Trần thị quỳnh đánh giá ảnh hưởng của kích thước tiểu phân đến sự hòa tan in vitro, in vivo trên mắt thỏ của hỗn dịch mangiferin khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ QUỲNH ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA KÍCH THƯỚC TIỂU PHÂN ĐẾN SỰ HÒA TAN IN VITRO, IN VIVO TRÊN MẮT THỎ CỦA HỖN DỊCH MANGIFERIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ QUỲNH Mã sinh viên: 1801602 ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA KÍCH THƯỚC TIỂU PHÂN ĐẾN SỰ HÒA TAN IN VITRO, IN VIVO TRÊN MẮT THỎ CỦA HỖN DỊCH MANGIFERIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đào Văn Nam TS Vũ Thị Hồng Hạnh Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa lý Khoa Bào chế - Cơng nghệ dược phẩm HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Đào Văn Nam, TS Vũ Thị Hồng Hạnh TS Võ Quốc Ánh tận tình hướng dẫn, quan tâm, dạy, luôn tạo động lực, động viên giúp đỡ em suốt thời gian thực khóa luận, giúp em trang bị, tích lũy thêm nhiều kiến thức, kĩ vô quý giá Em xin trân trọng cảm ơn tất thầy cô, anh chị kĩ thuật viên Bộ mơn Hóa lý nói riêng, Khoa Bào chế - Cơng nghệ Dược phẩm nói chung Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia, Khoa Dược lý – Dược lâm sàng tạo điều kiện giúp đỡ để em thực hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Phòng Đào tạo phòng ban, thầy cô, cán nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội dạy bảo, tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình học tập, nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn đến chị Lương Thị Thu Hà, bạn Nguyễn Trung Khoa anh chị, bạn em nhóm nghiên cứu Bộ mơn Hóa lý, Bộ mơn Bào chế Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đồng hành, giúp đỡ em suốt trình làm thực nghiệm Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân ln ủng hộ, động viên em năm tháng học tập rèn luyện trường Đại học Dược Hà Nội Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Trần Thị Quỳnh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan mangiferin 1.1.1 Nguồn gốc, đặc điểm hóa lý dược động học 1.1.2 Tác dụng dược lý 1.1.3 Một số chế phẩm thị trường 1.2 Tổng quan thuốc nhỏ mắt 1.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng sinh khả dụng thuốc mắt 1.2.2 Một số biện pháp kéo dài thời gian lưu thuốc mắt 1.2.3 Một số phương pháp xác định thời gian lưu thuốc mắt 1.3 Thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học 11 1.3.1 Các tiêu chí chung 11 1.3.2 Các tiêu chí khác 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 14 2.1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất 14 2.1.2 Thiết bị 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Phương pháp bào chế 15 2.3.2 Phương pháp điều chỉnh đo áp suất thẩm thấu 16 2.3.3 Phương pháp xác định kích thước tiểu phân 16 2.3.4 Phương pháp xác định đặc tính lưu biến 17 2.3.5 Phương pháp quét nhiệt lượng vi sai 17 2.3.6 Phương pháp phân tích nhiễu xạ tia X 18 2.3.7 Phương pháp phân tích quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier 18 2.3.8 Phương pháp định lượng 19 2.3.9 Phương pháp đánh giá hòa tan dược chất in vitro 22 2.3.10 Phương pháp đánh giá hòa tan dược chất in vivo 23 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Bào chế đánh giá số đặc tính hóa lý hỗn dịch mangiferin 24 3.1.1 Bào chế hỗn dịch mangiferin 24 3.1.2 Đánh giá đặc tính hóa lý hỗn dịch MF % 25 3.2 Phương pháp định lượng mangiferin nước mắt thỏ 31 3.2.1 Xây dựng phương pháp 31 3.2.2 Thẩm định phương pháp 33 3.3 Đánh giá khả hòa tan dược chất in vitro từ hỗn dịch 37 3.3.1 Độ lặp lại phương pháp đánh giá 37 3.3.2 Ảnh hưởng kích thước tiểu phân MF đến hịa tan dược chất in vitro 37 3.3.3 Ảnh hưởng thành phần cơng thức đến hịa tan dược chất in vitro 38 3.4 Đánh giá ảnh hưởng kích thước tiểu phân thành phần hỗn dịch đến khả