Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng của cốm thuốc bổ trung ích khí

Định lượng AGS – IV trong dược liệu Hoàng kỳ, cốm Hoàng kỳ và cốm Bổ trung ích khí bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [4].. Bài “Bổ trung ích khí thang” với 8 vị dược liệu: Hoàng

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ THANH HIỀN

XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CỐM THUỐC BỔ TRUNG ÍCH KHÍ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận, em đã nhận được sự giúp đỡ quý

báu của các thầy cô giáo, các chuyên gia trong lĩnh vực nghiên cứu cùng bạn bè và gia đình

Trước hết, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo đại học cùng

toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện, tận tình dạy

dỗ và chỉ bảo cho em trong suốt 5 năm học qua

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Bùi Hồng Cường, người đã tận tình

hướng dẫn, luôn quan tâm chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt

quá trình học tập và thực hiện khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn chị Hoàng Thị Hảo – học viên cao học khóa 22, Trường

Đại học Dược Hà Nội đã chia sẻ, giúp đỡ và hướng dẫn em tận tình trong thời gian em thực

hiện khóa luận

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến DS Trần Văn Cương và Công ty cổ phần

Dược phẩm VCP, DS Đỗ Trung Hiếu và Công ty cổ phần thương mại dược phẩm Quốc tế

WINSACOM đã cung cấp mẫu cốm thuốc, chất chuẩn và hỗ trợ kinh phí cho em thực hiện

đề tài này

Em xin cảm ơn PGS TS Nguyễn Mạnh Tuyển cùng các thầy cô bộ môn Dược Học

Cổ Truyền đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình làm thực nghiệm

Em xin cảm ơn ThS Nguyễn Tuấn Anh, DS Bạch Thị Thắm cùng các anh chị trong

Phòng Đông dược - Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương đã giúp đỡ em trong quá trình

làm thực nghiệm

Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc nhất, em muốn gửi tới gia đình, người thân và bạn

bè đã luôn bên cạnh, ủng hộ em trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, ngày 13 tháng 06 năm 2019

Sinh viên

Vũ Thị Thanh Hiền

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ ……….1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về bệnh trĩ 2

1.1.1 Bệnh trĩ theo quan điểm Y học hiện đại 2

1.1.2 Bệnh trĩ theo quan điểm Y học cổ truyền 2

1.2 Phương thuốc “Bổ trung ích khí” 3

1.2.1 Công thức 3

1.2.2 Công năng, chủ trị của phương thuốc 3

1.2.3 Định tính, định lượng 4

1.3 Tổng quan về các vị thuốc trong bài thuốc Bổ trung ích khí 5

1.3.1 Hoàng kỳ 5

1.3.2 Đảng sâm 9

1.3.3 Đương quy 10

1.3.4 Sài hồ 11

1.3.5 Trần bì 13

1.3.6 Thăng ma 14

1.3.7 Bạch truật 15

1.3.8 Cam thảo 16

1.4 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) – detector tán xạ bay hơi (ELSD) 17

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp 17

1.4.2 Detector Tán xạ bay hơi (ELSD) 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.2 Thiết bị, máy móc 20

2.1.3 Hóa chất, chất chuẩn 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Nghiên cứu định tính một số thành phần hóa học trong cốm Bổ trung ích khí, dược liệu: 21

2.2.2 Định lượng AGS – IV trong dược liệu Hoàng kỳ, cốm Hoàng kỳ và cốm Bổ trung ích khí bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [4] 21

2.3 Xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25

3.1 Khảo sát chỉ tiêu định tính 25

3.1.1 Định tính các chất trong cốm Bổ trung ích khí bằng phản ứng hóa học 25

3.1.2 Định tính cốm Bổ trung ích khí bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 26

3.2 Định lượng AGS IV trong Hoàng kỳ, cốm Hoàng kỳ, cốm Bổ trung ích khí bằng HPLC – ELSD 39

3.2.1 Chuẩn bị mẫu 39

3.2.2 Định lượng AGS IV trong Hoàng kỳ, cốm Hoàng kỳ, cốm thuốc Bổ trung ích khí bằng HPLC – ELSD 40

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 48

4.1 Về định tính một số thành phần hóa học trong cốm Bổ trung ích khí bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 48

4.2 Về định lượng AGS IV trong các mẫu Hoàng kỳ, cốm Hoàng kỳ, cốm Bổ trung ích khí 49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

1 KẾT LUẬN 51

1.1 Xây dựng một số chỉ tiêu định tính trong cốm thuốc Bổ trung ích khí 51

1.2 Xây dựng chỉ tiêu định lượng AGS IV trong cốm Bổ trung ích khí 51

2 KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AGS IV Astragalosid IV Ln (C ) Logarit cơ số e của nồng độ HPLC High-performance liquid

chromatography

Ln (Spic) Logarit cơ số e của diện tích pic

HPTLC High-performance thin layer

chromatography

NF-𝜅B Nuclear Factor-kappa B

Inos Inducible nitric oxide synthase ELSD Evaporative light scattering

detector

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu định lượng AGS IV……… 6

Bảng 2.1 Công thức bào chế của 1 gói cốm thuốc Bổ trung ích khí (7,93g)……… 20

Bảng 3.1 Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học……… 25

Bảng 3.2 Kết quả SKLM định tính Hoàng kỳ, cốm Bổ trung ích khí và AGS IV sau khi phu thuốc thử hiện màu……… 28

Bảng 3.3 Kết quả SKLM định tính Đảng sâm, cốm, quan sát ở bước sóng 254 nm 30 Bảng 3.4 Kết quả SKLM định tính Đương quy, cốm, quan sát ở bước sóng 254nm 33 Bảng 3.5 Kết quả SKLM định tính Cam thảo, cốm, quan sát ở bước sóng 254 nm 34

Bảng 3.6 Kết quả SKLM định tính Bạch truật, cốm, quan sát ở bước sóng 254 nm 35 Bảng 3.7 Kết quả SKLM định tính Trần bì, cốm, quan sát ở bước sóng 254 nm… 36

Bảng 3.8 Kết quả SKLM định tính Thăng ma, cốm, quan sát ở bước sóng 254 nm 37 Bảng 3.9 Kết quả SKLM định tính Sài hồ, cốm, quan sát ở bước sóng 254 nm… 38 Bảng 3.10 Kết quả độ thích hợp hệ thống……… 40

Bảng 3.11 Thời gian lưu của các mẫu thử và mẫu chuẩn……… 41

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính định lượng AGS IV……… 44

Bảng 3.13 Kết quả xác định độ ẩm của dược liệu Hoàng kỳ……… 45

Bảng 3.14 Kết quả xác định độ ẩm của cốm Hooàng kỳ, cốm Bổ trung ích khí…… 46

Bảng 3.15 Kết quả định lượng AGS IV trong các mẫu nghiên cứu……… 47

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao ……… 17

Hình 1.2 Sơ đồ nguyên lý cấu tạo của 1 detector tán xạ bay hơi ……… 18

Hình 2.1 Các dược liệu trong bài thuốc Bổ trung ích khí……… 19

Hình 3.1 Sắc ký đồ ĐT Hoàng kỳ, cốm, AGS IV sau khi phun thuốc thử hiện màu……… 28

