Phạm thị nhật linh đánh giá tác dụng của lá chè đắng (ilex kudingcha c j tseng) trên mô hình ruồi giấm đột biến gen lsd1 khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - PHẠM THỊ NHẬT LINH ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA LÁ CHÈ ĐẮNG (Ilex kudingcha C.J.Tseng) TRÊN MƠ HÌNH RUỒI GIẤM ĐỘT BIẾN GEN Lsd1 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - PHẠM THỊ NHẬT LINH Mã sinh viên: 1801406 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA LÁ CHÈ ĐẮNG (Ilex kudingcha C.J.Tseng) TRÊN MƠ HÌNH RUỒI GIẤM ĐỘT BIẾN GEN Lsd1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Hà Vân Oanh PGS TS Phạm Thị Nguyệt Hằng Nơi thực hiện: Viện Dược liệu HÀ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, trưởng khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu Cơ người trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, bảo tận tình cho em từ ngày đến hoàn thiện đề tài Sự định hướng tâm huyết cô động lực lớn lao để em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn cô! Tiếp đến, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Hà Vân Oanh, khoa Dược liệu Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội Cô cho em hội nghiên cứu khoa học môi trường chuyên nghiệp, giúp đỡ, quan tâm sát cho em lời khuyên quý báu q trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn cô! Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh Nguyễn Văn Hiệp, chị Đinh Thị Minh anh chị khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu giúp đỡ, hướng dẫn kỹ thuật tạo điều kiện tốt cho em suốt thời gian em tham gia nghiên cứu thực nghiệm khoa Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè ln bên cạnh động viên, chỗ dựa vững em gặp khó khăn học tập sống Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân có hạn, khóa luận cịn nhiều điều thiếu sót Em mong nhận góp ý thầy cơ, bạn bè để khóa luận hồn thiện Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Phạm Thị Nhật Linh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Bệnh tự kỷ 1.1.1 Sơ lược tự kỷ 1.1.2 Dịch tễ học ASD 1.1.3 Nguyên nhân yếu tố nguy 1.1.4 Thuốc điều trị tự kỷ 1.1.5 Một số mô hình nghiên cứu rối loạn tự kỷ 1.1.6 Mơ hình nghiên cứu rối loạn phổ tự kỷ ruồi giấm đột biến gen Lsd1 1.2 Tổng quan Chè đắng 1.2.1 Tên gọi, vị trí phân loại 1.2.2 Đặc điểm thực vật phân bố 1.2.3 Thành phần hóa học 10 1.2.4 Tác dụng dược lý 12 1.2.5 Công dụng 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Chủng ruồi phục vụ nghiên cứu 15 2.1.3 Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Quy trình chuẩn bị ruồi giấm phục vụ nghiên cứu 17 2.2.2 Thiết kế nghiên cứu 18 2.2.3 Phân tích kết 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1 Kết đánh giá khả ức chế Lsd1 thông qua độ hấp thụ quang sắc tố mắt ruồi giấm đột biến gen Lsd1 25 3.2 Kết đánh giá tác dụng cải thiện thiếu hụt hành vi tương tác cộng đồng ruồi giấm đột biến gen Lsd1 26 3.3 Kết đánh giá khả khả di chuyển (bò) ấu trùng ruồi giấm đột biến gen Lsd1 28 3.4 Kết đánh giá tác dụng chống oxy hóa đầu ruồi giấm phương pháp định lượng MDA 29 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 31 4.1 Về mơ hình nghiên cứu 31 4.1.1 Về việc lựa chọn mơ hình ruồi giấm đột biến gen Lsd1 31 4.1.2 Về việc lựa chọn dược liệu nghiên cứu 32 4.1.3 Về lựa chọn mức liều nghiên cứu 33 4.1.4 Về việc lựa chọn nhóm chứng dương thử nghiệm đánh giá sắc tố mắt ruồi giấm đột biến gen Lsd1 33 4.2 Về kết nghiên cứu 34 4.2.1 Đánh giá khả ức chế Lsd1 thông qua độ hấp thụ quang sắc tố mắt ruồi giấm đột biến gen Lsd1 34 4.2.2 Đánh giá tác dụng cải thiện thiếu hụt hành vi tương tác cộng đồng ruồi giấm đột biến gen Lsd1 35 4.2.3 Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi vận động ấu trùng ruồi