Đánh giá tác dụng chống oxi hóa, bảo vệ tế bào gan in vitro và độc tính tiền lâm sàng của cao đặc tỏi khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU PHƯƠNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXI HÓA, BẢO VỆ TẾ BÀO GAN IN VITRO VÀ ĐỘC TÍNH TIỀN LÂM SÀNG CỦA CAO ĐẶC TỎI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU PHƯƠNG MÃ SINH VIÊN: 1801560 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXI HÓA, BẢO VỆ TẾ BÀO GAN IN VITRO VÀ ĐỘC TÍNH TIỀN LÂM SÀNG CỦA CAO ĐẶC TỎI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thu Hằng ThS Đỗ Văn Khái Nơi thực hiện: Bộ môn Dược lý HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thu Hằng, người thầy trực tiếp dẫn dắt, quan tâm, bảo, động viên em tạo điều kiện tốt cho em suốt trình nghiên cứu, thực đề tài Ở cô, em không học kiến thức chun mơn mà cịn dạy kỹ thực nghiệm phương pháp làm việc khoa học, hiệu Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Đỗ Văn Khái, người giúp đỡ, quan tâm theo sát em q trình thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Trần Hồng Linh, người thầy ln bên cạnh, nhiệt tình hướng dẫn, cho em lời khuyên quý báu trình làm thực nghiệm môn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến DS Nguyễn Thị Thủy, DS Cao Thị Cẩm Vân, DS Đinh Đại Độ bạn, em sinh viên tham gia nghiên cứu môn Dược lý bên cạnh sát cánh, hỗ trợ tận tình suốt trình thực đề tài để có kết cuối Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo dạy dỗ em suốt năm năm mái trường Đại học Dược nói chung mơn Dược lý nói riêng, thầy người truyền cảm hứng gương sáng cho chúng em lối sống đạo đức nghề nghiệp Và cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình đồng hành, ủng hộ, động viên Cảm ơn người bạn lắng nghe, chia sẻ, nỗ lực, trải qua kỉ niệm đáng quý Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thu Phương MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tổn thương gan 1.1.1 Gan chức gan 1.1.2 Cơ chế bệnh sinh số bệnh gan 1.1.3 Các phương pháp điều trị bệnh gan 1.1.4 Thuốc có nguồn gốc dược liệu điều trị bệnh gan 1.2 Tổng quan phương pháp in vitro đánh giá tác dụng chống oxi hóa bảo vệ tế bào gan 1.2.1 Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxi hóa in vitro 1.2.2 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro 13 1.3 Tổng quan dược liệu Tỏi 15 1.3.1 Tên khoa học: 15 1.3.2 Đặc điểm thực vật phân bố: 15 1.3.3 Bộ phận dùng công dụng 16 1.3.4 Thành phần hóa học: 16 1.3.5 Tác dụng dược lý 17 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Nguyên vật liệu thiết bị nghiên cứu 19 2.2.1 Động vật tế bào nghiên cứu 19 2.2.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị thí nghiệm 19 2.3 Nội dung nghiên cứu 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 21 2.4.1 Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxi hóa in vitro cao đặc tỏi 21 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro cao đặc tỏi 24 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu độc tính cao đặc tỏi 25 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 28 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1 Tác dụng chống oxi hóa in vitro cao đặc tỏi 29 3.1.1 Kết đánh giá khả bắt giữ gốc tự DPPH 29 3.1.2 Kết đánh giá khả bắt giữ gốc tự OH• 29 3.1.3 Kết đánh giá khả bắt giữ gốc tự ABTS•+ 30 3.1.4 Kết đánh giá khả tạo phức chelat với Fe2+ 30 3.1.5 Kết đánh giá khả khử Fe3+ theo phương pháp FRAP 31 3.1.6 Kết đánh giá khả chống oxi hóa tổng (TAC) 32 3.2 Tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro cao đặc tỏi 33 3.2.1 Đánh giá ảnh hưởng cao đặc tỏi lên khả sống sót tế bào HepG2 33 3.2.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro mơ hình gây độc tế bào CCl4 33 3.3 Kết xác định độc tính tiền lâm sàng cao đặc tỏi 34 3.3.1 Độc tính cấp 34 3.3.2 Độc tính bán trường diễn 34 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 43 4.1 Bàn luận tác dụng chống oxi hóa in vitro cao đặc tỏi 43 4.1.1 Bàn luận khả bắt giữ gốc tự DPPH cao đặc tỏi 43 4.1.2 Bàn luận khả bắt giữ gốc tự ABTS•+ cao đặc tỏi 43 4.1.3 Bàn luận khả bắt giữ gốc tự OH• cao đặc tỏi 44 4.1.4 Về khả chelat Fe2+ cao đặc tỏi 44 4.1.5 Về khả khử Fe3+ theo phương pháp FRAP cao đặc tỏi 45 4.1.6 Bàn luận khả chống oxi hóa tổng cao đặc tỏi 45 4.1.7 Bàn luận mối liên quan thành phần hóa học tác dụng chống oxi hóa cao đặc tỏi 45 4.2 Bàn luận tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro cao đặc tỏi 46 4.2.1 Ảnh hưởng cao đặc tỏi khả sống sót tế bào HepG2 46 4.2.2 Tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro cao đặc tỏi mơ hình gây độc tế bào gan CCl4 46 4.3 Bàn luận thử nghiệm độc tính 47 4.3.1 Độc tính cấp 47 4.3.2 Độc tính bán trường diễn 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 ABTS DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt ALT AST DILI Alanin transaminase Aspartate transaminase Tổn thương gan thuốc DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl HepG2 