Hình 3.2 Sắc ký đồ ĐT Đảng sâm, cốm ở bước sóng 254nm……… 30

Hình 3.3 Sắc ký đồ ĐT Đương quy, cốm ở bước sóng 254nm……… 33

Hình 3.4 Sắc ký đồ ĐT Cam thảo, cốm ở bước sóng 254nm……… 34

Hình 3.5 Sắc ký đồ ĐT Bạch truật, cốm ở bước sóng 254nm……… 35

Hình 3.6 Sắc ký đồ ĐT Trần bì, cốm ở bước sóng 254nm……… 36

Hình 3.7 Sắc ký đồ ĐT Thăng ma, cốm ở bước sóng 254nm……… 37

Hình 3.8 Sắc ký đồ ĐT Sài hồ, cốm ở bước sóng 254nm……… 38

Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu dung môi……… 41

Hình 3.10 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử Hoàng kỳ……… 42

Hình 3.11 Sắc ký đồ của mẫu thử cốm Hoàng kỳ và mẫu thử cốm Bổ trung ích khí 43 Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa logarit cơ số e của nồng độ và logarit cơ số e của diện tích pic AGS IV……… 45

Bệnh trĩ tuy không gây nguy hại tới tính mạng nhưng có ảnh hưởng rất nhiều tới sinh hoạt và chất lượng sống của người bệnh Theo YHHĐ ngày nay, có nhiều phương pháp điều trị trĩ như: điều trị nội khoa, điều trị bằng thủ thuật, điều trị bằng phẫu thuật [19] Bệnh trĩ cũng được YHCT đề cập đến nhiều trong các y văn kinh điển về nguyên nhân, cơ chế bệnh sinh và phương pháp điều trị Bài “Bổ trung ích khí thang” với 8 vị dược liệu: Hoàng

kỳ, Đảng sâm, Bạch truật, Thăng ma, Sài hồ, Đương quy, Cam thảo là một trong các bài thuốc cổ phương được giới thiệu trong y văn dùng điều trị trĩ thông qua tác dụng ích khí thăng đề (làm co búi trĩ) và làm giảm ứ huyết ở búi trĩ và trực tràng [9]

Trên thị trường hiện nay, bài thuốc “Bổ trung ích khí” đã được hiện đại hóa thành nhiều chế phẩm điều trị trĩ như: viên hoàn cứng Tottri (Traphaco), viên nang cứng Hermonic (Trường Anh Pharm)… Với mong muốn phát huy tính ưu việt của thuốc cổ truyền và tính tiện lợi khi sử dụng cho người bệnh, việc nghiên cứu bào chế và tiêu chuẩn hóa phương thuốc cổ truyền với các dạng bào chế hiện đại là vô cùng cần thiết, trong đó cốm thuốc là một dạng bào chế dễ sử dụng, hấp thu nhanh và sử dụng được trên cả đối tượng bệnh nhân không dùng được thuốc dạng viên Công ty Cổ phần Dược phẩm VCP đã bào chế thành công cốm thuốc từ bài thuốc “Bổ trung ích khí” tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về tiêu chuẩn hóa dạng bào chế này

Từ những lý do trên, đề tài “Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng của cốm thuốc Bổ trung ích khí” được thực hiện với 2 mục tiêu:

- Định tính một số thành phần hóa học trong cốm bài thuốc bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

- Định lượng Astragalosid IV trong cốm bài thuốc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector tán xạ bay hơi

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về bệnh trĩ

1.1.1 Bệnh trĩ theo quan điểm Y học hiện đại

Trĩ là những cấu trúc mạch bình thường ở ống hậu môn Bệnh trĩ là tình trạng những cấu trúc này bị chuyển đổi sang trạng thái bệnh lý do yếu tố cơ học làm giãn, lỏng lẻo hệ thống nâng đỡ gây ra sa búi trĩ và yếu tố mạch máu làm giãn mạch gây chảy máu [19]

Ngày nay, có nhiều phương pháp để điều trị trĩ, bao gồm:

Điều trị nội khoa: tuân thủ các nguyên tắc vệ sinh, lao động, ăn uống; dùng thuốc

tại chỗ dạng mỡ, viên đặt hậu môn hoặc dùng thuốc toàn thân làm tăng sức bền thành mạch

Điều trị bằng thủ thuật: tiêm xơ, thắt búi trĩ bằng vòng cao su hoặc dùng tia hồng

ngoại, đốt điện, lase, liệu pháp lạnh…

Điều trị ngoại khoa: phẫu thuật theo phương pháp cắt trĩ riêng lẻ từng búi theo

Milligan – Morgan hoặc lấy bỏ toàn bộ niêm mạc ống hậu môn cùng các búi trĩ theo phương pháp Whitehead kết hợp với chế độ săn sóc sau mổ [19], [2]

1.1.2 Bệnh trĩ theo quan điểm Y học cổ truyền

Trĩ là một bệnh mạn tính do các mạch trực tràng hậu môn bị giãn và xung huyết Tĩnh mạch xung huyết thành một búi hoặc nhiều búi, tùy vị trí tĩnh mạch ở trực tràng hoặc hậu môn, được phân chia trên lâm sàng thành trĩ nội hay trĩ ngoại Vì xung huyết dễ gây thoát quản, chảy máu làm người bệnh thiếu máu; vì bội nhiễm nên người bệnh có triệu chứng nhiễm trùng

Theo Y học cổ truyền, khi tỳ vị đã suy yếu thì không vận hóa được thủy cốc, không làm chủ được cơ nhục, không thống nhiếp huyết khiến thấp nhiệt, đàm trọc ứ đọng làm phát sinh các búi trĩ, tạo thành dịch tiết gây ngứa ngáy vùng hậu môn, cơ nhục bị nhẽo (khí hư gây hạ hãm), nên các búi trĩ cùng khối da, cơ vùng hậu môn sa xuống

- Nguyên nhân gây ra trĩ:

Viêm đại tràng mạn tính gây táo bón, thường xuyên phải rặn nhiều; viêm gan, xơ gan mạn tính gây xung huyết tĩnh mạch; bệnh nghề nghiệp do đứng lâu, ngồi lâu, mang vác nặng; phụ nữ đẻ nhiều lần, phụ nữ có thai làm trương lực cơ thành mạch, thành bụng bị giảm gây giãn tĩnh mạch…

Phương thuốc xuất xứ từ “Tỳ vị luận” của Lý Đông Viên – một danh y Trung Quốc [9]