hòa tan dược chất in vivo mắt thỏ 39 3.4.1 Thí nghiệm tiền khả thi 39 3.4.2 Ảnh hưởng KTTP thành phần HD đến hòa tan dược chất in vivo mắt thỏ 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu AcOH ACN ASTT CT DSC FDA FTIR HD HPLC HPLC – MS/MS HPMC HSV IS ICH kl/kl KTTP KHV LLOQ MeOH MF MP PTFE PMDA PL RSD SD TB UPLC – MS/MS v/v XRD Ý nghĩa Acid acetic Acetonitril Áp suất thẩm thấu Công thức Quét nhiệt lượng vi sai (Differential scanning calorimetry) Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (Fourier Transform Infrared) Hỗn dịch Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry) Hydroxypropyl methylcellulose Herpes simplex virus Chất chuẩn nội (Internal Standard) Hội nghị quốc tế hài hịa hóa thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho người (The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use) Khối lượng/Khối lượng Kích thước tiểu phân Kính hiển vi Giới hạn định lượng (Lower limit of quantication) Methanol Mangiferin Pha động (Mobile phase) Polytetrafluoroethylen Cơ quan Dược phẩm thiết bị Y tế (Pharmaceuticals and Medical Devices Agency) Phụ lục Độ lệch chuẩn tương đối (relative standard deviation) Độ lệch chuẩn (standard deviation) Trung bình Ultra – High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry Thể tích/Thể tích Nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu, hóa chất dùng thực nghiệm 14 Bảng 2.2 Các thiết bị dùng thực nghiệm 14 Bảng 3.1 Công thức dịch nghiền MF 10 % 24 Bảng 3.2 Thông số kỹ thuật quy trình nghiền bi 24 Bảng 3.3 Phân bố KTTP nguyên liệu MF dịch nghiền CT 1, CT 2, CT 24 Bảng 3.4 Công thức hỗn dịch MF % 25 Bảng 3.5 Kết đánh giá hình thức, pH, áp suất thẩm thấu hỗn dịch bào chế 25 Bảng 3.6 Phân bố kích thước tiểu phân mẫu placebo HD 1, 2, 26 Bảng 3.7 Kết đánh giá đặc tính lưu biến HD MF % 27 Bảng 3.8 Các đỉnh hấp thụ tương ứng với dao động nhóm chức 30 Bảng 3.9 Độ tìm lại MF sử dụng dung môi chiết khác (n= 3) 32 Bảng 3.10 Độ tìm lại MF chiết mẫu cách siêu âm lắc vortex (n= 3) 33 Bảng 3.11 Kết khảo sát độ tuyến tính 34 Bảng 3.12 Kết khảo sát độ độ lặp lại (n = 5) 35 Bảng 3.13 Kết định lượng MF chiết từ giấy thấm nước mắt mức nồng độ (n = 3) 36 Bảng 3.14 Kết định lượng MF mẫu thử độ ổn định (n = 4) 36 Bảng 3.15 Kết định lượng nồng độ MF nước mắt HD 1, 2, 3, 6, (n=3) 40 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức hóa học mangiferin Hình 1.2 Kĩ thuật huỳnh quang để theo dõi lưu thuốc mắt Hình 1.3 Sơ đồ dùng ống thẩm tích để đánh giá nồng độ thuốc thủy dịch Hình 1.4 Các phương pháp lẫy mẫu nước mắt khác nhau, A: dùng ống mao quản; B: dùng Schirmer strips; C: dùng thấm mắt (Ophthalmic sponges) 10 Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo thiết bị mô thiết bị nghiền bi có cánh khuấy 15 Hình 2.2 Sơ đồ cấu tạo thiết bị thử giải phóng kiểu dịng chảy 22 Hình 3.1 Hình ảnh soi kính hiển vi vật kính 40, thang đo μm mẫu dịch nghiền MF: A CT 1; B CT 2; C CT 3; D Nguyên liệu MF 24 Hình 3.2 Hình ảnh soi kính hiển vi vật kính 10, thang đo 100 μm mẫu A HD 1; B HD 2; C HD 26 Hình 3.3 Phân bố kích thước tiểu phân theo thể tích mẫu placebo (carbopol 974P); HD 1; HD 2; HD 26 Hình 3.4 Đồ thị thể thay đổi độ nhớt theo tốc độ trượt HD MF % 27 Hình 3.5 Giản đồ phân tích nhiệt lượng vi sai mẫu A nguyên liệu MF; B CT 1; C CT 2; D CT 28 Hình 3.6 Phổ nhiễu xạ tia X mẫu nguyên liệu MF, CT 1, CT 2, CT 29 Hình 3.7 Phổ hồng ngoại mẫu HD 1, HD 2, HD 30 Hình 3.8 Đồ thị thể tương quan tuyến tính khối lượng MF giấy thấm nước mắt diện tích píc tương ứng sắc ký đồ 35 Hình 3.9 Đồ thị thể khả hòa tan MF theo thời gian HD (n=3) 37 Hình 3.10 Đồ thị thể khả hòa tan MF theo thời gian HD 1, 2, 37 Hình 3.11 Đồ thị thể khả hịa tan MF từ hỗn dịch chứa loại nồng độ polyme khác 38 Hình 3.12 Đồ thị thể nồng độ MF nước mắt thỏ theo thời gian HD 39 Hình 3.13 A, B