Liver hepatocellular cell HCT HGB Hematocrit Nồng độ hemoglobin GSH GPx MCV Glutathion dạng khử Glutathion peroxidase Thể tích trung bình hồng cầu PLT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazoliumbromid Tổ chức hợp tác phát triển kinh tế (Organization for Economic Cooperation and Development) Số lượng tiểu cầu ROS RBC Reactive oxygen species Số lượng hồng cầu WBC Số lượng bạch cầu MTT OECD DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1 Một số dược liệu bảo vệ tế bào gan Bảng 1.2 Một số phương pháp chống oxi hóa ống nghiệm 9-10 Bảng 1.3 Các tác nhân gây độc tế bào gan 15 Bảng 3.1 Giá trị IC50 cao đặc tỏi khả bắt giữ gốc tự DPPH Bảng 3.2 Giá trị IC50 cao đặc tỏi khả bắt giữ gốc tự OH • Bảng 3.3 Giá trị IC50 cao đặc tỏi khả bắt giữ gốc tự ABTS Bảng 3.4 Giá trị IC50 cao đặc tỏi khả chelat Fe Bảng 3.5 Giá trị IC50 cao đặc tỏi khả khử Fe 29 29-30 •+ 2+ 3+ 30 31 32 Bảng 3.6 Giá trị IC50 cao đặc tỏi khả chống oxi hóa tổng 33 Bảng 3.7 Tỷ lệ tế bào HepG2 sống sót ủ với cao đặc tỏi nồng độ 33 khác Bảng 3.8 Ảnh hưởng cao đặc tỏi tỷ lệ sống sót tế bào gây độc với tác nhân CCl4 33 Bảng 3.9 Kết thí nghiệm cho thử nghiệm độc tính cấp cao đặc tỏi 34 Bảng 3.10 Ảnh hưởng cao đặc tỏi đến thông số huyết học chuột 36 nhắt trắng Bảng 3.11 Ảnh hưởng cao đặc tỏi đến thông số sinh hóa chuột nhắt 37 trắng Bảng 3.12 Ảnh hưởng cao đặc tỏi đến tỉ lệ khối lượng quan so với khối lượng thể chuột nhắt 38 Bảng 3.13 Ảnh hưởng cao đặc tỏi đến mô bệnh học gan chuột nhắt đực 39 Bảng 3.14 Ảnh hưởng cao đặc tỏi đến mô bệnh học gan chuột nhắt 40 Bảng 3.15 Ảnh hưởng cao đặc tỏi đến mô bệnh học thận chuột nhắt đực 41 Bảng 3.16 Ảnh hưởng cao đặc tỏi đến mô bệnh học gan chuột nhắt 42 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Trang Hình 1.1 Ngun tắc phương pháp đánh giá khả bắt giữ gốc tự DPPH 11 Hình 1.2 Nguyên tắc phương pháp đánh giá khả khử Fe3+ 11 Hình 1.3 Nguyên tắc phương pháp đánh giá khả bắt giữ gốc tự ABTS•+ 11 Hình 1.4 Ngun tắc phương pháp đánh giá khả bắt giữ gốc tự 12 OH• Hình 1.5 Nguyên tắc phương pháp đánh giá khả chelat Fe2+ 12 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nội dung nghiên cứu 21 Hình 2.2 Quy trình xác định độc tính bán trường diễn 27 Hình 3.1 Đồ thị tuyến tính OD – Nồng độ Trolox (µg/ml) 31 Hình 3.2 Hàm lượng Tỏi – Tương đương Trolox (µg/ml) 32 Hình 3.3 Ảnh hưởng cao đặc tỏi lên khối lượng thể chuột nhắt đực 35 Hình 3.4 Ảnh hưởng cao đặc tỏi lên khối lượng thể chuột nhắt 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm gan bệnh lý gây nhiều tác nhân, dẫn tới hậu xơ gan, ung thư gan nguyên nhân dẫn tới gia tăng gánh nặng bệnh tật tử vong Các nguyên nhân hàng đầu gây bệnh gan toàn cầu viêm gan thuốc, viêm gan rượu, viêm gan nhiễm mỡ không rượu, viêm gan virus [45] Một nghiên cứu thay đổi dịch tễ học bệnh gan năm 2016 khu vực Đông Nam Á bao gồm Việt Nam có tỷ lệ nhiễm HBV HCV 3.8% 1.7% (giảm 29% 29.6% với năm 2006); tỷ lệ nhiễm bệnh gan rượu 1.9% (tăng 33.2% so với năm 2006); bệnh gan nguyên nhân khác chiếm 2% (tăng 29.7% so với năm 2006) Như vậy, HBV nguyên nhân gây bệnh gan khu vực Đơng Nam Á nhiên gan nhiễm mỡ rượu tổn thương gan thuốc ngày tăng dẫn đến gia tăng biến chứng xơ gan ung thư gan [105] Thống kê Tổ chức y tế giới năm 2020 cho thấy, tỷ lệ mắc ung thư gan Việt Nam nằm top quốc gia tỷ lệ tử vong ung thư gan nằm top 15 quốc gia cao giới [100] Các bệnh gan mối quan tâm sức khỏe cộng đồng phương pháp điều trị thông thường mang lại kết hạn chế với tác dụng phụ kèm theo Việc thiếu phương pháp điều trị hiệu số lượng bệnh nhân mắc bệnh gan ngày tăng đã thu hút quan tâm nghiên cứu thuốc điều trị mới, hiệu tác dụng khơng mong muốn Stress oxi hóa có vai trị lớn phát sinh bệnh lý gan Các nghiên cứu chứng minh vai trị stress oxi hóa bệnh gan nhiễm mỡ không rượu, bệnh gan thiếu máu cục bộ, bệnh gan rượu, xơ gan, viêm gan siêu vi tổn thương gan thuốc [64] Do vậy, liệu pháp chống oxi hóa có lợi việc kiểm soát bệnh gan hướng nghiên cứu phát triển thuốc điều trị bệnh gan Việt Nam với nguồn dược liệu đa dạng phong phú với y học cổ truyền có hệ thống lý luận chặt chẽ kinh nghiệm việc sử dụng thuốc phịng chữa bệnh Nhiều lồi dược liệu có tác dụng bảo vệ tế bào gan sử dụng dân gian để phòng điều trị bệnh lý gan diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria.), actiso (Cynara scolymus), nhân trần (Adenosma caeruleum),….