1.2.2 Công năng, chủ trị của phương thuốc

Phương thuốc được áp dụng với trĩ thể lâu ngày gây thiếu máu, trĩ ở người già, trĩ thể khí huyết đều hư với các triệu chứng: đại tiện ra máu lâu ngày, hoa mắt ù tai, sắc mặt trắng nhợt, rêu lưỡi trắng mỏng, mạch trầm tế; người mệt mỏi, đoản hơi, tự ra mồ hôi [12]

- Công năng: bổ trung ích khí, thăng dương, cử hãm

- Chủ trị

Chứng tỳ vị hư: ăn kém, mệt mỏi tự ra mồ hôi hoặc thấy phát sốt, mạch hư vô lực Chứng tỳ khí hư hãm gây sa giáng nội tạng: sa dạ dày, sa trực tràng, sa sinh dục Chứng chảy máu kéo dài do rong kinh, rong huyết, huyết tán … do tỳ hư không thống huyết

Chứng sốt cơ năng kéo dài: người mệt mỏi, tay chân vô lực, bụng đầy, khát không muốn uống, đại tiện lỏng, hay nôn [9], [11]

- Các nhóm tác dụng chính:

 Bổ khí, kiện tỳ: Hoàng kỳ, Đảng sâm, Bạch truật, Cam thảo

 Bổ huyết: Đương quy

 Hành khí giảm đau: Trần bì

 Thăng đề dương khí bị hãm ở dưới: Hoàng kỳ, Thăng ma, Sài hồ

- Giải thích phương thuốc

Hoàng kỳ ích khí, thăng dương khí làm quân Đảng sâm, Bạch truật, Cam thảo kiện

tỳ ích khí làm thần, cùng được công năng bổ khí, kiện tỳ Phối hợp Trần bì hành khí, Đương quy bổ huyết, đều là các tá dược Thăng ma, Sài hồ thăng cử thanh dương hãm ở dưới, là

sứ dược trong bài thuốc bổ khí Xét chung cả bài, vừa là bổ khí kiện tì để trị gốc của khí

hư, lại thăng đề dương khí bị hãm ở dưới, để khiến cái đục giáng xuống, cái trong thăng lên, do đó điều hòa tì vị, tinh khí của gạo nước sinh hóa có nguồn, các chứng hư khí của tì

vị sẽ tự hết Mọi thứ thoát xuống, sa xuống đều tự trở về đúng vị trí [9]

Ngày nay người ta thường dùng bài này để trị sa dạ dày, trĩ, bong sa niêm mạc dạ dày, sa thận, sa tử cung, nhược cơ nặng, viêm gan mạn tính, viêm ruột, đái đục như cháo, trẻ em tiêu chảy, chứng giảm bạch cầu, tiêu chảy lâu ngày, băng lậu huyết rong kinh Dược

lí hiện đại nghiên cứu cho thấy bài thuốc này có tác dụng tăng cường miễn dịch, điều chỉnh nhu động ruột, phòng ngừa thiếu máu, tăng cường thể lực [9]

Kết quả luận án tiến sĩ Y học của Trần Thị Hồng Phương về chè tan Bổ trung ích khí cho thấy thuốc có ít độc tính cấp, phạm vi an toàn rộng, không có độc tính bán trường diễn, có tác dụng cầm máu, giảm đau và chống viêm trên thực nghiệm, tác dụng tốt với các triệu chứng thu nhỏ búi trĩ, giảm táo bón [20]

Một phân tích meta của các thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng cho thấy bài thuốc Bổ trung ích khí có tác dụng điều trị hiệu quả trên bệnh nhân người lớn bị táo bón

và không có tác dụng phụ nghiêm trọng nào được xác định [28]

1.2.3 Định tính, định lượng

Hiện nay, bài thuốc “Bổ trung ích khí” đã được phát triển thành nhiều sản phẩm điều trị trĩ trên thị trường dưới các dạng bào chế khác nhau như: viên hoàn, viên nang, chè tan… trong đó viên hoàn mềm đã được tiêu chuẩn hóa và đưa vào Dược điển Việt Nam V và Dược điển Trung Quốc 2015 trong chuyên luận “Hoàn Bổ trung ích khí” với 1 số chỉ tiêu định tính, định lượng như sau:

- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng, so sánh với dược liệu Cam thảo chuẩn và Đương quy chuẩn [4], [23]

- Định lượng:

+ Phương pháp: sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector tán xạ bay hơi (HPLC – ELSD)

+ Yêu cầu: hàm lượng AGS IV trong 1 viên hoàn không được thấp hơn 0,20 mg/g [23]

1.3 Tổng quan về các vị thuốc trong bài thuốc Bổ trung ích khí

1.3.1 Hoàng kỳ

1.3.1.1 Tên khoa học: Radix Astragali membranacei [4]

Rễ phơi hay sấy khô của cây Hoàng kỳ Mông cổ Astragalus membranaceus Fisch; Bge Var mongholicus (Bge) Hsiao; hoặc cây Hoàng kỳ Mạc Giáp Astragalus membranaceas Fisch Bge Họ Đậu Fabaceae [4], [15]

1.3.1.2 Thành phần hóa học

Saponin: Những saponin chính gồm: 7 astragalosid AGS (I, II, III, IV, V, VI, VII);

2 isoastragaloside (I, II) và 2 saponin kiểu olean: AGS VIII và soyasaponin I [18] Ngoài

ra còn có acetylastragalosid, astramembrannin II, cycloastragenol, cyclosieversigenis, soyasapogenol B và lupeo [21] 5 saponin AGS I, II, IV và isoastragaloside I, II; tất cả đều là cycloartanetype triterpenoids [21] Trong đó, AGS- IV là chất chính và đã được đưa vào kiểm soát trong chỉ tiêu định tính, định lượng dược liệu Hoàng Kỳ [4], [23]

Flavonoid: Calycosin-7-O-β-D-glucoside; calycosin-7-O-β-D-glucoside-6’-O malonate; ononin; calycosin (3R)-7,2’-dihydroxy-3’,4’-dimethoxy-isoflavan-7-O-β-D-glucoside; formononetin-7-O-β-D-glucoside-6’-O-malonate và formononetin; sulfuretin, isoliquiritigenin, pendulone [32] Calycosin-7-O-β-D-glucoside chiếm tỷ lệ cao nhất và

cũng là chất chỉ điểm trong kiểm nghiệm dược liệu Hoàng Kỳ [4]

Một số thành phần khác bao gồm: polysaccharid (astragalan I, II, III) [18],

Phytosterol, chất dầu bay hơi, aminoacid, các kim loại, hợp chất hữu cơ (choline, betain, gluconic acid, β-sitosterol), tinh dầu, linoleic acid, chất đắng và asparagin [21]

 Hoạt chất AGS IV

(3-O-β-D-xylopyranosyl-6-O- β-D-glucopyranosyl cycloastragenol):