Sắc ký đồ phổ hấp thụ UV đỉnh píc MF mẫu thử in vivo HD thời điểm sau nhỏ thuốc; C, D Sắc ký đồ phổ hấp thụ UV đỉnh píc MF mẫu chuẩn MF nồng độ 10 μg/mL MeOH:AcOH 0,6% (35 : 65 v/v) 40 Hình 3.14 A Đồ thị nồng độ MF nước mắt thỏ theo thời gian sau nhỏ 30 µL HD 1, HD 2, HD 3; B Nồng độ thuốc nước mắt thỏ thời điểm phút; C Nồng độ thuốc nước mắt thỏ thời điểm 10 phút sau nhỏ thuốc 41 Hình 3.15 A Đồ thị nồng độ MF nước mắt thỏ theo thời gian sau nhỏ 30 µL HD 1, HD 6, HD 7; B Nồng độ thuốc nước mắt thỏ thời điểm phút; C Nồng độ thuốc nước mắt thỏ thời điểm 10 phút sau nhỏ thuốc 42 ĐẶT VẤN ĐỀ Herpes simplex virus (HSV) gồm có hai chủng HSV-1 HSV-2 thường gây nhiễm trùng quan da, mắt, miệng, môi, tổ chức thần kinh phận sinh dục Nhiễm HSV mắt nghiêm trọng gây mù mắt tổn thương vĩnh viễn mắt HSV tồn thể tiềm ẩn tái gây bệnh gặp điều kiện thuận lợi Acyclovir thuốc đầu tay điều trị herpes mắt, nhiên thuốc khơng có tác dụng với HSV thể tiềm ẩn nên bệnh nhân bị tái nhiễm sau khỏi bệnh Thêm vào đó, xuất chủng virus kháng acyclovir đặt yêu cầu cấp thiết việc tìm kiếm thuốc thay acyclovir [38] Mangiferin hợp chất tự nhiên chiết xuất từ xoài, có tác dụng dược lý kháng virus herpes bật, có tính an tồn cao số dược chất chủ động nguồn cung nước Hiện nay, mangiferin chiết xuất thành nguyên liệu bào chế thành thuốc điều trị HSV mắt Tuy nhiên, việc điều trị bệnh mắt nói chung gặp nhiều thách thức thuốc đến mắt dùng đường toàn thân thuốc nhỏ mắt bị rửa trơi nhanh chóng vài phút chớp mắt tiết nước mắt Mangiferin có đặc tính tan kém, thấm nên việc nghiên cứu làm tăng sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt chứa mangiferin cần thiết [16] Bào chế thuốc dạng hỗn dịch với kích thước tiểu phân phù hợp làm tăng thời gian lưu thuốc mắt, làm tăng sinh khả dụng thuốc Tác giả Lương Thị Thu Hà [5] sử dụng kĩ thuật nghiền ướt để giảm kích thước tiểu phân mangiferin đánh giá ảnh hưởng số yếu tố đến kích thước tiểu phân dược chất Nhằm góp phần phát triển chế phẩm hỗn dịch nhỏ mắt mangiferin, thực đề tài “Đánh giá ảnh hưởng kích thước tiểu phân đến hịa tan in vitro, in vivo mắt thỏ hỗn dịch mangiferin” với mục tiêu sau: Bào chế hỗn dịch mangiferin có kích thước tiểu phân khác Đánh giá ảnh hưởng kích thước tiểu phân số thành phần đến đặc tính hóa lý hỗn dịch Bước đầu đánh giá ảnh hưởng kích thước tiểu phân thành phần polyme hỗn dịch đến hòa tan dược chất in vitro in vivo CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan mangiferin 1.1.1 Nguồn gốc, đặc điểm hóa lý dược động học Hình 1.1 Cơng thức hóa học mangiferin Cơng thức phân tử: C19H18O11 Khối lượng phân tử: 422,2 g/mol Tên khoa học: 2-C-β-D–glucopyranozido-1,3,6,7-tetrahydroxyxanthon [4] Mangiferin (MF) phân lập lần từ xoài Mangifera indica L thuộc họ Đào lộn hột (Anacardiaceae) Đây lồi có chứa hàm lượng phần trăm MF cao [15], [26] Ở nước ta, xoài trồng phổ biến khắp miền Nam [9] MF phân lập từ xoài phương pháp chiết hồi lưu chiết siêu âm Ngoài ra, MF cịn tìm thấy nhiều lồi thực vật khác với phần trăm hàm lượng khác như: Anemmarhena asphodeloides, Aphloia theiformis,… [43] Tính chất hóa lý - Cảm quan: bột kết tinh mịn, màu vàng ánh lục, gần không mùi - Độ tan: tan hỗn hợp aceton – nước (1 : 1), thực tế không tan nước, ethanol 96 % cloroform [4] - Nhiệt độ nóng chảy MF khan: 271oC [15] - Mangiferin đa acid yếu, giá trị pKa 6,52; 7,97; 9,44; 12,10 [22] Đặc điểm dược động học Mangiferin có tính thân nước thân dầu kém, khả thấm qua niêm mạc đường tiêu hóa hấp thu qua đường uống thấp [16] Khi uống liều 0,9 g, nồng độ MF huyết tương đạt 38,64 ± 6,75 ng/mL sau giờ, thời gian bán thải 7,85 ± 1,72 khơng có biểu tác dụng không mong muốn tình nguyện viên [23] Dược động học MF liều 10 - 30 mg/kg cho thấy mối quan hệ tuyến tính, liều 30 - 100 mg/kg cho thấy mối quan hệ phi tuyến tính [27] MF qua hàng rào máu - võng mạc [24] MF chuyển hóa pha pha gan tạo số sản phẩm hoạt tính, chất chuyển hóa noratyriol 1,7-dihydroxyaxanton [15] 1.1.2 Tác dụng dược lý Mangiferin có số đặc tính trị liệu mạnh tiềm như: tính điều hịa miễn dịch, ức chế phát triển khối u, chống oxy hóa, chống viêm, điều trị đái tháo Nồng độ thuốc nước mắt thỏ nhỏ HD cao giải thích sau: HD có độ nhớt nhỏ nên dược chất dễ hòa tan khuếch tán nước mắt, dễ mao dẫn lên giấy thấm Ngồi ra, HD có lượng dược chất tồn dạng tiểu phân tự nhiều so với HD HD (Hình 3.3), lượng dược chất hòa tan nhanh so với hòa tan MF từ đám phân tử carbopol 974P chứa MF (MF hòa tan khuếch tán qua lớp polyme môi trường) Kết không xu thử in vitro (mục 3.3.2) phương pháp thử giải phóng kiểu dịng chảy khơng mơ hồn tồn q trình chớp mắt sinh lý, thể tích khoang thử phương pháp thử giải phóng kiểu dịng chảy lớn nhiều so với thể tích màng nước mắt thử in vivo (1,5 mL so với 20 - 30 µL), tốc độ dịng phương pháp kiểu dòng chảy (0,18 mL/phút) lớn khoảng 180 lần so với tốc độ tiết nước mắt (1 μL/phút) Do thể tích nước mắt nên thơng số KTTP đặc tính lưu biến HD có ảnh hưởng lớn thử in vivo 3.4.2.2 Ảnh hưởng thành phần HD đến hòa tan dược chất in vivo C B HD HD HD 0 10 20 30 Nồng độ MF nước mắt (μg/mg) 10 10 ns 10 Nồng độ MF nước mắt (μg/mg) Nồng độ MF nước mắt (μg/mg) A ns ** HD HD HD phút Thời gian (phút) ns ** * HD HD HD 10 phút Hình 3.15 A Đồ thị nồng độ MF nước mắt thỏ theo thời gian sau nhỏ 30 µL HD 1, HD 6, HD 7; B Nồng độ thuốc nước mắt thỏ thời điểm phút; C Nồng độ thuốc nước mắt thỏ thời điểm 10 phút sau nhỏ thuốc Phân tích thống kê mô hình ANOVA hai chiều (matched two-way ANOVA) với kiểm định Tukey’s multiple comparison để so sánh giá trị trung bình giữa nhóm, sử dụng phần mềm GraphPad Prism 9.2.0; (*), p < 0,05; (**), p < 0,01; ns: not significant (không khác biệt có ý nghĩa); n = 3; error bar: SD Khi nhỏ hỗn dịch có thành phần polyme khác lên mắt thỏ, nước mắt thu từ mắt thỏ nhỏ HD có nồng độ cao so với dùng HD HD 7, đặc biệt thời điểm từ - 20 phút (Hình 3.15.A) Với mức tin cậy 95 %, có khác biệt có ý nghĩa thống kê nồng độ thuốc mắt thỏ nhóm HD HD (p < 0,01, thời điểm phút); nhóm HD HD (p < 0,01, thời điểm 10 phút) Tuy nhiên, khơng có khác biệt nồng độ thuốc mắt thỏ nhóm thời điểm từ 30 phút trở 42 Nồng độ MF nước mắt thời điểm phút sau nhỏ thuốc HD thấp so với HD 6, HD HD có độ nhớt cao nên q trình hịa tan khuếch tán MF vào nước mắt diễn chậm Ngoài ra, HD 1, tiểu phân MF giam giữ đám tụ polyme khiến dược chất phải hòa tan khuếch tán qua lớp polyme, tốc độ hòa tan chậm HD HD Quá trình diễn kèm theo rửa trôi tiết nước mắt chớp mắt, nồng độ thuốc nước mắt nhỏ HD thấp Độ nhớt HD thấp HD nên dễ hòa tan khuếch tán dược chất nước mắt, dễ thấm lên giấy thấm 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Sau q trình thực nghiệm, khóa luận tốt nghiệp đạt số kết sau: Đã bào chế hỗn dịch định hướng nhỏ mắt MF % có kích thước tiểu phân khác (D [4,3] = 138; 105; 76,7 μm) phương pháp nghiền bi Các thành phần hỗn dịch lựa chọn là: MF %; HPMC E6 0,4 %; hỗn hợp Tween 80 Span 80 (HLB = 11) 0,1%; carbopol 974P 0,4 %; NaCl 0,2 %; mannitol 3,6 %; NaH2PO4 0,06 %; Na2EDTA 0,01 % Đã đánh giá ảnh hưởng kích thước tiểu phân thành phần hỗn dịch đến đặc tính hóa lý HD, bao gồm: cảm quan, áp suất thẩm thấu, pH, đặc tính lưu biến, đặc điểm cấu trúc MF HD - Các HD có màu vàng nhạt, pH từ 5,9 - 6,1 áp suất thẩm thấu khoảng 290 – 310 mOsmol/kg - Đặc tính lưu biến hỗn dịch (độ nhớt, tính xúc biến) phụ thuộc vào KTTP MF, loại polyme nồng độ polyme sử dụng Hỗn dịch có KTTP MF nhỏ sử dụng carbopol 974P có độ nhớt lớn đặc tính giống với chất rắn - Có thay đổi dạng thù hình MF trình nghiền, MF HD sau nghiền tồn trạng thái tinh thể khác với nguyên liệu ban đầu, mức độ thay đổi tăng lên KTTP