[4] Tỏi (Allium sativum L.) trồng rộng rãi để làm gia vị làm thuốc [4] Tỏi có nhiều hợp chất hoạt tính sinh học, bao gồm hợp chất organosulfur, saponin, hợp chất phenolic polysacarit Các nghiên cứu Việt Nam giới cho thấy chiết xuất Tỏi có tác dụng chống oxi hóa, bảo vệ tim mạch, chống ung thư [21], [77], [93],[96],[106] nhiên có nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan Tỏi Nhằm xây dựng khoa học việc đánh giá tác dụng tiềm nghiên cứu phát triển thuốc bảo vệ tế bào gan từ Tỏi, nhóm nghiên cứu thực đề tài “Đánh giá tác dụng chống oxi hóa, bảo vệ tế bào gan in vitro độc tính tiền lâm sàng cao đặc tỏi” với mục tiêu sau: Đánh giá tác dụng chống oxi hóa in vitro cao đặc tỏi Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro cao đặc tỏi Xác định độc tính cấp độc tính bán trường diễn cao đặc tỏi CYP2E1 mạng lưới nội chất ty thể Nhiễm độc gan tạo hình thành gốc trichloromethyl (CCl3•), tricloromethyl peroxil (•OOCCl3) nhu mơ gan gây peroxid hóa màng tế bào, tổn thương ty thể cuối chết tế bào [33] Nhiều mức liều CCl4 khác tác giả khác giới sử dụng gây độc tế bào HepG2 0,4%; 1%; mM Để chọn mức liều phù hợp với điều kiện thí nghiệm Việt Nam, chúng tơi tiến hành khảo sát sơ mức liều CCl4 khác Sau khảo sát, nồng độ CCl4 0,06 mM có tỷ lệ ức chế tế bào 47,84% phù hợp để sử dụng nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan CCl4 gây trình sản xuất ROS phụ thuộc vào thời gian trình peroxi hóa lipid tế bào HepG2 phát tối đa sau thời gian ủ 24 [51] Do đó, tế bào HepG2 ủ với CCl4 0,06mM 24 để nghiên cứu tác dụng bảo vệ cao đặc tỏi chống lại độc tính CCl4 gây Sau 24h, khả sống tế bào giảm 47,84% xử lý với CCl4 0,06 mM (bảng 3.8) Sự có mặt cao đặc tỏi 3,125 - 12,5 µg/ ml làm giảm đáng kể tổn thương tế bào gây CCl4 Ở nồng độ 12,5 µg/ ml , tỷ lệ tế bào sống sót tăng 22,42% so với tế bào gây độc CCl4 Điều chứng minh cao đặc tỏi có tác dụng bảo vệ tế bào gan khỏi độc tính gây CCl4 Cơ chế gây độc CCl4 chủ yếu liên quan đến việc hình thành gốc tự ROS q trình peroxi hóa lipid Cao đặc tỏi có khả chống oxi hóa thông qua nhiều chế khác bắt giữ gốc tự do, tạo phức chelat với Fe2+, khử Fe3+ dẫn đến cao đặc tỏi có tác dụng bảo vệ tế bào gan theo chế chống lại tác nhân gây stress oxi hóa Nghiên cứu hóa thực vật gần cho thấy thành phần chiết xuất tỏi alliin, allicin Trong số nghiên cứu báo cáo, hợp chất organosulfur có nguồn gốc từ allicin như: ajoene, 1-Propylmercaptan (PM), dimethyl disulfide (DMDS), diallyl disulfide (DADS) propyl disulfide (PDS), 2,5-dimethylthiophene (DMT) tỏi làm tăng tỷ lệ sống sót có tác dụng bảo vệ tế bào gan HepG2 chống lại độc tế bào t-BHP gây [30], [19] Các hợp chất có khả tăng cường khả tồn tế bào cách ngăn chặn hình thành gốc oxi phản ứng (ROS) suy giảm glutathione tế bào [19], [30] Điều chứng minh tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro cao đặc tỏi có mối liên quan đến thành phần hợp chất organosulfur tác dụng chống oxi hóa chúng tỏi 4.3 Bàn luận thử nghiệm độc tính 4.3.1 Độc tính cấp Mục tiêu thử độc tính cấp nhằm cung cấp thông tin cho việc xếp loại mức độ độc thuốc, dự đoán triệu chứng dự kiến biện pháp điều trị ngộ độc cấp; thiết lập mức liều cho thử nghiệm độc tính tác dụng phạm vi an toàn thuốc nghiên cứu [82] Động vật thường sử dụng nghiên cứu độc 47 tính cấp lồi gặm nhấm Động vật giống thường nhạy cảm với độc tính thuốc nên lựa chọn thích hợp để xác định biểu độc tin ́ h cấ p Vì vâ ̣y, đô ̣ng vâ ̣t nghiên cứu đô ̣c tiń h cấ p chúng lựa cho ̣n là chuô ̣t nhắt cái Nghiên cứu sử dụng phương pháp thử độc tính cấp theo hướng dẫn OECD Bộ Y tế [7], [82] Trong thử nghiệm thăm dị, chúng tơi tiến hành thử nghiệm 10 chuột nhắt giống cái, chia thành nhóm uống cao đặc tỏi với liều tăng dần Kết thúc thử nghiệm thăm dò, xác định mức liều 60g/kg liều cao chuột dung nạp mà khơng gây chết chuột Thử nghiệm thức tiến hành dựa kết thử nghiệm thăm dò, tiến hành thử nghiệm thức mức liều 40 g/kg 60 g/kg Kết cho thấy chuột có biểu sinh lý bình thường, khơng có chuột tử vong sau cho chuột uống mẫu thử Như vậy, liều cao dùng thử độc tính cấp chuột nhắt trắng 60 g/kg gấp khoảng 120 lần so với liều thể tác dụng dược lý Như vậy, kết độc tính cấp cho thấy, cao đặc tỏi tương đối an tồn, khơng gây độc tính cấp nghiêm trọng động vật 4.3.2 Độc tính bán trường diễn Với mục đích đánh giá khả dung nạp động vật sau sử dụng mẫu thử nhiều lần, tiến hành đánh giá độc tính bán trường diễn cao đặc tỏi với liều lặp lại 28 ngày Nghiên cứu sử dụng mơ hình thử độc tính liều nhắc lại 28 ngày theo đường uống OECD thử nghiệm tiến hành chuột nhắt trắng hai giống đực [47] Nhóm nghiên cứu thử nghiệm với mức liều, liều 500 mg/kg (mức liều có tác dụng dược lý) liều 1500 mg/kg (gấp lần mức liều có tác dụng dược lý) Chuột uống cao đặc tỏi pha nước cất liên tục 28 ngày Sau ngày thứ 28, chuột lấy máu để làm xét nghiệm huyết học, sinh hóa mổ để quan sát đại thể vi thể quan So sánh đươ ̣c tiế n hành các nhóm chuô ̣t cùng giố ng để loa ̣i bỏ ảnh hưởng của giố ng biể u hiê ̣n đô ̣c tin ́ h bán trường diễn 4.2.2.1 Ảnh hưởng cao đặc tỏi lên thể trạng toàn thân, cân nặng chuột Tình tra ̣ng chung và cân nă ̣ng chuô ̣t phản ánh tình tra ̣ng sức khỏe của đô ̣ng vâ ̣t và là chỉ số đánh giá bắ t buô ̣c nghiên cứu đô ̣c tiń h bán trường diễn Theo dõi tình trạng chung chuột lô chứng lô uống chế phẩm thử suốt trình nghiên cứu cho thấy khơng có biểu bất thường, ăn uống hoạt động bình thường, phản xạ tốt với kích thích, mắt linh hoạt, niêm mạc hồng, lông mượt, không tiết chất nhầy mũi, miệng, nước