giấm bậc ba đột biến gen Lsd1 36 4.2.4 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa đầu ruồi giấm phương pháp định lượng MDA 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ theo Tiếng Anh Viết đầy đủ theo Tiếng Việt Aβ Amyloid β protein Protein amyloid β ADHD Attention deficit hyperactivity disorder ASD Autism spectrum disorder DiCQAs Acid dicaffeoylquinic DSM-V The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders Fifth Edition H3K4 Histone H3 lysine H3K9 Histone H3 lysine Rối loạn tăng động giảm ý Rối loạn phổ tự kỷ Sổ tay chẩn đoán thống kê loại rối loạn tâm thần, tái lần Cao tiêu chuẩn Chè đắng IK Demethylase đặc hiệu với lysin histon LSD1 Lysine-specific demethylase MDA Malondialdehyd NDD Neurodevelopmental disorders Rối loạn phát triển thần kinh khác NMJ Neuromuscular Junction Khớp nối thần kinh-cơ OBX Olfactory bulbectomy Mất vùng khứu giác PFC Prefrontal cortex Vỏ não trước trán SSRI Selective serotonin reuptake inhibitors Thuốc ức chế tái hấp thu chọn lọc serotonin DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 2.2 Các thiết bị dụng cụ sử dụng thí nghiệm 16 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh vòng đời ruồi giấm Hình 1.2 Hình ảnh Chè đắng Chè đắng khô (Ilex kudingcha C.J Tseng) 10 Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo kudinosid A, D, F 11 Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo acid isochlorogenic A, B C 12 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 18 Hình 2.2 Thiết kế thí nghiệm đánh giá tương tác cộng đồng ruồi giấm 20 Hình 2.3 Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả bò ấu trùng ruồi giấm 22 Hình 2.4 Phản ứng MDA TBA 23 Hình 3.1 Kết phân tích độ hấp thụ sắc tố mắt ruồi lô khác 25 Hình 3.2 Hình ảnh phân bố quần thể ruồi không gian 26 Hình 3.3 Kết phân tích khoảng cách tương tác không gian ruồi giấm lô khác 27 Hình 3.4 Hình ảnh đường ấu trùng ruồi giấm bậc ba sau phân tích qua phần mềm ImageJ 28 Hình 3.5 Kết phân tích tốc độ di chuyển ấu trùng ruồi giấm bậc ba 29 Hình 3.6 Nồng độ MDA dịch đồng thể đầu ruồi lô nghiên cứu 30 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo tiêu chuẩn DSM-V, tự kỷ (Autism spectrum disorder - ASD) tình trạng rối loạn hành vi nghiêm trọng, nằm nhóm rối loạn phát triển lan tỏa [17] Người mắc bệnh tự kỷ thường mang đồng thời nhiều rối loạn thần kinh phức tạp, đặc trưng suy giảm khả hòa nhập xã hội, suy giảm khả giao tiếp, có hành vi lặp lại quan tâm mang tính hạn hẹp Gần đây, tỉ lệ tự kỷ có có xu hướng gia tăng với tốc độ đáng báo động không Việt Nam mà cịn tồn giới [4], [20] Hiện chưa có thuốc điều trị đặc hiệu ASD Trong đó, ảnh hưởng ASD lên người bệnh kéo dài từ lúc nhỏ đến suốt đời, làm giảm chất lượng sống người bệnh, tạo gánh nặng tâm lý, tài cho gia đình xã hội Chính vậy, việc nghiên cứu thuốc mới, đặc biệt thuốc từ dược liệu, vấn đề thiết thực cần quan tâm Chè đắng có tên khoa học Ilex kudingcha C.J Tseng, họ Trâm bùi (Aquifoliaceae) dược liệu được chứng minh nhiều tác dụng Các chất triterpenoid, acid phenolic, flavonoid tinh dầu thành phần có Chè đắng có tác dụng bảo vệ hệ thống mạch máu, điều hòa chuyển hóa lipid, chống oxy hóa, hạ đường huyết chống viêm [41] Hiện nay, có cơng bố hiệu cao chiết Chè đắng ruồi giấm tự kỷ mang đột biến gen Rugose - gen số 100 gen đóng vai trị việc trì cấu trúc, chức não [52], [67] Vì vậy, Chè đắng đối tượng tiềm sử dụng nghiên cứu mơ hình ruồi giấm mang đột biến gen khác liên quan đến bệnh ASD đột biến gen Lsd1 – gen tham gia vào q trình điều hịa biểu kiểu gen Vì lý đó, chúng tơi thực đề tài “Đánh giá tác dụng Chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) mơ hình ruồi giấm đột biến gen Lsd1” với mục tiêu cụ thể sau đây: - Đánh giá tác dụng ức chế