+ Các phương pháp có thể sử dụng để định lượng ASG IV bao gồm: sắc ký lỏng hiệu năng cao detector tán xạ bay hơi (HPLC – ELSD), sắc ký lỏng khối phổ (HPLC – MS) [42], phổ khối phun mù điện tử (LC – ESI/MS), HPLC – UV [43]

+ Một số nghiên cứu định lượng AGS IV trong dược liệu Hoàng kỳ và chế phẩm được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu định lượng AGS IV

trong Hoàng kỳ bằng

HPLC - ELSD

- Cột Zorbax Eclipse XDB C18 (250 mm×4.6 mm, 5.0 μm)

- Chương trình pha động:

- Detector: UV-280 nm; ELSD 2000 có tốc độ khí 0,8 lít/phút, nhiệt độ 1050C, gain 4

Tác dụng kháng khuẩn: Hoàng kỳ có tác dụng kháng sinh đối với vi khuẩn Shiga,

liên cầu khuẩn dung huyết, phế cầu, tụ cầu vàng [18]

Tác dụng trên hệ miễn dịch: Thử nghiệm invitro và invivo cho thấy AGS IV trong Hoàng kỳ có tác dụng làm tăng sinh tế bào lympho B, lympho T và sản xuất kháng thể [38]

Polysaccharid trong hoàng kỳ có tác dụng làm tăng hoạt tính interleukin 2, kích hoạt tăng sinh tế bào, tăng sản xuất cytokine ở tế bào lympho B và đại thực bào; kích thích đại thực

bào biểu hiện gen iNOS thông qua kích hoạt NF-κB [18]

Tác dụng chống viêm: Astragaloside IV ức chế con đường NF-κB và điều chỉnh sự

biểu hiện kết dính phân tử trên bề mặt của TNF-α và lipopopolysaccharid (LPS), một quá trình chính trong sinh lý bệnh viêm [38] Astramembranin I ức chế sự tăng tính thấm mạch

do serotonin hoặc histamin, còn ức chế phù do carragenin ở chuột cống trắng [18]

Tác dụng chống oxy hóa: Flavonoid trong Hoàng kỳ ức chế tổn thương do glutamat

gây ra ở tế bào thần kinh và tăng đáng kể hoạt tính của enzym chống oxy hóa Isoflavon

trong Hoàng kỳ có đóng góp chính trong ức chế peroxy hóa lipid Saponin trong Hoàng kỳ

cũng có tác dụng ức chế peroxy hóa lipid ở cơ tim và giảm đông máu [21]

1.3.1.4 Tác dụng và công dụng theo Y học cổ truyền

- Tính vị, quy kinh: Vị ngọt, tính ấm; quy kinh phế, tỳ

- Công năng, chủ trị:

Bổ khí trung tiêu: dùng với trạng thái cơ thể suy nhược, tay chân vô lực, yếu hơi, chóng mặt, kém ăn, các bệnh sa giáng tạng phủ, tử cung, lòi dom, lỵ, tả lâu ngày, bang lậu của phụ nữ

Ích huyết; lợi niệu, tiêu phù thũng; giải độc trừ mủ [8], [15]

1.3.2.1 Tên khoa học: Radix Codonopsis pilosulae

Rễ phơi hoặc sấy khô của cây Đảng sâm Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf., Codonopis pilosula (Franch.) Nannf.var modesta (Nannf.) L T Shen hoặc Codonopsis tangshen Oliv., họ Hoa chuông (Campanulaceae) [4], [23]

1.3.2.2 Thành phần hóa học

Triterpen: taraxerol, taraxeryl acetate, 14-α-taraxeran-3-one,

D,B-friedoolean-5-ene-3-β-ol, α-spinasterone [37]

Sesquiterpene glycoside: C15 carotenoid, gymnomitrane , eudesmane [46]

Từ dịch chiết nước của rễ Đảng sâm đã phân lập được bốn acetylen mới là: cyclotetradecatrienynone, tetradecenynetriol và 2 acid octenynoic hiếm (2E, 6E)-octa-2,6-dien-4-ynoic acid, (E)-oct-6-en-4-ynoic; một acid béo ω-hydroxy không bão hòa; và 5 hợp

-12-hydroxydodeca-10-enoic acid, hexadecanoicacid-2’,3’-dihydroxy propyl ester, fulgidic acid, và acid pinellic [29]

1.3.2.3 Tác dụng sinh học

Tác dụng trên máu: Làm tăng hồng cầu, giảm bạch cầu [13]

Tác dụng trên mạch: Làm giãn mạch ngoại vi [13], [18]

Tác dụng trên hệ miễn dịch: Đảng sâm làm tăng chức năng của tủy xương sản sinh

ra các tế bào có hoạt tính miễn dịch và các dưỡng bào, điều hòa và làm giảm hội chứng suy giảm miễn dịch ở chuột [18]

1.3.2.4 Tác dụng và công dụng theo Y học cổ truyền

- Tính, vị; quy kinh: vị ngọt, tính bình, hơi ấm; quy kinh phế, tỳ

- Công năng, chủ trị:

Bổ tỳ sinh tân dịch: dùng trong các trường hợp kém ăn, kém ngủ, cơ thể mệt mỏi, miệng khát Dùng tốt trong các trường hợp trung khí bị hư yếu gây nên các hiện tượng sa giáng như sa dạ dày, sa ruột, tử cung, trĩ, lòi dom … Ích khí bổ phế, lợi niệu [8], [15]

1.3.2.5 Định tính

Định tính bằng sắc ký lớp mỏng, so sánh với chất chuẩn lobetyolin hoặc dược liệu chuẩn Đảng sâm [4], [23]

1.3.3 Đương quy

1.3.3.1 Tên khoa học: Radix Angelicae sinensis

Rễ đã phơi hay sấy khô của cây Đương quy Angelica sinensis (Oliv) Diels , họ Hoa

Acid amin: Alanin, valin, isoleucin, serin, threonin, acid γ-aminobutyric, leucin, leucin, glycin, histidin, methionin, cystidin, uracil, choline

Vitamin: Vitamin B1, vitamin B2, vitamin E; các polyacetylen: falcarinol, falcarindiol, falcarinolon; sterol: β-sitosterol, stigmasterol, β-stigmasteryl-β-D-glucosid và các nguyên tố vi lượng: Mg, Ca, Al, Cr, Cu, Zn, As, Pb, Cd, Hg, P, Fe, St, V [18]

1.3.3.3 Tác dụng sinh học

- Trên cơ trơn: ức chế sự co cơ trơn làm trơn ruột, trị táo bón

- Có tác dụng kháng sinh đối với trực trùng lỵ và tụ cầu trùng [13]

- Tác dụng trên tiểu cầu: ức chế sự ngưng tập tiểu cầu và ức chế sự giải phóng serotonin từ tiểu cầu gây bởi thrombin [18]