tiểu khơng có bất thường, phân khô Trong 28 ngày, cân nặng chuột lô đực lô liều 1500mg/kg tăng khác biệt tăng trưởng khối lượng thể lô thử so với lô chứng giống Ở lô liều 500mg/kg, thời điểm tuần thứ khối lượng thể chuột tăng 12% có ý nghĩa so với lơ 48 chứng sau tuần cân nặng tăng chậm cân nặng tuần không khác biệt so với lô chứng Như nhìn chung cao đặc tỏi liều 500 mg/kg 1500 mg/kg khơng ảnh hưởng đến thể trạng tồn thân cân nặng chuột nhắt trắng 4.2.2.2 Ảnh hưởng cao đặc tỏi lên số huyết học Số lượng chất lượng tế bào máu phản ánh tình trạng quan tạo máu tiêu chí quan trọng để đánh giá độc tính thuốc Nếu mẫu thử có ảnh hưởng đến chức tạo máu trước hết sẽ làm thay đổ i thành phần máu Các số hồng cầu bao gồm số lượng hồng cầu (RBC), nồ ng đô ̣ hemoglobin (Hb), tỷ lê ̣ hematocrit (HCT) thể tích trung bình hờ ng cầ u (MCV) số phản ánh khả sinh hồng cầu tủy xương mà giúp đánh hình dạng chức hồng cầu máu Nhiều thuốc ảnh hưởng đến số lượng chất lượng bạch cầu Các số xét nghiệm số lượng bạch cầu (WBC) cho phép đánh giá hệ thống miễn dịch thể Nhiệm vụ tiểu cầu tham gia vào chế đông máu Thuốc làm tăng giảm số lượng tiểu cầu có ảnh hưởng đến q trình đơng máu Do xét nghiệm số lượng tiểu cầu cho phép xác định xác mức độ ảnh hưởng thuốc lên trình tạo tiểu cầu Kết nghiên cứu trình bày bảng 3.10 cho thấy thơng số huyết học lô dùng cao đặc tỏi khơng có khác biệt so với lơ chứng giống (p > 0,05) Như vậy, cao đặc tỏi liều 500 mg/kg 1500 mg/kg không ảnh hưởng đến chức phận tạo máu chuột nhắt trắng sau 28 ngày uố ng 4.2.2.3 Ảnh hưởng cao đặc tỏi chức gan Gan quan lớn thể có nhiều chức đặc biệt quan trọng như: chuyển hóa hóa sinh, tiêu hóa, khử độc loại bỏ sản phẩm chuyển hóa khỏi thể Bệnh lý gan gây tổn thương tế bào gan, gây tình trạng tắc mật suy giảm chức chuyển hóa gan Khi gan bị tổn thương làm thay đổi tính thấm màng tế bào, dẫn đến hoạt độ nhiều enzym máu tăng, đặc biệt enzym có nguồn gốc gan Do để đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan, người ta thường định lượng nồng độ enzym có nguồn gốc từ gan huyết Khi nồng độ enzym tăng chứng tỏ tế bào gan bị tổn thương Trong nghiên cứu định lượng AST ALT huyết thanh, enzym sử dụng rộng rãi đánh giá tổn thương tế bào gan Kết cho thấy nồng độ AST, ALT lơ khơng có khác biệt so với lơ chứng giống (p>0,05) Về tỉ lệ khối lượng gan so với khối lượng thể, khơng có khác biệt lô so với lô chứng giống Như vậy, thông số không cho thấy biểu độc tính chế phẩm nghiên cứu đến tổn thương tế bào gan 49 Gan có vai trị lớn chuyển hóa glucid, lipid, protid cho thể Định lượng protein toàn phần, cholesterol toàn phần, glucose giúp đánh giá chức chuyển hóa gan Kết nghiên cứu cho thấy khơng có khác biệt có ý nghĩa thông số cholesterol, glucose, protein máu lô thử so với lô chứng (p>0,05), cho thấy cao đặc tỏi không ảnh hưởng đến chức chuyển hóa lipid glucid gan 4.2.2.4 Ảnh hưởng cao đặc tỏi lên chức thận Thận quan đảm nhiệm nhiều chức sống thể Một thuốc vào thể, sau thực chức thận thải trừ thể Tuy nhiên, nhu mơ thận nhạy cảm với thuốc, thuốc có khả gây độc thận Chỉ số hóa sinh quan trọng để đánh giá chức thận creatinine huyết Creatinin lọc hoàn toàn qua cầu thận, không tái hấp thu tiết ống thận, khơng bị chuyển hóa thận Nồng độ creatinin huyết không phụ thuộc vào thể tích nước tiểu Đó sở để sử dụng creatinin làm xét nghiệm thăm dò chức lọc thận Kết nghiên cứu cho thấy, nồng độ creatinin mức liều nghiên cứu khơng có khác biệt so với lơ chứng hai giống (p>0,05) Về tỉ lệ khối lượng thận, khơng có khác biệt lơ so với lô chứng giống Như vậy, cao đặc tỏi liều 500 mg/kg 1500 mg/kg không ảnh hưởng đến chức thận 4.2.2.5 Ảnh hưởng cao đặc tỏi đến khối lượng quan Kết nghiên cứu cho thấy khối lượng quan tim, lách, phổi tất lô uống chế phẩm thử khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p>0,05) Như vậy, cao đặc tỏi mức liều 500mg/kg 1500mg/kg không ảnh hưởng đến khối lượng quan chuột Từ kết nghiên cứu độc tính bán trường diễn, nhận thấy cao tỏi độc tính sau 28 ngày thử nghiệm 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu, chúng tơi xin đưa số kết luận chính: Tác dụng chống oxi hóa in vitro cao đặc tỏi: Cao đặc tỏi có nhiều chế chống oxi hóa khác Mẫu cao đặc tỏi có khả tạo phức chelat với Fe2+ mạnh với IC50 =15,07 μg/ mL, chế chống oxi hóa trực tiếp quan trọng cao đặc tỏi Mẫu cao đặc tỏi có khả chống oxi hóa theo chế chuyển điện tử (ET) thể qua khả bắt giữ gốc tự ABTS•+ mạnh (IC50 = 228,7 μg/ mL) Ngồi ra, cao đặc tỏi cịn thể khả chống oxi hóa thơng qua chế bắt giữ gốc tự DPPH (IC50=1,21 mg/ml.), bắt giữ gốc tự OH• ( IC50 = 932,0 μg/ mL), khử Fe3+(hàm lượng 5000 μg/ mL cao đặc tỏi tương đương 354,12 μg/ mL Trolox), kháng oxi hóa tổng (IC50= 4438 μg/ml) Tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro cao đặc tỏi 2.1 Ảnh hưởng cao đặc tỏi khả sống tế bào HepG2: Cao đặc tỏi nồng độ 3,125 µg/mL; 6,25 µg/mL; 12,5 µg/mL khơng ảnh hưởng đến khả sống sót tế bào HepG2 2.2 Tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro cao đặc tỏi mơ hình gây độc tế bào gan CCl4 Cao đặc tỏi nồng độ 3,125 µg/mL; 6,25 µg/mL; 12,5 µg/mL có tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 khỏi tác nhân gây độc CCl4 0,06mM Tỉ lệ tế bào sống sót tăng 7,34%; 16,24% 24,42% so với lơ chứng bệnh Độc tính tiền lâm sàng cao đặc tỏi 3.1 Độc tính cấp Cao đặc tỏi liều 60g/kg chuột nhắt trắng (liều cao cho chuột uống chuột dung nạp được) liều gấp 120 lần liều có tác dụng dược lý, khơng gây biểu độc tính cho chuột 3.2 Độc tính bán trường diễn Cao đặc tỏi hai mức liều 500mg/kg (liều có tác dụng dược lý) 1500mg/kg (liều gấp lần liều có tác dụng dược lý) dùng lặp lại 28 ngày không ảnh hưởng đến thông số đánh giá: tình trạng chung, thơng số huyết học, thơng số sinh hóa (glucose, cholesterol, protein, AST, ALT), chức thận quan đại thể 51 KIẾN NGHỊ Nhằm khẳng định rõ tác dụng chống oxi hóa, bảo vệ tế bào gan cao đặc tỏi Chúng đưa số đề xuất sau: Tiếp tục nghiên cứu sâu tác dụng chế chống oxi hóa cao đặc tỏi mức độ tế bào Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng cao đặc tỏi thông số MDA, AST, ALT, GSH, LDH mơ hình gây độc tế bào HepG2 CCl4 Tiếp tục đánh giá ảnh hưởng cao đặc tỏi mơ hình gây độc tế bào tác nhân khác như: ethanol, paracetamol Đánh giá tác dụng chống oxi hóa, bảo vệ tế bào gan cao đặc tỏi mơ hình động vật thực nghiệm 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế, Hướng dẫn chẩn đoán điều trị bệnh viêm gan vi rút B 2019 Bộ Y Tế, Hướng dẫn chẩn đoán điều trị bệnh viêm gan vi rút C 2021 Bùi Đại, Nguyễn Văn Mùi, et al (2005), Bệnh học truyền nhiễm, Nhà xuất y học, pp 110-111 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất y học, pp 181-182 Mai Nguyễn Ngọc Trác (2020), "Nghiên cứu tác dụng dược lý theo hướng bảo vệ gan, thận Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack., Rubiaceae)", pp 1-150 Ngô Quý Châu (2012), Bệnh học nội khoa, Nhà xuất y học, pp 63-79 Nguyễn Ngô Quang, Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu 2015 p 6-20 Nguyễn Ngọc Quang (2012), "Đánh giá kết bước đầu viên Giải độc gan Tuệ Linh hỗ trợ điều trị viêm gan virus B mạn tính", pp 1-40 Nguyễn Thị Uyên (2019), "Nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan me rừng (Phyllanthus emblica L Euphorbiaceae) thực nghiệm", pp 1-90 10 Nguyễn Văn Rư, Phùng Thanh Hương (2020), Hóa sinh lâm sàng, Hà Nội, pp 79-116 11 Phạm Thái Xuyên, Nguyễn Mạnh Tuân (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam NXB Khoa học Kỹ thuật, pp 964-970 Tiếng Anh 12 Al Mamun, Nazmul Hasan, et al (2016), "Investigation on phytochemical content and antioxidant activity of locally grown garlic (Allium sativum L.) in Banglades", International Journal of Biology Research, 1(5), pp 37-42 13 Amorati R., Valgimigli L (2015), "Advantages and limitations of common testing methods for antioxidants", Free Radic Res, 49(5), pp 633-49 14 Aranda-Rivera Ana Karina, Cruz-Gregorio Alfredo, et al (2022), "RONS and 15 16 17 Oxidative Stress: An Overview of Basic Concepts", Oxygen, 2(4), pp 437-478 Arjun Kalra, Ekrem Yetiskul, et al (2022), "Physiology, Liver", pp 1-5 Bao X Q., Liu G T (2010), "Bicyclol protects HepG2 cells against D galactosamine-induced apoptosis through inducing heat shock protein 27 and mitochondria associated pathway", Acta Pharmacol Sin, 31(2), pp 219-26 C.Delgado-Montemayora, P.Cordero-Pérezb, et al (2015), "Models of hepatoprotective activity assessment", pp 1-16 18 Chandan B K., Saxena A K., et al (2007), "Hepatoprotective potential of Aloe barbadensis Mill against carbon tetrachloride induced hepatotoxicity", J Ethnopharmacol, 111(3), pp 560-6 19 Chiu C K., Chen T Y., et al (2016), "Protective effects of five allium derived organosulfur compounds against mutation and oxidation", Food Chem, 197(Pt A), pp 829-35 20 Dinkova-Kostova A T., Talalay P (2008), "Direct and indirect antioxidant properties of inducers of cytoprotective proteins", Mol Nutr Food Res, 52 Suppl 21 1, pp S128-38 Elosta A., Slevin M., et al (2017), "Aged garlic has more potent antiglycation 22 and antioxidant properties compared to fresh garlic extract in vitro", Sci Rep, 7, pp 39613 Faremi T Y., Suru S M., et al (2008), "Hepatoprotective potentials of 23 24 Phyllanthusamarus against ethanol-induced oxidative stress in rats", Food Chem Toxicol, 46(8), pp 2658-64 Gariani K., Jornayvaz F R (2021), "Pathophysiology of NASH in endocrine diseases", Endocr Connect, 10(2), pp R52-R65 Gou S H., He M., et al (2021), "Hepatoprotective effect of total flavonoids from Glycyrrhiza uralensis Fisch in liver injury mice", Nat Prod Res, 35(24), pp 6083-6087 25 26 27 28 29 30 31 Guguen-Guillouzo C., Guillouzo A (2010), "General review on in vitro hepatocyte models and their applications", Methods Mol Biol, 640, pp 1-40 Hwang D., Goo T W., et al (2020), "In Vitro Protective Effect of Paste and Sauce Extract Made with Protaetia brevitarsis