Lsd1 Chè đắng dựa thay đổi kiểu hình màu mắt ruồi giấm đột biến gen Lsd1 - Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi liên quan tới ASD Chè đắng mơ hình ruồi giấm đột biến gen Lsd1 - Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh Chè đắng mơ hình ruồi giấm đột biến gen Lsd1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Bệnh tự kỷ 1.1.1 Sơ lược tự kỷ Rối loạn phổ tự kỷ (Autism spectrum disorder - ASD), gọi chứng tự kỷ, rối loạn phát triển thần kinh khơng đồng nhất, có tính di truyền cao phổ biến, có đặc điểm nhận biết thường xảy đồng thời với tình trạng bệnh khác [44] Những người mắc chứng tự kỷ khác có triệu chứng khác Vì lý này, tự kỷ gọi rối loạn phổ - có nghĩa có loạt đặc điểm giống người mắc chứng rối loạn khác [17] Tự kỷ rối loạn không đồng nằm nhóm rối loạn phát triển lan tỏa theo tiêu chuẩn DSM-V (The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders - Fifth Edition – Sổ tay chẩn đoán thống kê loại rối loạn tâm thần, tái lần 5) Các biểu bệnh tự kỷ bao gồm khiếm khuyết giao tiếp tương tác xã hội, bất thường giác quan, hành vi lặp lặp lại mức độ thiểu trí tuệ khác [17] Cùng với triệu chứng này, người mắc chứng tự kỷ thường mắc đồng thời rối loạn tâm thần thần kinh khác rối loạn tăng động ý (chẳng hạn rối loạn tăng động giảm ý (ADHD)), lo lắng, trầm cảm động kinh Tự kỷ thường đơi với khuyết tật trí tuệ [11], [17] Ngoài ra, theo DSM-V, trẻ mắc rối loạn phổ tự kỷ thường có vấn đề y khoa động kinh, rối loạn giấc ngủ, táo bón, rối loạn ăn uống Đồng thời số đặc điểm liên quan sau góp phần hỗ trợ chẩn đốn ASD, bao gồm: suy giảm trí tuệ và/ suy giảm khả ngơn ngữ, tự gây thương tích, thiếu niên người lớn mắc ASD dễ bị lo lắng trầm cảm, số cá nhân rối loạn hành vi vận động (hành động chậm “đóng băng” hành động) [17] 1.1.2 Dịch tễ học ASD Các nghiên cứu dịch tễ học bệnh tự kỷ phổ biến nam giới so với nữ giới với tỷ lệ báo cáo 4:1 nghiên cứu “Gánh nặng bệnh tật toàn cầu” năm 2010 [24], [43] Ngồi ra, nghiên cứu cịn ước tính có khoảng 52 triệu người mắc chứng tự kỷ toàn cầu, tương đương với tỷ lệ mắc bệnh 1:132 [22] Ở trẻ em, người ta ước tính tỷ lệ khoảng 1:100, tức 100 trẻ có trẻ mắc chứng tự kỷ [74] Tại Việt Nam chưa có cơng bố mang tính chất tổng thể tỷ lệ trẻ em mắc chứng tự kỷ, nhiên số nghiên cứu cho thấy số lượng trẻ mắc chứng tự kỷ Cũng saponin từ Chè đắng giúp cải thiện đáng kể khả nhận thức trí nhớ mơ hình chuột ruồi giấm mang bệnh Alzheimer [14], [38] Và đặc biệt là, tiếp nối kết nhóm nghiên cứu PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng cộng Chè đắng: Năm 2019, cao chiết ethanol 80% từ Chè đắng đánh giá có tác dụng cải thiện bệnh tự kỷ mơ hình sàng lọc ruồi giấm đột biến gen Rugose mang bệnh tự kỷ 30 mẫu dược liệu [6] Năm 2020, cao chiết ethanol 80% Chè đắng có khả cải thiện hội chứng tự kỷ chống lo âu, tăng tương tác xã hội cải thiện suy giảm trí nhớ/ nhận thức mơ hình chuột tự kỷ thực nghiệm [6] Tuy nhiên, nguyên nhân gây tự kỷ phức tạp, vậy, việc nghiên cứu thêm tác dụng Chè đắng chủng ruồi tự kỷ mang gen khác cần thiết để đánh giá xác tác dụng dược liệu tìm hiểu chế tác dụng IK ASD Cụ thể, mơ hình ruồi giấm đột biến gen Lsd1 này, quan tâm tới chế tác dụng thông qua ức chế LSD1 điều trị Cho đến nay, số lượng lớn chất ức chế LSD1 có hiệu cao chọn lọc báo cáo thập kỷ qua, đó, chất có nguồn gốc tự nhiên có khả ức chế LSD1 đặc biệt quan tâm Nghiên cứu tác giả Fang cộng (2019) hợp chất với đặc tính thơm polyphenol, flavonoid có khả ức chế LSD1 [28] Do nghiên cứu này, việc sử dụng Chè đắng – dược liệu có thành phần polyphenol, flavonoid phù hợp Vì vậy, lựa chọn Chè đắng để đánh giá tác dụng mơ hình ruồi giấm đột biến gen Lsd1 4.1.3 Về lựa chọn mức liều nghiên cứu Kế thừa kết sàng lọc số lượng lớn