên cứu đề xuất sử dụng pH yếu tố khảo sát cần trì pH suốt trình chiết để đánh giá khác biệt hiệu suất chiết protein Số lần chiết Thông thường, tăng số lần chiết, dược liệu tiếp xúc với dung môi từ làm tăng hiệu suất chiết Tuy nhiên chiết nhiều lần, ảnh hưởng tới độ ổn định hoạt chất nhiệt độ, pH, ánh sáng thêm nữa, dịch chiết lỗng làm cho khó thu sản phẩm, tốn lượng thời gian loại dung môi lâu làm ảnh hưởng tới độ ổn định hoạt chất Do đó, chiết nhiều lần gây tốn dung môi, thời gian chiết, giảm chất lượng dịch chiết Theo kết nghiên cứu phía trên, sử dụng phương pháp so màu cho dịch chiết phản ứng với thuốc thử Ninhydrin Dịch chiết lần thu phản ứng dương tính rõ rệt với Ninhydrin, dung dịch có màu tím đậm Dịch chiết lần hai có xuất màu tím thành ống nghiệm lắc dung dịch lên không quan sát màu tím Từ cho thấy, lần chiết thứ hai có protein nhiên khơng đáng kể Như vậy, cần chiết lần với điều kiện chiết xuất khảo sát thu gần tồn protein 3.6.3 Về kết q trình chiết xuất protein toàn phần từ Đậu đen phương pháp tối ưu OFAT ứng dụng Cao đậu đen chiết mẻ 50g có hàm lượng protein khoảng 29,62 ± 1,36 %, với hiệu suất chiết cao 20,72 ± 1,16% hàm lượng protein dược liệu đậu đen 36 22,87% ± 0,39%, trình chiết chiết phần nhỏ protein từ dược liệu Điều giải thích protein đậu đen gồm protein có cấu trúc lớn khơng tan nước, q trình chiết nước, khơng lấy tồn protein dược liệu Ngồi ra, q trình chiết nóng, protein bị biến tính phần nhiệt độ cao nên ảnh hưởng tới hiệu suất chiết protein Để khắc phục tượng này, nhóm nghiên cứu đề xuất khảo sát thêm số yếu tố để tối ưu hiệu suất chiết như: nhiệt độ chiết xuất Thời gian có hạn nên nhóm nghiên cứu chưa thực hoạt động Do đó, cần tiếp tục nghiên cứu hồn thiện quy trình điều chế cao dược liệu có hàm lượng protein cao từ Đậu đen để đưa vào ứng dụng Nhóm nghiên cứu đề xuất cần tiếp tục nghiên cứu để tìm phương pháp loại bớt tạp cao từ giúp tăng hàm lượng protein tồn phần cao Từ kết nghiên cứu điều kiện tối ưu để chiết xuất protein toàn phần từ Đậu đen, tiến hành điều chế cao đặc giàu protein toàn phần Đây bước đầu quy trình hồn thiện sản phẩm có tác dụng điều trị số bệnh có chứa hàm lượng cao protein tồn phần Ban đầu, nhóm nghiên cứu chưa xác định dung môi chiết xuất dược liệu tối ưu dự đốn khó khăn q trình điều chế cao khơ, nên bước đầu tiến hành điều chế cao đặc Đậu đen Tuy nhiên, trình thực nghiệm, nhận thấy dịch chiết Đậu đen dễ dàng đặc tạo cao khơ Do đó, nghiên cứu đề xuất tiếp tục nghiên cứu điều chế cao Đậu đen để tạo sản phẩm cao khơ Đậu đen có hàm lượng hoạt chất cao, đồng thời vận chuyển, bảo quản sử dụng dễ dàng 3.6.4 Về thử tác dụng sinh học cao Đậu đen Như nội dung trình bày phần tổng quan, protein đậu đen nghiên cứu có nhiều tác dụng sinh học như: kháng vi sinh vật, kháng vi-rút, hạ lipid máu, chống oxy hóa, trị đái tháo đường, hạ đường huyết, hoạt động tan huyết khối [23] [37] Thêm đậu đen sử dụng nhiều thuốc cổ truyền để điều trị bệnh Ngoài ra, đậu đen sử dụng phối hợp địa long, đậu xanh bồ ngót để điều chế thuốc Nam địa long Theo kinh nghiệm dân gian, thuốc dùng để điều trị động kinh, viêm khớp ung thư giới thiệu theo kinh nghiệm cụ Nguyễn An Định Theo số nghiên cứu đại, thuốc Nam Địa Long có hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7, ung thư gan HepG2, ung thư phổi NCI-H460 hoạt hóa q trình apoptosis (sự chết theo chương trình tế bào bị tổn thương thay đổi cấu trúc) tế bào MCF-7 không độc tế bào bình thường [5] 37 Như vậy, đậu đen có vai trị quan trọng y học, nhiên, nước ta chưa có nhiều nghiên cứu phương pháp chiết xuất đậu đen, mục tiêu nghiên cứu nhằm tìm phương pháp tối ưu chiết xuất protein toàn phần từ Đậu đen bán thành phẩm cao dược liệu giàu hoạt chất Từ đó, nhóm nghiên