nghiền nhỏ Đã đánh giá ảnh hưởng kích thước tiểu phân thành phần hỗn dịch đến hòa tan dược chất in vitro, in vivo mắt thỏ - Đã xây dựng phương pháp định lượng MF nước mắt thỏ Đã thẩm định phương pháp theo hướng dẫn FDA thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học - Đã đánh giá ảnh hưởng KTTP thành phần HD đến hòa tan dược chất in vitro thử phương pháp kiểu dịng chảy HD có KTTP MF nhỏ có độ hòa tan dược chất cao nhất; HD chứa carbopol 934 có độ hịa tan dược chất thấp - Đã đánh giá ảnh hưởng KTTP thành phần HD đến hòa tan in vivo mắt thỏ MF phát nước mắt thỏ thời điểm 120 phút sau nhỏ thuốc HD có KTTP MF lớn có độ nhớt thấp có nồng độ thuốc nước mắt thỏ cao thời điểm phút ĐỀ XUẤT Tiếp tục nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả giải phóng in vivo Đánh giá sinh khả dụng tác dụng dược lý chế phẩm nghiên cứu Nghiên cứu cải thiện công thức nâng quy mô bào chế hỗn dịch nhỏ mắt mangiferin % 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 10 Nguyễn Thị Kiều Anh (2022), Một số phương pháp sắc ký dùng phân tích thuốc, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, pp 189-207 Bộ môn Bào chế trường Đại học Dược Hà Nội (2021), Bào chế sinh dược học, Tập 1, Hà Nội, pp 39, 155-261 Bộ mơn Vật Lý - Hóa Lý Trường Đại học Dược Hà Nội (2014), Hóa Lý Dược, Nhà xuất Y học, Hà Nội, pp 65-72 Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Tập 1, Nhà xuất Y học, Hà Nội, pp 608 Lương Thị Thu Hà (2022), Nghiên cứu bào chế hỗn dịch mangiferin định hướng nhỏ mắt, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, pp 4-43 Đào Văn Nam, Lương Thị Thu Hà, et al (2022), "Ảnh hưởng nhiệt độ, chất chống oxy hóa, pH, hệ đệm ánh sáng đến độ bền mangiferin dung dịch", pp 51-59 Đào Văn Nam, Vũ Thị Hồng Hạnh, et al (2022), "Xây dựng phương pháp định lượng natri diclofenac nước mắt thỏ nhằm hướng đến đánh giá giải phóng thuốc in vivo", Tạp chí Nghiên cứu Dược Thông tin thuốc số pp 1-8 Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội, pp 39-54 Lê Huyền Trâm, Nguyễn Văn Thông, et al (2020), "Nghiên cứu phân lập hợp chất mangiferin từ xồi", Tạp chí Khoa học Công nghệ, (140), pp 6164 Lê Văn Tú (2021), Nghiên cứu bào chế hệ đặt mắt chứa brinzolamid, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, pp 30-59 Tiếng Anh 11 Agency Pharmaceuticals and Medical Devices (2013), "Guideline on Bioanalytical Method Validation in Pharmaceutical Development", pp 1-20 12 Baranowski Przemysław, Karolewicz Bożena, et al (2014), "Ophthalmic drug 13 dosage forms: characterisation and research methods", The Scientific World Journal, 2014, pp 1-11 Barse R.K Tagalpallewar A.A., et al (2018), "Formulation and ex vivo-in vivo evaluation of pH-triggered brimonidine tartrate in situ gel for the glaucoma treatment using application of 3(2) factorial design", Drug Dev Ind Pharm, 44(5), pp 800-807 14 Demircan Şeyda, Sayin Filiz, et al (2005), "Determination of diclofenac in subretinal and aqueous humor fluids by HPLC with electrochemical detector", Fabad Journal of Pharmaceutical Sciences, 1(30), pp 33-39 15 Devi Maulina Ari Estuningtyas (2020), "Pharmacokinetic analysis of mangiferin: A study bibliographical", Journal of Critical Reviews, 7(18), pp 1836-1840 Du Suya, Liu Huirong, et al (2018), "Mangiferin: An effective therapeutic agent against several disorders", Molecular medicine reports, 18(6), pp 4775-4786 Dubald Marion, Bourgeois Sandrine, et al (2018), "Ophthalmic drug delivery 16 17 18 19 20 21 systems for antibiotherapy—A review", Pharmaceutics, 10(1), pp 10 Fernandes-Cunha Gabriella M, Gouvea Dayana Rubio, et al (2015), "Development of a method to quantify clindamycin in vitreous humor of rabbits’ eyes by UPLC–MS/MS: application to a comparative pharmacokinetic study and in vivo ocular biocompatibility evaluation", Journal