mẫu ruồi giấm thuộc dự án FIRST (dưới tài trợ ngân hàng giới PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng chủ trì), kết hợp với việc nhóm nghiên cứu tiến hành sàng lọc dải nồng độ 10, 6, 4, 2, mg/ml, dựa vào tỷ lệ sống sót ruồi trưởng thành cải thiện hành vi cộng đồng với mức liều, nhận thấy nồng độ mg/ml mg/ml phù hợp đạt tiêu chí để nghiên cứu sâu 4.1.4 Về việc lựa chọn nhóm chứng dương thử nghiệm đánh giá sắc tố mắt ruồi giấm đột biến gen Lsd1 Tranylcypromin loại chất ức chế monoamine oxidase (MAO) không chọn lọc, sử dụng chủ yếu để điều trị trầm cảm Tuy nhiên, phát 33 chất có khả ức chế LSD1 khơng hồi phục [40] Cơ chế ức chế LSD1 tranylcypromin cho liên quan đến khả ức chế enzymatic LSD1 Một nghiên cứu tranylcypromin có khả ức chế hoạt động enzymatic LSD1 gián tiếp thông qua việc ức chế coenzym FAD (flavin adenine dinucleotide) - thành phần cần thiết để LSD1 hoạt động - cách tạo liên kết cộng hóa trị với vịng flavin [29] Trong thử nghiệm so sánh biểu kiểu hình màu mắt, nhóm chứng dương nhóm ruồi giấm đột biến gen Lsd1 điều trị Tranylcypromin dùng để so sánh với nhóm sinh lý, nhóm bệnh lý nhóm thử để đánh giá khả ức chế LSD1 IK Mặc dù trước có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng cải thiện ASD IK mơ hình ruồi giấm chuột thực nghiệm ngun nhân gây ASD phức tạp IK có tác dụng cải thiện ASD theo nhiều đích khác nên việc sử dụng chứng dương giúp tìm hiểu thêm sơ chế tác dụng IK mơ hình ruồi đột biến gen Lsd1 [10], [6] 4.2 Về kết nghiên cứu 4.2.1 Đánh giá khả ức chế Lsd1 thông qua độ hấp thụ quang sắc tố mắt ruồi giấm đột biến gen Lsd1 Đột biến đốm trắng đặc điểm đặc trưng ruồi giấm đột biến gen Lsd1 Đột biến đốm trắng thường liên quan đến gián đoạn biểu chức gen liên quan đến sắc tố mắt Một gen phổ biến bị ảnh hưởng đột biến gen màu trắng, chịu trách nhiệm sản xuất sắc tố mắt Đột biến gen màu trắng dẫn đến giảm khơng có sắc tố, dẫn đến màu mắt nhạt trắng so với chủng hoang dại [60] Sự điều chỉnh biểu sắc tố mắt bao gồm chế di truyền tế bào học phức tạp LSD1 biết đến với vai trò điều chỉnh biểu gen thơng qua q trình khử methyl histon, ảnh hưởng đến hoạt động gen liên quan đến sắc tố Kết Hình 3.1 cho thấy sắc tố mắt chủng ruồi giấm tự kỷ đột biến gen Lsd1 hấp thụ quang thấp so với chủng sinh lý, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001 Lô ruồi giấm chủng LSD1 điều trị chất chuẩn Tranylcypromin – chất ức chế LSD1 có độ hấp thụ quang cao so với chủng bệnh lý, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001 tương đương so với chủng sinh lý Điều phù hợp với nghiên cứu trước tác giả Hoyer-Fender Sigrid [60] Kết cho thấy việc đột biến gen Lsd1 làm 34 giảm sắc tố mắt ruồi giấm bệnh lý mơ hình ruồi đột biến gen Lsd1 phù hợp để đánh giá tác dụng IK thay đổi sắc tố mắt ruồi giấm IK nồng độ mg/ml mg/ml cho thấy tác dụng làm tăng độ hấp thụ sắc tố mắt ruồi giấm so với lô bệnh lý, khác biệt đạt ý nghĩa thống kê với giá trị p < 0,001 Như vậy, việc sử dụng cao chiết Chè đắng có tác dụng cải thiện sắc tố mắt ruồi giấm đột biến gen Lsd1 Đồng thời có tương đồng sắc tố mắt nhóm thử nhóm chứng dương, qua cho thấy tác dụng tương đương IK chất ức chế LSD1 – Tranylcypromin biểu màu mắt ruồi giấm đột biến gen Lsd1 4.2.2 Đánh giá tác dụng cải thiện thiếu hụt hành vi tương tác cộng đồng ruồi giấm đột biến gen Lsd1 Khiếm khuyết tương tác xã hội đặc trưng người mắc ASD Để đánh giá tác dụng cải thiện triệu chứng IK, thực mô hình đánh giá khả tương tác cộng đồng ruồi giấm đột biến gen Lsd1 Nghiên cứu Simon cộng (2012) cho thấy khác biệt giới tính khơng ảnh hưởng đến hành vi tương tác cộng đồng ruồi [61] Vì vậy, chúng tơi thống kê liệu quần thể bao gồm ruồi đực ruồi Tuy nhiên, để giảm ảnh hưởng tương tác giới tính, ví dụ giao