cứu đề xuất thử hoạt tính sinh học cao Đậu đen để xác định rõ tác dụng dược lý cao để ứng dụng phát triển sản phẩm có chứa cao Đậu đen 38 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau thời gian triển khai thực hiện, đề tài hoàn thành mục tiêu đề thu kết quả: Đã khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất protein toàn phần từ Đậu đen, bao gồm: chuẩn bị dược liệu, kích thước dược liệu, thời gian chiết, tỉ lệ dược liệu/dung môi, pH dung môi chiết, số lần chiết Từ lựa chọn điều kiện tối ưu để chiết xuất cao đặc giàu protein từ Đậu đen sau: ₋ Chuẩn bị dược liệu: rang hạt Đậu đen ₋ ₋ ₋ Kích thước: Bột thơ Thời gian chiết: Tỉ lệ dược liệu/dung môi: 1/20 ₋ ₋ pH chiết: pH trung tính ⁓7 (sử dụng nước cất) Số lần chiết: lần Điều chế cao đặc Đậu đen từ điều kiện tối ưu xây dựng số tiêu chất lượng cao Đậu đen - Điều chế cao đặc giàu protein toàn phần từ Đậu đen với quy mô 50g/mẻ dựa điều kiện khảo sát với hiệu suất chiết cao 20,72 ± 1,16% hàm lượng protein toàn phần cao 29,62 ± 1,36 % - Xây dựng số tiêu chất lượng cao: Cảm quan: đặc quánh, màu nâu đen, có mùi thơm đặc trưng pH: 6,08 - 6,35 Mất khối lượng làm khô: 16,61% ± 0,99% Định tính: Phản ứng dương tính với Ninhydrin Sắc ký lớp mỏng cho vết tương ứng với dược liệu Đậu đen Định lượng: Hàm lượng protein toàn phần: 29,62 ± 1,36% hàm lượng polyphenol toàn phần: 0,0691 (g/g) KIẾN NGHỊ Nghiên cứu hoàn thiện quy trình điều chế cao giàu protein tồn phần từ Đậu đen, sau nâng cấp quy mơ pilot quy mơ cơng nghiệp Hồn thiện đánh giá tiêu để xây dựng tiêu chuẩn sở cao Đậu đen giàu protein Tiến hành thử hoạt tính sinh học đánh giá tác dụng cao Đậu đen giàu protein 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ môn Công nghiệp Dược (2022), Kỹ thuật chiết xuất dược liệu, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2006), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr.239-240 Phạm Xn Sinh, Phùng Hịa Bình (2002), Dược học cổ truyền, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr.410 Trần Bảo Ngọc Thư, Võ Thị Bích Liên, Diệu NTM (2022), "Tổng quan vị thuốc Địa Long (Pheretima sp.) theo kinh nghiệm dân gian y học cổ truyền" Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.756-758 Tiếng Anh Awika JM, Duodu KG (2017), "Bioactive polyphenols and peptides in cowpea (Vigna unguiculata) and their health promoting properties: A review", Functional Foods, 38, pp.686-697 Barnes MJ, Uruakpa F, Udenigwe C (2015), "Influence of cowpea (Vigna unguiculata) peptides on insulin resistance", Nutritional Health Food Science, 3, pp.1-3 Cicero AF, Fogacci F, Colletti A (2017), "Potential role of bioactive peptides in prevention and treatment of chronic diseases: A narrative review", British journal of Pharmacology, 174(11), pp.1378-1394 10 Committee AIM (2011), "AOAC INTERNATIONAL Methods Committee guidelines for validation of biological threat agent methods and/or procedures", Journal of AOAC International, 94(4), pp.1359-1381 11 Cui E-J, Song N-Y, Shrestha S, Chung I-S, Kim J-Y, Jeong T-S, et al (2012), "Flavonoid glycosides from cowpea seeds (Vigna sinensis K.) inhibit LDL oxidation", Food Science Biotechnology, 21(2), pp.619 12 Czitrom V (1999), "One-factor-at-a-time versus designed experiments", The American Statistician, 53(2), pp.126-131 13 Chang Q, Wong Y-S (2004), "Identification of flavonoids in Hakmeitau beans (Vigna sinensis) by high-performance liquid chromatography− electrospray mass spectrometry (LC-ESI/MS)", Agricultural Food Chemistry, 52(22), pp.6694-6699 14 De Leo F, Panarese S, Gallerani R, Ceci L (2009), "Angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptides: production and implementation of functional food", Current pharmaceutical