Larvae on HepG2 Cells Damaged by Ethanol", Insects, 11(8), pp 2-15 Iris F F Benzie, J J Strain (1996), "The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a measure of ‘‘Antioxidant Power’’: The FRAP Assay", pp 70-76 János Fehér, Gabriella Lengyel (2012), "Silymarin in the Prevention and Treatment of Liver Diseases and Primary Liver Cancer", Current Pharmaceutical Biotechnology, 13, pp 210-217 Kamiloglu Senem, Sari Gulce, et al (2020), "Guidelines for cell viability assays", Food Frontiers, 1(3), pp 332-349 Kay H Y., Won Yang J., et al (2010), "Ajoene, a stable garlic by-product, has an antioxidant effect through Nrf2-mediated glutamate-cysteine ligase induction in HepG2 cells and primary hepatocytes", J Nutr, 140(7), pp 1211-9 Kester J E (2014), "Liver", Encyclopedia of Toxicology, pp 96-106 32 Kumar P., Nagarajan A., et al (2018), "Analysis of Cell Viability by the 33 Lactate Dehydrogenase Assay", Cold Spring Harb Protoc, 2018(6), pp 1-15 L.X Le, L.K.T Huynh, et al (2016), "Study on hepatoprotective effect of 34 Moringa oleifera Lam leaves to prevent hepatocyte lesion induced by CCl4 in the HepG2 cell line", pp 1-10 Lakshmi T., Sri Renukadevi B., et al (2018), "Seed and bark extracts of Acacia catechu protects liver from acetaminophen induced hepatotoxicity by modulating oxidative stress, antioxidant enzymes and liver function enzymes in 35 Wistar rat model", Biomed Pharmacother, 108, pp 838-844 Le L V., Blach S., et al (2022), "Progress towards achieving viral hepatitis B 36 and C elimination in the Asia and Pacific region: Results from modelling and global reporting", Liver Int, 42(9), pp 1930-1934 Lee S J., Oh P S., et al (2006), "Hepatoprotective and hypolipidaemic effects 37 38 of glycoprotein isolated from Gardenia jasminoides ellis in mice", Clin Exp Pharmacol Physiol, 33(10), pp 925-33 Lee S K., Choi J Y., et al (2023), "An Immunological Perspective on the Mechanism of Drug Induced Liver Injury: Focused on Drugs for Treatment of Hepatocellular Carcinoma and Liver Transplantation", Int J Mol Sci, 24(5), pp 1-6 Liang F., Fang Y., et al (2018), "Attenuation of tert-Butyl Hydroperoxide ( tBHP)-Induced Oxidative Damage in HepG2 Cells by Tangeretin: Relevance of 39 40 41 42 43 the Nrf2-ARE and MAPK Signaling Pathways", J Agric Food Chem, 66(25), pp 6317-6325 Liang N., Kitts D D (2015), "Role of Chlorogenic Acids in Controlling Oxidative and Inflammatory Stress Conditions", Nutrients, 8(1), pp 1-20 Lima C F., Fernandes-Ferreira M., et al (2006), "Phenolic compounds protect HepG2 cells from oxidative damage: relevance of glutathione levels", Life Sci, 79(21), pp 2056-68 Lister I N E., Ginting C N., et al (2019), "Hepatoprotective effect of Eugenol on Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity in HepG2 cells", Journal of Physics: Conference Series, 1374(1), pp 1-20 Liu F P., Ma X., et al (2016), "Hepatoprotective effects of Solanum nigrum against ethanol-induced injury in primary hepatocytes and mice with analysis of glutathione S-transferase A1", J Chin Med Assoc, 79(2), pp 65-71 Meriga B., Mopuri R., et al (2012), "Insecticidal, antimicrobial and antioxidant activities of bulb extracts of Allium sativum", Asian Pac J Trop Med, 5(5), pp 391-5 44 Munteanu I G., Apetrei C (2021), "Analytical Methods Used in Determining 45 Antioxidant Activity: A Review", Int J Mol Sci, 22(7), pp 1-30 Muriel P (2017), "The Liver", Liver Pathophysiology, pp 3-22 46 Nagalekshmi R., Menon A., et al (2011), "Hepatoprotective activity of Andrographis paniculata and Swertia chirayita", Food Chem Toxicol, 49(12), pp 3367-73 47 OECD (2008), "OECD GUIDELINES FOR THE TESTING OF CHEMICALS", 407, pp 1-13 48 Okada Y., Tanaka K., et al (2006), "Kinetic and mechanistic studies of allicin as an antioxidant", Org Biomol Chem, 4(22), pp - 4113 49 Olsvik P A., Kristensen T., et al (2005), "mRNA expression of antioxidant enzymes (SOD, CAT and GSH-Px) and lipid peroxidative stress in liver of Atlantic salmon (Salmo salar) exposed to hyperoxic water during 50 51 smoltification", Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol, 141(3), pp 31423 Palabiyik S S., Karakus E., et al (2016), "The protective effects of carvacrol and thymol against paracetamol-induced toxicity on human hepatocellular carcinoma cell lines (HepG2)", Hum Exp Toxicol, 35(12), pp 1252-1263 Pareek Anil, Godavarthi Ashok, et al (2013), "Antioxidant and hepatoprotective activity of Fagonia schweinfurthii (Hadidi) Hadidi extract in carbon tetrachloride induced hepatotoxicity in HepG2 cell line and rats", 52 53 54 55 Journal of Ethnopharmacology, 150(3), pp 973-981 Park S., Zhang T., et al (2020), "A mixture of mulberry and silk amino acids protected against D-galactosamine induced acute liver damage by attenuating oxidative stress and inflammation in HepG2 cells and rats", Exp Ther Med, 19(6), pp 3611-3619 Pilar Prieto, Manuel Pineda, et al (1999), "Spectrophotometric