phối, đến mơ hình hành vi, chúng tơi thực thí nghiệm nhóm ruồi đực ruồi riêng rẽ Hình ảnh phân bố quần thể ruồi khơng gian số khoảng cách đến ruồi gần Hình 3.2 Hình 3.3 cho thấy ruồi giấm mang gen đột biến bị giảm khả tương tác cộng đồng Các cá thể nhóm bệnh chứng đứng riêng lẻ rải rác khơng gian, di chuyển thành đám giống nhóm ruồi giấm chủng hoang dại Minh chứng cho điều khoảng cách gần hai cá thể nhóm ruồi đột biến gen Lsd1 tăng lên rõ rệt so với nhóm ruồi giấm chủng hoang dại Kết phù hợp với kết công bố giới khác biệt khoảng cách cá thể tương tác xã hội phân bố ngẫu nhiên [61], [71] IK mức liều mg/ml mg/ml làm giảm khoảng cách ngắn hai cá thể ruồi giấm đột biến gen Lsd1 Trong đó, mức liều mg/ml cải thiện rõ rệt khả tương tác xã hội ruồi bệnh lý, khoảng cách hai cá thể gần rút ngắn lại đáng kể với khác biệt đạt ý nghĩa thống kê p < 0,01 Như vậy, việc sử dụng IK có tác dụng cải thiện thiếu hụt hành vi tương tác cộng đồng ruồi giấm đột biến gen Lsd1 35 4.2.3 Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi vận động ấu trùng ruồi giấm bậc ba đột biến gen Lsd1 Cải thiện tốc độ di chuyển tiêu chí nhằm đánh giá hiệu tác dụng dược liệu lên chức vận động ruồi giấm Kết Hình 3.4 Hình 3.5 ruồi giấm đột biến gen Lsd1 có tốc độ bị chậm so với ruồi giấm chủng hoang dại Ngoài ra, quan sát trình thực nghiệm cho thấy ruồi giấm mang gen đột biến có xu hướng di chuyển cuộn trịn, tuyến tính so với đường nhóm ruồi sinh lý Điều phù hợp với kết nghiên cứu trước Wise cộng [71] Sự khác biệt lô chứng sinh lý lô chứng bệnh lý cho thấy mơ hình phù hợp để đánh giá tác dụng IK IK nồng độ mg/ml cho thấy tác dụng cải thiện chức vận động ruồi giấm, làm tăng tốc độ di chuyển trung bình ấu trùng ruồi giấm đột biến gen, khác biệt đạt ý nghĩa với p < 0,05 Trong đó, mức liều cao mg/ml, IK có làm tăng tốc độ di chuyển ấu trùng, nhiên, khác biệt không đạt ý nghĩa thống kê Điều cho thấy tác dụng thay đổi hành vi vận động ấu trùng IK phụ thuộc vào liều nghiên cứu Trong trình phát triển, hệ thống NMJ phát triển theo tăng cường kích thước sợi để đảm bảo trì xác synap điều khiển Từ lúc nở tới giai đoạn phát triển thứ ấu trùng diện tích bề mặt sợi tăng tới 100 lần [37] Trong giai đoạn phát triển, số lượng nút thần kinh tiếp tục tăng (một số bị loại bớt), kết trình tăng số lượng nút số vùng hoạt động nút lên 10 lần [18] Các tượng tối ưu cân nội, thay đổi điện sinh lý làm thay đổi giải phóng chất dẫn truyền trung gian thần kinh và/hoặc đáp ứng hậu synap [47] Liên hệ với số nghiên cứu trước dựa phân tích cấu trúc thần kinh NMJ nhóm số ấu trùng ruồi giấm bậc phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang, chúng tơi nhận thấy có mối liên quan [12], [52].Trong nghiên cứu này, ruồi giấm chủng LSD1 điều trị cao chiết, có thay đổi cấu trúc thần kinh cơ, cụ thể số lượng, diện tích nút thần kinh, chiều dài sợi thần kinh Nhờ đó, có thay đổi khả vận động Do đó, đích tác dụng cao chiết Chè đắng ấu trùng ruồi giấm bậc ba Tuy nhiên, cần thực nghiên cứu sâu để kiểm chứng 36 4.2.4 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa đầu ruồi giấm phương pháp định lượng MDA Não dễ bị tổn thương stress oxy hóa khả chống oxy hóa hạn chế, yêu cầu lượng, lượng lipid sắt não cao Não có khối lượng khoảng 2% thể tiêu thụ khoảng 20% lượng trao đổi chất Phần lớn lượng sử dụng cho tế bào thần kinh Các chất chống oxy hóa vơ cần thiết cho tồn tế bào thần kinh giai đoạn phát triển ban đầu ASD bệnh liên quan tới hệ thần kinh stress oxy hóa tế bào thần kinh cho có liên quan tới ASD MDA sản phẩm sinh q trình peroxy hóa lipid tạo thành Hàm lượng MDA chứng tỏ cao chiết có tác dụng ức chế q trình peroxy hóa lipid tốt Kết thực nghiệm cho thấy hàm lượng MDA dịch đồng thể đầu ruồi nhóm bệnh lý cao so với