of Pharmaceutical Biomedical Analysis, 102, pp 346-352 Food and Drug Administration (2022), "M10 Bioanalytical method validation and study sample analysis", US Department of Health and Human Services, pp 1-50 Food and Drug Administration (2018), "Bioanalytical method validation guidance for industry", US Department of Health and Human Services, pp 1-41 Francesco Puoci (2015), Advanced Polymers in Medicine, Springer International Publishing Switzerland pp 155-156 22 Gómez-Zaleta Berenice, Ramírez-Silva María Teresa, et al (2006), "UV/vis, 1H, and 13C NMR spectroscopic studies to determine mangiferin pKa values", Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 64(4), pp 1002-1009 23 Hou Shaoying, Wang Fang, et al (2012), "Pharmacokinetic study of mangiferin in human plasma after oral administration", Food chemistry, 132(1), pp 289-294 24 Hou Yunlong, Fan Shengjun, et al (2010), "Pharmacokinetic study of mangiferin in rat plasma and retina using high-performance liquid chromatography", Molecular Vision, 16, pp 1659 25 26 27 Instruments Malvern (2013), Mastersizer 3000 User Manual, Malvern Instruments Limited, United Kingdom, pp 5-11-5-22 Khare Puja, Shanker Karuna (2016), "Mangiferin: A review of sources and interventions for biological activities", BioFactors, 42(5), pp 504-514 Lai Ling, Lin Lie-Chwen, et al (2003), "Pharmacokinetic study of free mangiferin in rats by microdialysis coupled with microbore high-performance 28 29 30 31 32 33 34 35 36 liquid chromatography and tandem mass spectrometry", Journal of Chromatography A, 987(1-2), pp 367-374 Li Xiang, Nie Shu-fang, et al (2008), "A controlled-release ocular delivery system for ibuprofen based on nanostructured lipid carriers", International journal of pharmaceutics, 363(1-2), pp 177-182 Liu Rui, Liu Zhidong, et al (2012), "Nanostructured lipid carriers as novel ophthalmic delivery system for mangiferin: improving in vivo ocular bioavailability", Journal of pharmaceutical sciences, 101(10), pp 3833-3844 Mamun Abdullah Kabir Md, et al (2017), "Quality Control Tests for Ophthalmic Pharmaceuticals: Pharmacopoeial Standards and Specifications", Journal of Advances in Medical and Pharmaceutical Sciences, 14(2), pp 1-17 Morgan Siân R, Pilia Nicole, et al (2020), "Controlled in vitro delivery of voriconazole and diclofenac to the cornea using contact lenses for the treatment of Acanthamoeba keratitis", International journal of pharmaceutics, 579, pp 19 Nisha Saini, Deepak Kumar (2012), "An insight to ophthalmic drug delivery system", International Journal of Pharmaceutical Studies Research, 3(2), pp 913 Patel Ashaben, Cholkar Kishore, et al (2013), "Ocular drug delivery systems: An overview", World journal of pharmacology, 2(2), pp 47 Patel Hitesh A, Patel Jayvadan K, et al (2010), "Ophthalmic drug delivery system-a review", Der Pharmacia Lettre, 2(4), pp 100-115 Paugh Jerry R, Nguyen Andrew Loc, et al (2008), "Retention and retention of effect of topical formulations in dry eye subjects", Optometry and Vision Science, 85(9), pp 873-879 Rechenchoski Daniele Zendrini, Agostinho Karoline Fontana, et al (2020), "Mangiferin: a promising natural xanthone from Mangifera indica for the control of Acyclovir–resistant herpes simplex virus infection", Bioorganic Medicinal Chemistry, 28(4), pp 1-6 37 38 39 Rimpelä Anna-Kaisa, Garneau Michel, et al (2020), "Quantification of drugs in distinctly separated ocular substructures of albino and pigmented rats", Pharmaceutics, 12(12), pp 1174 Rousseau A Burrel S., et al (2022), "Acyclovir-resistant HSV-1 keratitis: a concerning and emerging clinical challenge", American Journal of Ophthalmology, pp 110-119 Sebbag Lionel, Showman Lucas, et al (2018), "Impact of flow rate, collection devices, and extraction methods on