design, 15(31), pp.3622-3643 15 de Souza Rocha T, Hernandez LMR, Chang YK, de Mejía EG (2014), "Impact of germination and enzymatic hydrolysis of cowpea bean (Vigna unguiculata) on the generation of peptides capable of inhibiting dipeptidyl peptidase IV", Food Research International, 64, pp.799-809 16 Dueñas M, Sun B, Hernández T, Estrella I, Spranger MIJJoa, chemistry f (2003), "Proanthocyanidin composition in the seed coat of lentils (Lens culinaris L.)", Agricultural Food Chemistry, 51(27), pp.7999-8004 17 Frei B, Higdon JV (2003), "Antioxidant activity of tea polyphenols in vivo: evidence from animal studies", The Journal of nutrition, 133(10), pp.3275S-3284S 18 Guerrero L, Castillo J, Quinones M, Garcia-Vallve S, Arola L, Pujadas G, et al (2012), "Inhibition of angiotensin-converting enzyme activity by flavonoids: structure-activity relationship studies.", PloS one, 7(11), pp.e49493 19 Gupta K, Das S, Aman S, Nayak A (2016), "Pharmacological activities of Vigna unguiculata", World Journal of Pharmaceutical Research, 5(10), pp.337-345 20 Gupta P, Singh R, Malhotra S, Boora K, Singal HJP, Plants MBo (2010), "Characterization of seed storage proteins in high protein genotypes of cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp.)", Physiology Molecular Biology of Plants, 16, pp.5358 21 Gutiérrez-Uribe J, Romo-Lopez I, Serna-Saldívar S (2011), "Phenolic composition and mammary cancer cell inhibition of extracts of whole cowpeas (Vigna unguiculata) and its anatomical parts", Journal of Functional Foods, 3(4), pp.290-297 22 Joanitti GA, Azevedo RB, Freitas SM (2010), "Apoptosis and lysosome membrane permeabilization induction on breast cancer cells by an anticarcinogenic Bowman–Birk protease inhibitor from Vigna unguiculata seeds", Cancer letters, 293(1), pp.73-81 23 Kitadi JM, Inkoto CL, Lengbiye EM, Taba KM, Mbala, Mavinga, et al (2019), "Nutritional value, phytochemistry and pharmacological activities of Vigna unguiculata (L.) Walp.: A review", European Journal of Pharmaceutical and medical research, 6(10), pp.94-100 24 Kudre TG, Benjakul S, Kishimura H (2013), "Comparative study on chemical compositions and properties of protein isolates from mung bean, black bean and bambara groundnut", The Science of Food Agriculture, 93(10), pp.2429-2436 25 Lamuela‐Raventós RM (2018), "Folin–Ciocalteu method for the measurement of total phenolic content and antioxidant capacity", Measurement of antioxidant activity capacity: recent trends applications, pp.107-115 26 Lima A, Mota J, Monteiro S, Ferreira R (2016), "Legume seeds and colorectal cancer revisited: Protease inhibitors reduce MMP-9 activity and colon cancer cell migration", Food chemistry, 197, pp.30-38 27 López‐Barrios L, Gutiérrez‐Uribe JA, Serna‐Saldívar SO (2014), "Bioactive peptides and hydrolysates from pulses and their potential use as functional ingredients", Food science, 79(3), pp.R273-R283 28 Marques MR, Freitas RAMS, Carlos ACC, Siguemoto ÉS, Fontanari GG, Arêas JAG (2015), "Peptides from cowpea present antioxidant activity, inhibit cholesterol synthesis and its solubilisation into micelles", Food Chemistry, 168, pp.288-293 29 Mune MAM, Minka SR, Mbome IL (2008), "Response surface methodology for optimisation of protein concentratepreparation from cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp)", Food Chemistry, 110(3), pp.735-741 30 Nderitu AM, Dykes L, Awika JM, Minnaar A, Duodu KG (2013), "Phenolic composition and inhibitory effect against oxidative DNA damage of cooked cowpeas as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion", Food Chemistry, 141(3), pp.1763-1771 31 Ojwang LO (2012), Anti-inflammatory properties of cowpea phenotypes with