nhóm sinh lý, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001 Điều cho thấy có gia tăng q trình peroxy hóa lipid não ruồi giấm đột biến gen Lsd1 Kết tương đồng với nghiên cứu trước ruồi giấm tự kỷ đột biến gen Rugose [10] IK nồng độ mg/ml cho thấy khả ức chế q trình peroxy hóa lipid Hàm lượng MDA dịch đồng thể đầu ruồi hai nhóm thấp so với nhóm ruồi bệnh lý, với khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa p < 0,001 Từ kết trên, nhận thấy cao chiết Chè đắng hai nồng độ mg/ml có tác dụng cải thiện tình trạng stress oxy hóa thơng qua khả ức chế q trình peroxy hóa lipid, bảo vệ tế bào thần kinh qua hỗ trợ cải thiện triệu chứng ASD 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Từ kết đạt được, chúng tơi kết luận sau: • Đã chứng minh cao chiết Chè đắng hai mức nồng độ mg/ml có tác dụng ức chế Lsd1 thông qua khả cải thiện sắc tố mắt ruồi giấm có tác dụng tương đương với Tranylcypromin mơ hình ruồi giấm đột biến gen Lsd1 • Đã chứng minh cao chiết Chè đắng có tác dụng cải thiện số rối loạn hành vi liên quan tới ASD mơ hình ruồi giấm đột biến gen Lsd1, thơng qua tiêu chí: - Cải thiện thiếu hụt hành vi tương tác cộng đồng ruồi giấm đột biến gen Lsd1 trưởng thành mức nồng độ mg/ml mg/ml - Cải thiện khả vận động ấu trùng ruồi giấm bậc thơng qua thử nghiệm bị trườn mức nồng độ mg/ml • Đã chứng minh cao chiết Chè đắng hai mức nồng độ mg/ml có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh mơ hình ruồi giấm đột biến gen Lsd1 thông qua khả chống oxy hóa - ức chế q trình peroxy hóa lipid não ruồi giấm đột biến gen Lsd1, qua hỗ trợ cải thiện triệu chứng ASD Đề xuất Chúng đề xuất tiến hành nghiên cứu thêm theo hướng sau: • Nghiên cứu tìm hiểu chế hóa sinh IK ấu trùng bậc ba ruồi giấm đột biến gen Lsd1 bao gồm đánh giá thay đổi cấu trúc thần kinh thông số liên quan đến cấu trúc thần kinh chiều dài nhánh, số lượng nhánh, số lượng nút thần kinh… • Nghiên cứu sàng lọc dược liệu có khả ức chế LSD1 mơ hình ruồi giấm đột biến gen Lsd1 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2022), Dược thư Quốc gia Việt Nam, Lần xuất thứ 3, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Nguyễn Tiến Bân Nguyễn Khắc Khôi (1999), "Tên khoa học chè đắng Việt Nam", Tạp chí Sinh học 21, tr 1-3 Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, Tập 1, NXB Khoa học Kỹ thuật Trần Văn Cơng Nguyễn Thị Hồng Yến (2017), "Tỉ lệ trẻ rối loạn phổ tự kỷ: Những số thống kê", Tạp chí Khoa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 62, tr 322-330 Phạm Thị Nguyệt Hằng, cs (2022), "Cao chiết Rau đắng biển (Bacopa monnieri) cải thiện hành vi tự kỷ theo chế liên quan đến protein PTEN mơ hình chuột thực nghiệm gây muối natri valproat", Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Phạm Thị Nguyệt Hằng, cs (2020), "Tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ chè đắng mơ hình chuột nhắt tự kỷ gây natri valproat", Tạp chí Dược liệu 25, tr 50-55 Trương Thị Quỳnh Hoa Lê Thành Tụ (2013), Tìm hiểu hoạt tính sinh học số cao trích từ Chè đắng Cao Bằng (Ilex kaushue), Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM Nguyễn Thị Hương (2018), Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ chuột bị vùng khứu giác tác dụng bảo vệ thần kinh cao saponin toàn phần từ chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng), Luận văn Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, ĐHDHN Đặng Thị Mai Huy (2003), Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh 10 học chè đắng (Ilex kaushue S.Y.Hu), Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Đinh Thị Minh (2022), Đánh giá tác dụng sơ chế tác dụng số phân đoạn từ cao chiết N Butanol từ chè đắng (Ilex KudingCha C.J TSeng) mơ hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội 11 Phạm Minh Mục (2020), Nghiên cứu xây dựng mơ hình phát sớm, can thiệp 12 sớm giáo dục cho trẻ em rối loạn phổ tự kỉ Việt Nam dựa vào gia đình cộng đồng, Viện Khoa học Giáo dục Việt Nam Phạm Thị Bích Phượng (2020), Nghiên cứu tác dụng sinh học bước đầu tìm hiểu chế hóa sinh Ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus w.w smith), Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội 13 14 Sở Khoa học công nghệ môi trường tỉnh Cao Bằng (2002), Cây Chè đắng - giá trị kinh tế kỹ thuật trồng, Tài liệu phổ biến KHKT Nguyễn Hữu Sơn (2019), Nghiên cứu tác dụng bước đầu nghiên cứu chế hóa sinh cao chiết saponin chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) mơ hình ruồi giấm chuyển gen gây bệnh Alzheimer, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại 15 học Dược Hà Nội Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật (Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam) (2003), Danh mục loài thực vật Việt Nam, Tập 2, NXB Nông nghiệp Tiếng Anh 16 Adams M D., et al (2000), "The genome sequence of Drosophila melanogaster", Science 287(5461), pp 2185-95 17 American Psychiatric Association (2013), Diagnostic and Statistical Manual of 18 19 20 21 22 Mental Disorders, 50-59 Atwood HL, Govind CK, and Wu C (1993), "Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae" 24(8), pp 1008-1024 Baba R., et al (2021), "LSD1 enzyme inhibitor TAK-418 unlocks aberrant epigenetic machinery and improves autism symptoms in neurodevelopmental disorder models", Sci Adv 7(11) Baio J., et al (2018), "Prevalence of Autism Spectrum Disorder Among Children Aged Years - Autism and Developmental Disabilities Monitoring Network, 11 Sites, United States, 2014", MMWR Surveill Summ 67(6), pp 1-23 Banerjee S., Riordan M, and Bhat M A., "Genetic aspects of autism spectrum disorders: insights from animal models"(1662-5102 (Print)) Baxter A J., et al (2015), "The epidemiology and global burden of autism spectrum disorders", Psychol Med 45(3), pp 601-13 23 Borycz J., et al (2008), "Drosophila ABC transporter mutants white, brown and 24 scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain", J Exp Biol 211(Pt 21), pp 3454-66 Brugha T S., et al (2016), "Epidemiology of autism in adults across age groups and 25 ability levels", Br J Psychiatry 209(6), pp 498-503 Chaliha D., et al (2020), "A Systematic Review of the Valproic-Acid-Induced 26 Rodent Model of Autism", Dev Neurosci 42(1), pp 12-48 Chen Yi., LI Kaishuang, and Xie Tanggui (1994), "Hypotensive action of the extract of kudingchadongqingye (Ilex kudingcha)" 27 Christensen J., et al (2013), "Prenatal valproate exposure and risk of autism spectrum disorders and childhood autism", Jama 309(16), pp 1696-703 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Fang Y., et al (2020), "Natural products as LSD1 inhibitors for cancer therapy", Acta Pharm Sin B 11(3), pp 621-31 Fang Yuan, Liao Guochao, and Yu Bin (2019), "LSD1/KDM1A inhibitors in clinical trials: advances and prospects", Journal of Hematology & Oncology 12(1), p 129 Fernández-Moreno M A., et al (2007), "Drosophila melanogaster as a model system to study mitochondrial biology", Methods Mol Biol 372, pp 33-49 Fortini M E., et al (2000), "A survey of human disease gene counterparts in the Drosophila genome", J Cell Biol 150(2), pp F23-30 Hao Dacheng, et al (2013), "Research progress in the phytochemistry and biology of Ilex pharmaceutical resources", Acta Pharmaceutica Sinica B 3(1), pp 8-19 Hoang V M., et al., "Prevalence of autism spectrum disorders and their relation to selected socio-demographic factors among children aged 18-30 months in northern Vietnam, 2017"(1752-4458 (Print)) Holowatyj Andreana, Yang Zeng-Quan, and