Quantitation of Antioxidant Capacity through the Formation of a Phosphomolybdenum Complex: Specific Application to the Determination of Vitamin E", pp 1-10 Roberta Re, Nicolleta Pelledrini, et al (1998), "Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay", Free Radical Biology & Medicine, 26, pp 1231–1237 S Surendran, M Bavani Eswaran, et al (2011), "In vitro and in vivo hepatoprotective activity of Cissampelos pareira against carbon-tetrachloride induced hepatic damage", Indian Journal of Experimental Biology, Vol 49, pp pp 939-945 56 Santos J S., Alvarenga Brizola V R., et al (2017), "High-throughput assay comparison and standardization for metal chelating capacity screening: A proposal and application", Food Chem, 214, pp 515-522 57 Sari Y., Aktas A., et al (2018), "Novel N-propylphthalimide- and 4vinylbenzyl-substituted benzimidazole salts: Synthesis, characterization, and determination of their metal chelating effects and inhibition profiles against acetylcholinesterase and carbonic anhydrase enzymes", J Biochem Mol Toxicol, 32(1), pp 1-11 58 Sato Y., Itagaki S., et al (2011), "In vitro and in vivo antioxidant properties of chlorogenic acid and caffeic acid", Int J Pharm, 403(1-2), pp 8-136 59 Seitz H K., Bataller R., et al (2018), "Alcoholic liver disease", Nat Rev Dis Primers, 4(1), pp 16 Sharififar Fariba, Dehghn-Nudeh Gholamreza, et al (2009), "Major flavonoids 60 61 62 with antioxidant activity from Teucrium polium L", Food Chemistry, 112(4), pp 885-888 Sharma V., Kaur R., et al (2021), "Ameliorative potential of Adhatoda vasica against anti-tubercular drugs induced hepatic impairments in female Wistar rats in relation to oxidative stress and xeno-metabolism", J Ethnopharmacol, 270, pp 113-771 She Xingxing, Wang Fei, et al (2015), "In vitroantioxidant and protective effects of corn peptides on ethanol-induced damage in HepG2 cells", Food and 63 64 65 66 67 Agricultural Immunology, 27(1), pp 99-110 Shen Ting, Li Xueqin, et al (2015), "Hepatoprotective effect of phenylethanoid glycosides from Incarvillea compacta against CCl4-induced cytotoxicity in HepG2 cells", Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 58(4), pp 617-625 Singal A K., Jampana S C., et al (2011), "Antioxidants as therapeutic agents for liver disease", Liver Int, 31(10), pp 48-1432 Sudhakar Chekuri, B Arunjyothi, et al (2018), "RADICAL SCAVENGING ACTIVITY (2, 2-DIPHENYL-1- PICRYLHYDRAZYL) OF ACALYPHA INDICA LINN (EUPHORBEACE FAMILY)", International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 9(1), pp 1-20 Sunitha, Dontha (2016), "A Review on Antioxidant Methods", Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, pp 1-10 Teofilović Branislava, Tomas Ana, et al (2021), "Antioxidant and hepatoprotective potential of sweet basil (Ocimum basilicum L.) extract in acetaminophen-induced hepatotoxicity in rats", Journal of Functional Foods, 68 87, pp 1-11 Thirumalai T., David E., et al (2011), "Restorative effect of Eclipta alba in 69 CCl4 induced hepatotoxicity in male albino rats", Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 1(4), pp 304-307 Thitimuta S., Pithayanukul P., et al (2017), "Camellia sinensis L Extract and Its Potential Beneficial Effects in Antioxidant, Anti-Inflammatory, AntiHepatotoxic, and Anti-Tyrosinase Activities", Molecules, 22(3), pp 2-12 70 71 Tigu A B., Moldovan C S., et al (2021), "Phytochemical Analysis and In Vitro Effects of Allium fistulosum L and Allium sativum L Extracts on Human Normal and Tumor Cell Lines: A Comparative Study", Molecules, 26(3), pp 1-11 Torun A N., Kulaksizoglu S., et al (2009), "Serum total antioxidant status and 72 lipid peroxidation marker malondialdehyde levels in overt and subclinical hypothyroidism", Clin Endocrinol (Oxf), 70(3), pp 74-469 Wang L., Pan X., et al (2022), "The Biological Activity Mechanism of Chlorogenic Acid and Its Applications in Food Industry: A Review", Front Nutr, 9, pp 911-943 73 Wei HUANG, Han LI, et al (2019), "Protective Effect and Mechanism of Tetramethylpyrazine Against t-BHP-induced PC12 Cell Injury / 中国实验方剂 学杂志", pp 1-11 74 75 76 77 78 Xu H., Xiao P., et al (2022), "Epidemic characteristics of alcohol-related liver disease in Asia from 2000 to 2020: A systematic review and meta-analysis", Liver Int, 42(9), pp 1991-1998 Yang L., Wang C Z., et al (2011), "Hepatoprotective effects of polyprenols from Ginkgo biloba L leaves on CCl4-induced hepatotoxicity in rats", Fitoterapia, 82(6), pp 834-40 Ye H., Nelson L J., et al (2018), "Dissecting the molecular pathophysiology of drug-induced liver injury", World J Gastroenterol, 24(13), pp 1373-1385 Younossi Z M., Koenig A B., et al (2016), "Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes", Hepatology, 64(1), pp 73-84 Yu Yue-cheng, Mao Yi-min, et al (2017), "CSH guidelines for the diagnosis and treatment of drug-induced liver injury", Hepatology International, 11(3), pp 