- Tác dụng chống viêm: Phân đoạn ethylacetat của Đương quy ức chế hoạt tính của NF-B lucifera và giảm sản xuất NO, PEG2 Acid ferulic, acid isoferulic và Z-ligustilide ức chế sản xuất protein viêm đại thực bào, ức chế hoạt tính TNF-α

và NF-κB [22]

1.3.3.4 Tác dụng và công dụng theo Y học cổ truyền

- Tính vị, quy kinh: vị ngọt, hơi đắng, tính ấm; quy kinh tâm, can, tỳ

- Công năng, chủ trị:

Bổ huyết, bổ ngũ tạng; hoạt huyết, giải uất kết là vị thuốc vừa bổ huyết vừa hoạt huyết nên thích hợp cho các trường hợp thiếu máu kèm theo có ứ tích Giải độc, giảm đau

do khả năng hoạt huyết, tiêu trừ huyết ứ

Hoạt tràng thông tiện: vị thuốc có tác dụng nhu nhuận với vị tràng, do đó thích hợp dùng với chứng huyết hư, huyết táo gây táo bón [8], [15]

1.3.3.5 Định tính

Định tính bằng sắc ký lớp mỏng, so sánh với chất chuẩn acid ferulic hoặc dược liệu chuẩn Đương quy [4], [23]

1.3.4 Sài hồ

1.3.4.1 Tên khoa học: Radix Bupleuri

Rễ phơi hay sấy khô của cây Sài hồ Bupleurum sinense DC và một số cây khác cùng

chi, cùng họ Họ Hoa tán (Apiaceae) [4]

1.3.4.2 Thành phần hóa học

Saponin: Hàm lượng saponin trong rễ Sài hồ là 1,69% Rễ Sài hồ chứa nhiều saponin

và sapogenin triterpen (nhóm olean): saikogenin (A, B, C, D, E, F, G), saikosaponin (A, B1-B4, C, D, E và F)

Tinh dầu: Hàm lượng tinh dầu trong rễ là 0,16% và trong thân là 0,05% Gồm acid

pentanoic, acid 2-heptenoic, acid nonanoic, phenol, cresol, ethylphenol, thymol, eugenol, O-methoxyphenol, γ-heptalacton, γ-octalacton, γ-decalacton, γ-undecalacton, vanilin acetat, acid valeric và p-methoxyacetophenon

Polysaccharid: Rễ Sài hồ chứa 2 polysaccharid có hoạt tính sinh học là các

bupleuran 2II b và 2II c Ngoài ra còn có α-spinasterol cùng với β-D-glucopyranosid của α-spinasterol [17]

1.3.4.3 Tác dụng sinh học

Tác dụng hạ sốt, giảm đau, chống viêm: Saikosaponin được coi là thành phần có

hoạt tính hạ sốt, chống viêm chủ yếu trong rễ Sài hồ Các hoạt chất hạ sốt là eugenol, acid hexanoic, γ-undecalacton và p-methoxyacetophenon, các hoạt chất chống viêm là acid valeric, acid 2-nonenoic và p-methoxyphenon

Tác dụng điều hòa miễn dịch: Bupleuran 2II b làm tăng mạnh sự gắn phức hợp miễn

dịch vào đại thực bào Saikosaponin D có tác dụng kích thích miễn dịch có thể do làm thay đổi chức năng của tế bào lympho T [17]

1.3.4.4 Tác dụng và công dụng theo Y học cổ truyền

- Tính vị, quy kinh: vị đắng, tính hơi hàn; quy kinh can, đởm, tâm bào lạc, tam tiêu

1.3.5 Trần bì

1.3.5.1 Tên khoa học: Pericarpium Citri reticulatae

Vỏ quả chín đã phơi hay sấy khô hoặc lâu năm của cây Quýt Citrus reticulate

Blanco, họ Cam (Rutaceae) [4], [23]

1.3.5.2 Thành phần hóa học

Tinh dầu: Các tinh dầu chính trong Trần bì là D-limonen;

1-metyl-4-(1-metyletyl)-1,4-cyclohexadien; β-myrcen; α, α-4- trimethyl-3-cyclohexene-1-methanol;

2-methoxy-4-vinylphenol và α-pinen ; γ-terpinen, lina myrcen [26]

Flavonoid và coumarin: Người ta đã phân lập từ Trần bì được các hợp chất:

hesperidin; tangeretin; 4’,5,6,7 tetramethoxyflavon; 3,3’,4’,5,6,7,8-heptmethoxyflavon; sinensetin; 5-O-demethylnobiletin; nobiletin; apigenin; 5-O-desmethyltangeretin; 5,7-dihydroxy-3,3’,4’,6-tetramethoxyflavon; pachypodol; 4’,5,6,7-tetramethoxyflavon; 3’,4’,5,7,8-pentamethoxyflavon; agestrcin C; scoparon; isoscopoletin, didymin; methylhesperidin, naringin [25]; 3,5,6,7,8,3’,4’-heptamethoxyflavon; 5-hydroxy-6,7,8,3,4-

pentamethoxyflavon [45]

Alkaloid: 2 alkaloid chính trong Trần bì được tìm ra là synephrine và N-methyl

tyramine Các thành phần khác bao gồm: inositol; vitamin B,C ; carotenoid, pectin, polysaccharid, thymol, β- sitosterol [41]

1.3.5.3 Tác dụng sinh học

Tác dụng chống oxy hóa và kháng khuẩn: Terpen là thành phần chính trong tinh dầu

có hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn Khả năng chống oxy hóa của tinh dầu Trần bì thay đổi theo thời gian lưu trữ, nó có thể liên quan đến việc tăng một số thành phần như α-pinene và β-pinene

Tinh dầu của Trần bì có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Gram(+) (S.aureus, B.subtilis, B.cereus) ở các mức độ khác nhau ngoại trừ S.faecalis; trong đó B.subtili, B.cereus, A.flavus and D.Hansenii nhạy cảm nhất Các tinh dầu không có tác dụng trên vi khuẩn Gram(-) [26]

Ngoài ra, α-pinene trong Trần bì có tác dụng chống ho, đờm, kháng khuẩn và chống nấm; linalool có tác dụng giảm đau, an thần, chống viêm, kháng khuẩn [33]

1.3.5.4 Tác dụng và công dụng theo Y học cổ truyền

- Tính, vị; quy kinh: vị cay, đắng, tính ấm; quy kinh tỳ, phế

- Công năng, chủ trị: Hành khí, hòa vị dùng với bệnh đau bụng lạnh Chỉ nôn, chỉ tả; hóa đàm, ráo thấp, chỉ ho [15]

1.3.5.5 Định tính

Định tính bằng sắc ký lớp mỏng, so sánh với chất chuẩn hesperidin hoặc dược liệu chuẩn Trần bì [4], [23]

1.3.6 Thăng ma

1.3.6.1 Tên khoa học: Rhizoma Cimicifugae

Thân rễ khô của cây Thăng ma Cimicifuga foetida L., họ Mao lương (Ranunculaceae) [23]