different phenolic profiles., Texas A&M University 32 Ojwang LO, Dykes L, Awika JM (2012), "Ultra performance liquid chromatography–tandem quadrupole mass spectrometry profiling of anthocyanins and flavonols in cowpea (Vigna unguiculata) of varying genotypes", Agricultural food chemistry, 60(14), pp.3735-3744 33 Ojwang LO, Yang L, Dykes L, Awika J (2013), "Proanthocyanidin profile of cowpea (Vigna unguiculata) reveals catechin-O-glucoside as the dominant compound", Food chemistry, 139(1-4), pp.35-43 34 Rangel A, Saraiva K, Schwengber Pc, Narciso MS, Domont GB, Ferreira ST, et al (2004), "Biological evaluation of a protein isolate from cowpea (Vigna unguiculata) seeds", Food Chemistry, 87(4), pp.491-499 35 Salawu SO, Bester MJ, Duodu KG (2014), "Phenolic composition and bioactive properties of cell wall preparations and whole grains of selected cereals and legumes", Food Biochemistry, 38(1), pp.62-72 36 Sandeep D (2014), "Evaluation of antibacterial activity of seed extracts of Vigna unguiculata", International journal of Pharmacy pharmaceutical sciences, 6(1), pp.75-77 37 Sayeed V, Satish S, Kumar A, Hegde K (2017), "Pharmacological activities of Vigna unguiculata (L) Walp: A review", International Journal of Pharma Chemical Research, 3(1), pp.44-49 38 Segura-Campos MR, Chel-Guerrero LA, Betancur-Ancona DA (2011), "Purification of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides from a cowpea (Vigna unguiculata) enzymatic hydrolysate", Process Biochemistry, 46(4), pp.864872 39 Sosulski FW, Dabrowski K (1984), "Composition of free and hydrolyzable phenolic acids in the flours and hulls of ten legume species", Agricultural Food Chemistry, 32(1), pp.131-133 40 Tazin TQ, Rumi JF, Rahman S, Al-Nahain A, Jahan R, Rahmatullah M (2014), "Oral glucose tolerance and antinociceptive activity evaluation of methanolic extract of Vigna unguiculata ssp beans", World J Pharm Pharmaceut Sci, 3(8), pp.28-37 41 Tchiagam L, Bell JM, Nassourou AM, Njintang NY, Youmbi EJAJoB (2011), "Genetic analysis of seed proteins contents in cowpea (Vigna unguiculata)", 10(16), pp.3077-3086 42 Tian GT, Zhu MJ, Wu YY, Liu Q, Wang HX, Ng TB (2013), "Purification and characterization of a protein with antifungal, antiproliferative, and HIV‐1 reverse transcriptase inhibitory activities from small brown‐eyed cowpea seeds", Biotechnology Applied Biochemistry, 60(4), pp.393-398 43 Xiong S, Yao X, Li A (2013), "Antioxidant properties of peptide from cowpea seed", International journal of food properties, 16(6), pp.1245-1256 44 Xu B, Chang SK (2012), "Comparative study on antiproliferation properties and cellular antioxidant activities of commonly consumed food legumes against nine human cancer cell lines", Food chemistry, 134(3), pp.1287-1296 45 Yang L, Allred C, Awika J (2014), "Emerging evidence on the role of estrogenic sorghum flavonoids in colon cancer prevention", Cereal Foods World, 59(5), pp.244251 46 Yap LS, Lee WL, Ting ASY (2021), "Optimization of L-asparaginase production from endophytic Fusarium proliferatum using OFAT and RSM and its cytotoxic evaluation", Microbiological Methods, 191, pp.106358 47 Ye X, Wang H, Ng T (2000), "Structurally dissimilar proteins with antiviral and antifungal potency from cowpea (Vigna unguiculata) seeds", Life Sciences, 67(26), pp.3199-3207 48 Zaheer M, Ahmed S, Hassan MM (2020), "Vigna unguiculata (L.) Walp.: A review of medicinal uses, Phytochemistry and pharmacology", Pharmacognosy Phytochemistry, 9(1), pp.1149-1152 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Tiêu Đậu đen Vigna unguiculata subsp cylindrica (L.) Verdc., Fabaceae Phụ lục 2: Phiếu giám định tên dược liệu Phụ lục 3: Giấy chứng nhận mã số tiêu