tear concentrations following oral 40 41 42 43 44 45 administration of doxycycline in dogs and cats", Journal of Ocular Pharmacology Therapeutics, 34(6), pp 452-459 Small Dave, Hevy Jackie, et al (2000), "Comparison of tear sampling techniques for pharmacokinetic analysis: ofloxacin concentrations in rabbit tears after sampling with Schirmer tear strips, capillary tubes, or surgical sponges", Journal of ocular pharmacology therapeutics, 16(5), pp 439-446 United States (2018), United States Pharmacopeia and National Formulary USP 41-NF 36, pp 6510-6512 Vo Anh, Feng Xin, et al (2021), "Analyzing ophthalmic suspension particle size distributions using laser diffraction: Placebo background subtraction method", International Journal of Pharmaceutics, 598, pp 1-10 Vyas A, Syeda K, et al (2012), "Perspectives on medicinal properties of mangiferin", Mini Reviews in Medicinal Chemistry, 12(5), pp 412-425 Zhang Hong, Hou Yunlong, et al (2010), "Determination of mangiferin in rat eyes and pharmacokinetic study in plasma after oral administration of mangiferin-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin inclusion", Journal of ocular pharmacology therapeutics, 26(4), pp 319-324 Zhu XM, Song JX, et al (1993), "Antiviral activity of mangiferin against herpes simplex virus type in vitro", Acta Pharmacologica Sinica, 14(5), pp 452-454 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết thẩm định phương pháp định lượng MF đánh giá khả hòa tan dược chất in vitro Phụ lục 2: Kết xây dựng phương pháp định lượng MF nước mắt thỏ Phụ lục 3: Kết thẩm định phương pháp định lượng MF nước mắt thỏ Phụ lục 4: Các hình ảnh soi kính hiển vi PHỤ LỤC 1: Kết thẩm định phương pháp định lượng MF đánh giá khả hòa tan dược chất in vitro Độ thích hợp hệ thống Phân tích lặp lại lần mẫu dung dịch chuẩn MF pha động AcOH %: ACN (85 : 15 v/v) có nồng độ 17,83 μg/mL theo phương pháp HPLC nêu mục 2.3.8.1 Kết cho thấy thời gian lưu MF khoảng 3,49 phút Giữa lần tiêm lặp lại cho giá trị RSD thời gian lưu 0,4 % (< %) RSD diện tích píc 0,18 % (< %) Kết đạt giới hạn yêu cầu theo hướng dẫn FDA Bảng PL-1.1 Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống STT Trung bình RSD Diện tích píc MF (mAu.s) 508,54 508,04 508,58 510,72 508,57 508,78 508,87 0,18 Thời gian lưu MF (phút) 3,471 3,485 3,486 3,490 3,504 3,509 3,490 0,40 Độ đặc hiệu Phân tích mẫu: placebo, mẫu chuẩn MF pha động AcOH % : ACN (85 : 15 v/v), mẫu thử giải phóng in vitro so sánh sắc ký đồ thu Yêu cầu thời gian lưu MF mẫu thử tương tự thời gian lưu MF mẫu chuẩn thời gian lưu MF khơng xuất píc sắc ký đồ mẫu placebo Kết thu cho thấy, thời gian lưu MF mẫu thử tương tự thời gian lưu MF mẫu chuẩn (khoảng 3,49 phút) Sắc ký đồ mẫu placebo khơng xuất píc có thời gian lưu với píc sắc ký đồ dung dịch chuẩn mẫu thử Như vậy, phương pháp phân tích chọn lọc với MF Hình PL-1.1 Sắc ký đồ (A) mẫu placebo; (B) mẫu chuẩn MF pha động AcOH % : ACN (85 : 15 v/v) nồng độ 5,94 μg/mL; (C) mẫu thử hòa tan in vitro Đường chuẩn khoảng tuyến tính Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn MF pha động AcOH % : ACN (85:15 v/v) có nồng độ từ 0,07 – 53,50 μg/mL (tối thiểu điểm) phân tích phương pháp HPLC trình bày mục 2.3.8.1 Nhận thấy mối tương quan tuyến tính nồng độ MF diện tích píc tương ứng theo phương trình y = 28,7358x – 0,8211 với hệ số R2 = 1,0000 Như phương pháp định lượng MF mẫu thử giải phóng in vitro Bảng PL-1.2 Diện tích píc MF mẫu chuẩn nồng độ khác STT Nồng độ MF (μg/mL) 53,5 17,83 5,94 1,98 0,66 0,22 0,07 Diện tích píc MF (mAu.s) 1537,32 508,54 171,95 55,99 17,41 5,78 1,87 Hình PL-1.2 Đồ thị thể mối tương quan tuyến tính nồng độ MF pha động AcOH %: ACN (85 : 15 v/v) diện tích píc PHỤ LỤC 2: Kết xây dựng phương pháp định lượng MF nước mắt thỏ 2.1 Các bảng Bảng PL-2.1 So sánh tín hiệu