1.3.6.2 Thành phần hóa học

Các triperpen đầu tiên được xác định là cimigenol, cimigenol xylopyranosid và dahurinol, acid ferulic, acid isoferulic [16] Triterpenol bidesmosid: 3-arabinosyl-24-O-acetylhydroshengmanol-15-glucosid và 3-xylosyl-24-O-acetylhydroshengmanol-15-glucosid

Các dẫn chất của 9, 19 cyclolanostan như: Acetylshengmanol xylopyranosid; 24-O-acetylhydroshengmanol-3-O-β-D-xylopyranosid; shengmanol-3-O-β xylopyranosid Các cyclo artan triterpenoid: Cimigenol-3-O-β-D-xylopyranosid (23R, 24S); cimisid A và cimisid B; cimisid C và cimisid D

3-O-β-D-Các phenolic glycosid: isocimifugamid, cimidahurin, cimidahurinin 3-O-β-D-Các hợp chất furochromon như visamminol, visnagin, norvisnagin Hai chất màu vàng 3-(3’methyl-butenylidene)-2-idolinon và đồng phân của nó cũng được phân lập và xác định thân rễ Thăng ma chứa acid isoferulic [17]

Chất đắng ximitin với công thức thô là C20H34O7 [13]

1.3.6.3 Tác dụng sinh học

Tác dụng trên cơ trơn: Visamminol và visnagin từ Thăng ma có tác dụng chống co thắt trên hỗng tràng cô lập chuột lang [17]

1.3.6.4 Tác dụng và công dụng theo Y học cổ truyền

- Tính, vị; quy kinh: Vị ngọt, cay hơi đắng, tính bình hơi độc; quy kinh tỳ, vị, phế

- Công năng, chủ trị: Thăng dương, giáng trọc, dùng trong trường hợp trung khí bị

hạ hãm dẫn đến chứng sa giáng như: sa đại tràng, tử cung … Tán phong nhiệt, thanh vị nhiệt, giải độc mụn nhọt [8]

1.3.6.5 Định tính

Định tính bằng sắc ký lớp mỏng, so sánh với chất chuẩn acid ferulic và acid isoferulic hoặc dược liệu Thăng ma chuẩn [4], [23]

1.3.7 Bạch truật

1.3.7.1 Tên khoa học: Rhizoma Atractylodis macrocephalae

Thân rễ phơi hay sấy khô của cây Bạch truật Atractylodes macrocephala Koidz., họ

1.3.7.4 Tác dụng và công dụng theo Y học cổ truyền

- Tính, vị; quy kinh: vị ngọt đắng, tính ấm; quy kinh tỳ, vị

1.3.8 Cam thảo

1.3.8.1 Tên khoa học: Radix Glycyrrhizae

Rễ và thân rễ còn vỏ hoặc đã cạo lớp bần, được phơi hay sấy khô của ba loài Cam

thảo Glycyrrhizae uralensis Fisch., Glycyrrhiza inflata Bat hoặc Giycyrrhiza glabra L., họ

Đậu (Fabaceae) [4]

1.3.8.2 Thành phần hóa học

Saponin: saponin quan trọng nhất là acid glycyrrhizic Các dẫn chất triterpenoid khác như acid liquiritic; acid 18-α-hydroxy-glycyrrhetic; acid 24-hydroxyglycyrrhetic; glabrolid; desoxyglabrolid; isoglabrolid; acid liquiridiolic… [5]

Các flavonoid: điển hình là 2 flavonoid liquiritin và isoliquiritin Ngoài ra còn có nhiều flavonoid thuộc các nhóm khác: isoflavan (glabridin) [42]; isoflavon (glabron); isoflaven (glabren) [5] Các dẫn chất coumarin: umbelliferon; herniarin; liqcoumarin

Ngoài ra trong rễ Cam thảo còn có 20-25% tinh bột; 3-10% glucose và saccharose [5], các hợp chất có nhân estrogen có nhân sterol với hàm lượng thấp [18]

1.3.8.4 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

- Tính vị, quy kinh: vị ngọt, tính bình; quy kinh can, tỳ, thông hành 12 kinh

1.4 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) – detector tán xạ bay hơi (ELSD)

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp

HPLC (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữ hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa rải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha động đưa các chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian thích hợp [7], [6]

Hình 1.1: Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao [7]

1.4.2 Detector Tán xạ bay hơi (ELSD)

Evaporating Light Scattering Detertor (ELSD), hay còn gọi là detector tán xạ bay hơi, thính hợp cho việc phát hiện các thành phần mẫu không bay hơi trong một dung môi

dễ bay hơi ELSD sử dụng ánh sáng phản xạ và tán xạ và 1 biến quang có độ nhạy cao để

đo nồng độ chất phân tích ELSD được coi như 1 detector vạn năng đáp ứng với bất kỳ chất phân tích nào kém bay hơi hơn so với pha động của sắc ký lỏng

Hình 1.2: Sơ đồ nguyên lý cấu tạo của 1 detector tán xạ bay hơi

ELSD hoạt động dựa trên nguyên tắc:

Dịch rửa giải từ cột sắc ký đi vào đầu detector được trộn lãn với khí nitơ trong bộ phận phun sương Hỗn hợp đi qua một kim nhỏ được phân tán thành đám sương mù kích thước đều nhau Ở đây dung môi được bay hơi loại khỏi hạt sương, hạt rắn mịn được tạo thành Các hạt này đi cắt ngang chùm tia laser Chùm tia laser được tán xạ bởi các hạt rắn được phát hiện nhờ ống nhân quang

Như vậy chất phân tích được phát hiện nhờ ánh sáng tán xạ tạo ra tín hiệu điện Đáp ứng của detector liên quan đến khối lượng chất phân tích Detector này khác với detector khúc xạ, thích hợp với chế độ rửa giải gradient, khác với detector UV, độc lập với độ hấp thụ UV và nhóm chức [7], [24] AGS IV là 1 chất không có các liên kết đôi liên hợp và nhân thơm trong công thức cấu tạo nên rất ít hấp thụ UV, độ nhạy thấp Do đó, chúng tôi

sử dụng detector tán xạ bay hơi ELSD để định lượng AGS IV để đảm bảo tính chọn lọc và

độ nhạy cao [30]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các vị thuốc trong phương thuốc do Công ty cổ phần Dược phẩm VCP cung cấp (117 Trần Duy Hưng, Cầu Giấy, Hà Nội), đạt tiêu chuẩn DĐVN V

- Dược liệu chuẩn: được mua tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương ( Thăng ma, Trần bì, Bạch truật, Đảng sâm, Đương quy, Hoàng kỳ) và Viện Dược liệu (Cam thảo), Sài

hồ chuẩn được cung cấp bởi Công ty cổ phần Dược phẩm VCP, có phiếu kiểm nghiệm của từng dược liệu