221-241 79 Zeilinger K., Freyer N., et al (2016), "Cell sources for in vitro human liver cell 80 culture models", Exp Biol Med (Maywood), 241(15), pp 1684-98 Zhang T., Li Y., et al (2011), "Purification and characterisation of a new 81 antioxidant peptide from chickpea (Cicer arietium L.) protein hydrolysates", Food Chem, 128(1), pp 28-33 Zhou Q., Wang L., et al (2021), "Tricoumaroylspermidine from rose exhibits inhibitory activity against ethanol-induced apoptosis in HepG2 cells", Food Funct, 12(13), pp 5892-5902 82 83 OECD (2002), Test No 420: Acute Oral Toxicity - Fixed Dose Procedure, pp Boligon Aline Augusti (2014), "Technical Evaluation of Antioxidant Activity", 84 Medicinal Chemistry, 4(7), pp.2-10 Borlinghaus J., Albrecht F., et al (2014), "Allicin: chemistry and biological properties", Molecules, 19(8), pp 12591-618 85 86 87 Chung Lip Yong (2006), "The Antioxidant Properties of Garlic Compounds: Allyl Cysteine, Alliin, Allicin, and Allyl Disulfide", JOURNAL OF MEDICINAL FOOD, pp 205-213 Diretto G., Rubio-Moraga A., et al (2017), "Tissue-Specific Accumulation of Sulfur Compounds and Saponins in Different Parts of Garlic Cloves from Purple and White Ecotypes", Molecules, 22(8), pp.2-15 Donato María Teresa, Tolosa Laia, et al (2015), "Culture and Functional Characterization of Human Hepatoma HepG2 Cells", Protocols in In Vitro 88 89 90 91 Hepatocyte Research, pp 77-93 Drobiova H., Thomson M., et al (2011), "Garlic increases antioxidant levels in diabetic and hypertensive rats determined by a modified peroxidase method", Evid Based Complement Alternat Med, 2011, pp 703049 El-Saber Batiha G., Magdy Beshbishy A., et al (2020), "Chemical Constituents and Pharmacological Activities of Garlic (Allium sativum L.): A Review", Nutrients, 12(3), pp.1-11 European Association for the Study of the Liver Electronic address easloffice easloffice eu, Clinical Practice Guideline Panel Chair, et al (2019), "EASL Clinical Practice Guidelines: Drug-induced liver injury", J Hepatol, 70(6), pp 1222-1261 European Association for the Study of the Liver Electronic address easloffice easloffice eu, European Association for the Study of the Liver (2018), "EASL Clinical Practice Guidelines: Management of alcohol-related liver disease", J Hepatol, 69(1), pp 154-181 92 Furger C (2021), "Live Cell Assays for the Assessment of Antioxidant 93 Activities of Plant Extracts", Antioxidants (Basel), 10(6), pp.1-11 Jang H J., Lee H J., et al (2018), "Antioxidant and antimicrobial activities of 94 fresh garlic and aged garlic by-products extracted with different solvents", Food Sci Biotechnol, 27(1), pp 219-225 Liu Jian, Guo Wei, et al (2018), "Investigation of the dynamic changes in the chemical constituents of Chinese “Laba” garlic during traditional processing", RSC Advances, 8(73), pp 41872-41883 95 96 97 98 Mukhopadhyay Debanjan, Dasgupta Pinakpani, et al (2016), "A Sensitive In vitro Spectrophotometric Hydrogen Peroxide Scavenging Assay using 1,10Phenanthroline", Free Radicals and Antioxidants, 6(1), pp 124-132 Myneni A A., Chang S C., et al (2016), "Raw Garlic Consumption and Lung Cancer in a Chinese Population", Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 25(4), pp 624-33 Nagella Praveen, Thiruvengadam Muthu, et al (2014), "Composition of Polyphenols and Antioxidant Activity of Garlic Bulbs Collected from Different Locations of Korea", Asian Journal of Chemistry, 26(3), pp 897-902 Nimse Satish Balasaheb, Pal Dilipkumar (2015), "Free radicals, natural antioxidants, and their reaction mechanisms", RSC Advances, 5(35), pp 2798628006 99 100 101 102 103 104 Rahman Mohammad Shafiur (2007), "Allicin and Other Functional Active Components in Garlic: Health Benefits and Bioavailability", International Journal of Food Properties, 10(2), pp 245-268 Rumgay H., Arnold M., et al (2022), "Global burden of primary liver cancer in 2020 and predictions to 2040", J Hepatol, 77(6), pp 1598-1606 Shang A., Cao S Y., et al (2019), "Bioactive Compounds and Biological Functions of Garlic (Allium sativum L.)", Foods, 8(7), pp.1-11 Sun Y E., Wang W (2018), "Changes in nutritional and bio-functional compounds and antioxidant capacity during black garlic processing", J Food Sci Technol, 55(2), pp 479-488 Wallock-Richards D., Doherty C J., et al (2014), "Garlic revisited: antimicrobial activity of allicin-containing garlic extracts against Burkholderia cepacia complex", PLoS One, 9(12), pp e112726 Wojtunik-Kulesza K A (2020), "Approach to Optimization of FRAP Methodology for Studies Based on Selected Monoterpenes", Molecules, 25(22), pp.1-10 105 Wong M C S., Huang J L W., et al (2019), "The changing epidemiology of liver diseases in the Asia-Pacific region", Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 16(1), pp 57-73 106 Zhou Y., Li Y., et al (2016), "Dietary Natural Products for Prevention and Treatment of Liver Cancer", Nutrients, 8(3), pp 156