nhiễu mẫu diện tích píc MF phân tích mẫu dịch chiết từ giấy thấm nước mắt hấp phụ 0,2 μg MF bước sóng khác STT Bước sóng phát (nm) 318 240 258 Tín hiệu nhiễu mẫu (mAu.s) 0,48 0,77 0,42 Diện tích píc MF (mAu.s) 7,91 18,15 29,03 Kết Bảng PL-2.1 cho thấy nhiễu đường (diện tích píc mẫu dịch chiết từ giấy thấm nước mắt trắng) vị trí trùng với píc MF pha động tăng dần sử dụng bước sóng 258; 318; 240 nm Giả thiết có mối quan hệ tuyến tính diện tích píc nồng độ MF ước tính đưa lên giấy thấm nước mắt, LLOQ sử dụng bước sóng 318; 240; 258 nm là: 23,9; 16,7; 5,7 μg/mL Như vậy, bước sóng 258 nm cho LLOQ thấp nhất, tăng khả phân tích mẫu định lượng nồng độ thấp Bảng PL-2.2 So sánh tín hiệu nhiễu mẫu tốc độ dòng khác Tốc độ dòng (mL/phút) 1,0 1,2 Tín hiệu nhiễu mẫu (mAu.s) 0,42 0,66 Kết Bảng PL-2.2 cho thấy phân tích mẫu dịch chiết từ giấy thấm nước mắt trắng, tín hiệu nhiễu mẫu thời gian lưu tương ứng với píc MF pha động cao chạy với tốc độ 1,2 mL/phút Bảng PL-2.3 So sánh diện tích píc MF (mẫu MF nồng độ 1,25 μg/mL pha động MeOH : AcOH 0,6 % (35 : 65 v/v)) tín hiệu nhiễu mẫu thể tích tiêm mẫu khác Thể tích tiêm (μL) 10 20 Thời gian lưu MF (phút) 8,13 8,17 Diện tích píc (mAu.s) 35,00 66,16 Tín hiệu nhiễu mẫu (mAu.s) 0,42 1,03 Kết Bảng PL-2.3 cho thấy tăng thể tích tiêm mẫu, tín hiệu nhiễu mẫu (tại vị trí có thời gian lưu tương ứng với píc MF pha động) tăng Giả thiết có mối quan hệ tuyến tính diện tích píc nồng độ MF ước tính đưa lên giấy thấm nước mắt, LLOQ tiêm 10 μL 20 μL mẫu là: 5,72 7,72 μg/mL Như vậy, tiêm 10 μL mẫu cho LLOQ thấp 2.2 Các sắc ký đồ Hình PL-2.1 Sắc ký đồ (A), (B) mẫu chuẩn MF 40,5 μg/mL MP (ACN : AcOH %) mẫu dịch chiết từ giấy thấm nước mắt hấp phụ 0,41 μg MF sử dụng cột C18 4,6 x 150 mm; (C), (D) mẫu chuẩn MF 40,5 μg/mL MP (ACN : AcOH %) mẫu dịch chiết từ giấy thấm nước mắt hấp phụ 0,41 μg MF sử dụng cột C18 4,6 x 250 mm Hình PL-2.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn MF 10,35 μg/mL pha động (ACN: acid formic 0,05 % tỉ lệ 15 : 85 v/v) Hình PL-2.3 Sắc ký đồ (A) mẫu dịch chiết từ giấy trắng không chứa MF; (B) Mẫu chuẩn MF 10,35 μg/mL pha động (MeOH : AcOH % tỉ lệ 40 : 60 v/v) Hình PL-2.2 cho thấy sử dụng hệ dung môi ACN : acid formic 0,05 % (tỉ lệ 15 : 85 v/v), có tượng dỗng píc kéo píc MF (tR = 9,56 phút) với độ rộng chân píc kéo dài từ 8,93 – 11,5 phút, (symmetry factor = 0,572) Đồng thời tín hiệu nhiễu mẫu lớn, đáp ứng píc mẫu dịch chiết từ giấy thấm nước mắt trắng lên tới 2,08 mAu.s, làm giảm khả phân tích mẫu nồng độ thấp, khơng thuận lợi phân tích mẫu thực Hình PL-2.3 cho thấy với hệ dung mơi MeOH: AcOH % (tỉ lệ 40 : 60 v/v), thời gian lưu MF 5,17 phút, nhiên mẫu dịch chiết từ giấy trắng khơng chứa MF, có xuất píc gây nhiễu 5,7 phút, khơng tách hồn tồn khỏi píc MF, ảnh hưởng đến khả phân tích mẫu dược chất nồng độ thấp PHỤ LỤC 3: Kết thẩm định phương pháp định lượng MF nước mắt thỏ 3.1 Các bảng Bảng PL-3.1 Diện tích píc thời gian lưu lần tiêm lặp lại mẫu chuẩn MF nồng độ μg/mL pha động MeOH : AcOH 0,6 % (35 : 65 v/v) STT Trung bình RSD Thời gian lưu (phút) 8,125 8,142 8,127 8,147 8,125 8,140 8,134 0,12 Diện tích píc (mAu.s) 134,87 135,51 135,54 135,64 136,07 136,83 135,74 0,48 3.2 Các sắc ký đồ Hình PL-3.1 (A) Sắc ký đồ mẫu dịch chiết từ giấy thấm nước mắt trắng; (B) mẫu dịch chiết từ giấy trắng không chứa MF; (C) mẫu chuẩn MF nồng độ 5,18 μg/mL pha động MeOH : AcOH 0,6 % (35 : 65 v/v); (D) mẫu dịch chiết từ giấy thấm nước mắt hấp phụ 1,04 μg MF Hình PL-3.2 (A) Phổ hấp thụ UV đỉnh píc MF mẫu chuẩn MF pha động MeOH : AcOH 0,6 % (35 : 65 v/v) (5,18 μg/mL); (B) Phổ hấp thụ UV đỉnh píc MF mẫu dịch chiết từ giấy thấm nước mắt chứa 1,04 μg MF PHỤ LỤC 4: Các hình ảnh soi kính hiển vi Hình PL-4.1 Hình ảnh soi kính hiển vi vật kính 10, thang đo 100 μm HD khác nhau: A HD 4, B HD 5, C HD 6, D HD