- Cốm các vị thuốc Hoàng kỳ, Thăng ma, Đảng sâm, Bạch truật, Trần bì, Sài hồ, Cam thảo, Đương quy và cốm bài thuốc Bổ trung ích khí do Công ty cổ phần Dược phẩm VCP cung cấp (117 Trần Duy Hưng, Cầu Giấy, Hà Nội)

Hình 2.1: Các dược liệu trong bài thuốc Bổ trung ích khí

Bảng 2.1: Công thức bào chế của 1 gói cốm thuốc Bổ trung ích khí (7,93g)

Thành phần Khối lượng dược liệu/gói (g) Khối lượng cốm/gói (g)

 Tủ sấy Memmert (Germany)

 Cân phân tích Sartorius BP 221S (Germany)

 Cân phân tích Metller Toledo

 Chày, cối, rây 500

 Máy siêu âm

 Máy ly tâm

 Cân kỹ thuật Precisa (Switzeland)

 Máy đo hàm ẩm

 Máy ảnh Canon 10.0 mega pixel

 Hệ thống thiết bị SKLM hiệu năng cao Linomat 5 (Camag Switzeland)

 Máy sắc ký lỏng Hitachi-ELSD

 Bếp cách thuỷ

 Pipet chính xác các loại, micro pipet, và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác

2.1.3 Hóa chất, chất chuẩn

- Hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích, được mua tại Công ty TNHH Sela, 48 dốc Thọ Lão, phường Đống Mác, quận Hai Bà Trưng, Hà Nội: Ethanol tuyệt đối, n-hexan, ethyl acetat, n-butanol, butyl acetat, acid formic, methanol, chloroform,…

- Chất chuẩn: Astragaloside IV hàm lượng 98.81% (Chengdu must bio-technology Co.Ltd), LOT 17022804 do Công ty Cổ phần Dược phẩm VCP cung cấp

- Acetonitril, methanol: Loại dùng cho HPLC của Merk, nước cất 2 lần

- Bản sắc kí lớp mỏng Silica gel 60 F254 của Merck

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu định tính một số thành phần hóa học trong cốm Bổ trung ích khí, dược liệu:

- Định tính bằng phản ứng hóa học:

Định tính một số nhóm chất chính: flavonoid, saponin, coumarin, polysaccharid, acid amin, alcaloid trong cốm bài thuốc và dược liệu bằng phản ứng hóa học với các thuốc thử chung và thuốc thử đặc hiệu của từng nhóm [3]

- Định tính bằng sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC):

Các nhóm chất trong cốm bài thuốc được chiết riêng Tiến hành sắc kí để xác định các vết và Rf trong dược liệu và cốm bài thuốc So sánh với chất chuẩn, dược liệu chuẩn

2.2.2 Định lượng AGS – IV trong dược liệu Hoàng kỳ, cốm Hoàng kỳ và cốm Bổ trung ích khí bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [4]

 Đối tượng nghiên cứu

 Dược liệu Hoàng kỳ được sử dụng để làm cốm

 Cốm Hoàng kỳ

 Cốm Bổ trung ích khí

 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và dung dịch thử

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác một lượng AGS IV chuẩn và hòa tan trong

methanol để được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 500 µg/ml; 250 µg/ml;

125 µg/ml; và 50 µg/ml

Mẫu thử Hoàng kỳ: Lấy bột Hoàng kỳ, đem rây qua rây 500 Cân chính xác khoảng

ly tâm 2500 vòng/phút trong 5 phút Hút lấy dịch trong Chiết lại cắn 3 lần, mỗi lần với 15

ml methanol, siêu âm 30 phút, ly tâm với tốc độ và thời gian như trên Tập trung các dịch chiết methanol, cô trên cách thủy đến cạn Thêm vào cắn 30 ml dung dịch amoniac 10%, lắc siêu âm 5 phút để hòa tan cắn Chuyển dịch chiết sang bình gạn, chiết lần lượt với 20,

20, 15 và 10 ml n-butanol đã bão hòa nước Tập trung các dịch chiết butanol, cô trên cách thủy đến cạn Dùng methanol để hòa tan và chuyển toàn bộ cắn vào bình định mức 10 ml,

thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 pm

Mẫu thử cốm Hoàng kỳ: Nghiền cốm Hoàng kỳ thành bột mịn, rây qua rây 500 Cân

chính xác khoảng 1,0 g rồi cho vào một cốc có mỏ, thêm 30 ml methanol, lắc siêu âm trong

30 phút, ly tâm 2500 vòng/phút trong 5 phút Hút lấy dịch trong Chiết lại cắn 3 lần, mỗi lần với 15 ml methanol, siêu âm 30 phút, ly tâm với tốc độ và thời gian như trên Tập trung các dịch chiết methanol, cô trên cách thủy đến cạn Thêm vào cắn 30 ml dung dịch amoniac 10%, lắc siêu âm 5 phút để hòa tan cắn Chuyển dịch chiết sang bình gạn, chiết lần lượt với

20, 20, 15 và 10 ml n-butanol đã bão hòa nước Tập trung các dịch chiết butanol, cô cách thủy đến cạn Dùng methanol để hòa tan và chuyển toàn bộ cắn vào bình định mức 10 ml,

thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 pm

Mẫu thử cốm Bổ trung ích khí: Nghiền cốm Bổ trung ích khí thành bột mịn, rây qua

rây 500 Cân chính xác khoảng 3,0 g rồi vào một cốc có mỏ, thêm 30 ml methanol, lắc siêu

âm trong 30 phút, ly tâm 2500 vòng/phút trong 5 phút Hút lấy dịch trong Chiết lại cắn 3 lần, mỗi lần với 15 ml methanol, siêu âm 30 phút, ly tâm với tốc độ và thời gian như trên Tập trung các dịch chiết methanol, cô cách thủy đến cạn Thêm vào cắn 30 ml dung dịch amoniac 10%, lắc siêu âm 5 phút để hòa tan cắn, chuyển dịch chiết sang bình gạn, chiết lần lượt với 20, 20, 15 và 10 ml n-butanol đã bão hòa nước Tập trung các dịch chiết butanol,

cô trên cách thủy đến cạn Dùng methanol để hòa tan và chuyển toàn bộ cắn vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45pm

 Điều kiện sắc ký

 Cột phân tích ULTRA C18 (250x4,6 mm, 5µm)

 Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút

 Áp suất N2 : 3,5 Bar

 Detector: máy phát hiện tán xạ ánh sáng bay hơi

 Pha động: dung môi pha động là acetonitril và nước, chương trình gradient:

Tiêm dung dịch chuẩn, tiến hành sắc ký với điều kiện sắc ký đã nêu trên và tính

số đĩa lý thuyết của cột Số đĩa lý thuyết của cột tính trên pic astragalosid IV phải không dưới 4000 Xây dựng đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc giữa logarit của diện tích pic astragalosid IV và logarit của nồng độ dung dịch chuẩn (µg/ml) theo phương trình

y = ax + b

Tiêm dung dịch thử Sử dụng phương trình đường chuẩn biến đổi logarit của phương pháp ngoại chuẩn của 4 điểm đã lập ở trên để tính nồng độ của astragalosid IV trong dung dịch thử (µg/ml) theo công thức sau:

1000 𝑀𝑐ℎ𝑘 (1−𝐻𝑐ℎ𝑘/100) (mg/g) Hàm lượng AGS IV trong cốm Bổ trung ích khí = 𝐶𝑡.10

1000 𝑀𝑏𝑡 (1−𝐻𝑏𝑡/100) (mg/g)

 Ct là nồng độ astragalosid IV trong dung dịch thử (µg/ml)

 St là diện tích pic astragalosid IV trong sắc ký đồ của dung dịch thử (mV.s)

 a là giá trị hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính đã lập ở trên

 b là bậc tự do của đường hồi quy tuyến tính đã lập ở trên

 Mhk là khối lượng cân ban đầu của Hoàng kỳ (g)

 Mchk là khối lượng cân ban đầu của cốm Hoàng kỳ (g)

 Mbt là khối lượng cân ban đầu của cốm Bổ trung ích khí (g)

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Khảo sát chỉ tiêu định tính

3.1.1 Định tính các chất trong cốm Bổ trung ích khí bằng phản ứng hóa học

Kết quả định tính được trình bày tóm tắt ở bảng 3.1

3.1.2 Định tính cốm Bổ trung ích khí bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

3.1.2.1 Định tính so sánh cốm Bổ trung ích khí với dược liệu chuẩn Hoàng kỳ, AGS- IV bằng HPTLC

 Mẫu nghiên cứu:

Cốm Bổ trung ích khí: Nghiền nhỏ cốm, rây qua rây 500 Cân 3,0 g cốm vào bình

nón 100 ml có nút mài, thêm 30 ml methanol, khuấy kĩ, siêu âm 30 phút, lọc, cô dịch lọc tới cắn Hòa tan cắn vào trong 10ml ammoniac (10% v/v), để trong 10 phút, thỉnh thoảng lắc Chiết lỏng - lỏng với n-butanol 3 lần mỗi lần 15ml Gộp các dịch chiết n-butanol Cô cách thủy đến cắn, hòa tan cắn vào 2 ml methanol Dùng dịch này để chấm sắc kí

Hoàng kỳ chuẩn: Cân 2,0g bột Hoàng kỳ vào bình nón 100 ml có nút mài, thêm 20

ml methanol, khuấy kĩ, siêu âm 30 phút, lọc, cô dịch lọc tới cắn Hòa tan cắn vào trong 10ml ammoniac (10% v/v), để trong 10 phút, thỉnh thoảng lắc Chiết lỏng - lỏng với n-butanol 3 lần mỗi lần 10ml Gộp các dịch chiết n-butanol Cô cách thủy đến cắn, hòa tan cắn vào 2 ml methanol Dùng dịch này để chấm sắc kí

Chất chuẩn AGS- IV: cân 1mg chất chuẩn hoà tan trong 1ml methanol Dùng dịch

này để chấm sắc kí

 Tiến hành:

 Điều kiện sắc kí:

- Pha tĩnh: bản mỏng Silica gel 60 F254, 5×10 cm, hoạt hóa ở 1100C trong 60 phút

- Pha động: khảo sát trên các hệ dung môi sau:

(1) chloroform: methanol: H2O (65:35:10) (2) chloroform: methanol: H2O (65:25:5)

dung môi pha động Dung môi để khai triển bản mỏng là 25 ml Sấy khô bản mỏng trong 5 phút

Qua khảo sát lựa chọn hệ (II) cho cho kết quả hiện vết và tách vết tốt nhất

Kết quả được trình bày ở hình 3.1 và bảng 3.2

Bảng 3.2: Kết quả SKLM định tính Hoàng kỳ, cốm Bổ trung ích khí và AGS IV sau

khi phun thuốc thử hiện màu

Ghi chú: (-): Không có vết (+):Có vết (++):Vết đậm (+++): Vết rất đậm

 Nhận xét

Kết quả ở Bảng 3.2 và Hình 3.1 cho thấy: Trên sắc kí đồ quan sát ở ánh sáng thường sau

khi phun thuốc thử, các vết tách tốt và có vết tương đương với nhau Trong đó:

 Cốm có 8 vết, HK chuẩn có 9 vết, AGS IV có 1 vết

 Cốm và HK có 1 vết tương đương với AGS IV chuẩn ở Rf = 0,22

 Ngoài ra cốm còn 3 vết khác tương ứng với HK chuẩn (Rf = 0,25; Rf = 0,46; Rf

3.1.2.2 Định tính so sánh cốm Bổ trung ích khí với Đảng sâm bằng HPTLC

 Mẫu nghiên cứu:

Cốm Bổ trung ích khí: Nghiền nhỏ, rây qua rây 500 Cân 4,0 g cốm hòa vào bình

nón có mút mài 100ml, thêm 40 ml methanol, khuấy kĩ, siêu âm 30 phút, lọc, cô dịch lọc tới cắn Hòa tan cắn vào trong 20 ml nước cất Chiết lỏng-lỏng với n-butanol 3 lần mỗi lần 20ml Gộp các dịch chiết n-butanol Cô cách thủy đến cắn, hòa tan cắn vào 2 ml methanol được dung dịch chấm sắc kí

Đảng sâm chuẩn: Cân 4,0 g bột dược liệu, chiết bằng n-buthanol bão hoà trong

nước, siêu âm 1 giờ, lọc, cô dịch lọc tới cắn Hoà tan cắn trong 2 ml methanol được dung dịch chấm sắc kí

 Tiến hành:

- Điều kiện sắc kí:

+ Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel 60 F254, 5×10 cm, hoạt hóa ở 1100C trong 60 phút

+ Pha động: khảo sát trên các hệ dung môi sau:

 Kết quả:

Qua khảo sát lựa chọn hệ (II) cho cho kết quả hiện vết và tách vết tốt nhất

Kết quả được trình bày ở hình 3.2 và bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả SKLM định tính Đảng sâm, cốm, quan sát ở bước sóng 254 nm

Ghi chú: (-): Không có vết (+):Có vết (++): Vết đậm (+++): Vết rất đậm

 Nhận xét

Kết quả ở hình 3.2 và bảng 3.3 cho thấy: Trên sắc ký đồ quan sát ở bước sóng 254nm

các vết tách tốt và có vết tương ứng với nhau

Cốm có 5 vết trong đó có 1 vết tương ứng với Đảng sâm ở Rf = 0,78

Vết Rf Màu sắc

Mẫu nghiên cứu

Hình 3.2 Sắc ký đồ ĐT Đảng sâm, cốm ở bước sóng 254nm