Pile Lori A (2015), "Histone lysine demethylases in Drosophila melanogaster", Fly 9(1), pp 36-44 Hulbert S W and Jiang Y H (2016), "Monogenic mouse models of autism spectrum disorders: Common mechanisms and missing links", Neuroscience 321, pp 3-23 Idring S., et al (2014), "Parental age and the risk of autism spectrum disorders: findings from a Swedish population-based cohort", Int J Epidemiol 43(1), pp 10715 Jarecki J and Keshishian H (1995), "Role of neural activity during synaptogenesis in Drosophila", J Neurosci 15(12), pp 8177-90 38 Kim J Y., et al (2015), "Ilex latifolia Prevents Amyloid β Protein (25-35)-Induced 39 Memory Impairment by Inhibiting Apoptosis and Tau Phosphorylation in Mice", J Med Food 18(12), pp 1317-26 Lampi K M., et al (2012), "Risk of autism spectrum disorders in low birth weight 40 and small for gestational age infants", J Pediatr 161(5), pp 830-6 Lee Min Gyu, et al (2006), "Histone H3 Lysine Demethylation Is a Target of 41 Nonselective Antidepressive Medications", Chemistry & Biology 13(6), pp 563567 Li L., et al (2013), "The large-leaved Kudingcha (Ilex latifolia Thunb and Ilex kudingcha C.J Tseng): a traditional Chinese tea with plentiful secondary metabolites and potential biological activities", J Nat Med 67(3), pp 425-37 42 Li L., et al (2013), "The large-leaved Kudingcha (Ilex latifolia Thunb and Ilex kudingcha C.J Tseng): a traditional Chinese tea with plentiful secondary metabolites and potential biological activities", J Nat Med 67(3), pp 425-37 43 Loomes R., Hull L., and Mandy W P L (2017), "What Is the Male-to-Female Ratio in Autism Spectrum Disorder? A Systematic Review and Meta-Analysis", J Am Acad Child Adolesc Psychiatry 56(6), pp 466-474 Lord C., et al (2020), "Autism spectrum disorder", Nat Rev Dis Primers 6(1), p 44 45 46 47 48 49 50 51 Lyall K., et al (2014), "Maternal immune-mediated conditions, autism spectrum disorders, and developmental delay", J Autism Dev Disord 44(7), pp 1546-55 Mariateresa Allocca, Sheri Zola, and Paola Bellosta (2018), "The Fruit Fly, Drosophila melanogaster: Modeling of Human Diseases (Part II)", in Farzana Khan Perveen, Editor, Drosophila melanogaster, IntechOpen, Rijeka, p Ch Menon Kaushiki P, Carrillo Robert A, and Zinn Kai (2013), "Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction" 2(5), pp 647-670 Moore G S., et al (2012), "Autism risk in small- and large-for-gestational-age infants", Am J Obstet Gynecol 206(4), pp 314.e1-9 Nichols C D., Becnel J., and Pandey U B (2012), "Methods to assay Drosophila behavior", J Vis Exp(61) Nicolini C and Fahnestock M (2018), "The valproic acid-induced rodent model of autism", Exp Neurol 299(Pt A), pp 217-227 Pandey U B and Nichols C D (2011), "Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery", Pharmacol Rev 63(2), pp 411-36 52 Pham H T N., et al (2021), "Ilex kudingcha C.J Tseng Mitigates Phenotypic 53 Characteristics of Human Autism Spectrum Disorders in a Drosophila Melanogaster Rugose Mutant", Neurochem Res 46(8), pp 1995-2007 Rapanelli M., et al (2022), "Targeting histone demethylase LSD1 for treatment of 54 deficits in autism mouse models", Mol Psychiatry 27(8), pp 3355-3366 Real M D., Ferre J., and Mensua J L (1985), "Methods for the quantitative 55 estimation of the red and brown pigments of Drosophila melanogaster", Drosophila Information Service 61, pp 198-199 Reiter L T., et al (2001), "A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster", Genome Res 11(6), pp 1114-25 56 Ozonoff S., et al (2011), "Recurrence risk for autism spectrum disorders: a Baby 57 58 Siblings Research Consortium study", Pediatrics 128(3), pp e488-95 Sandin S., et al (2014), "The familial risk of autism", Jama 311(17), pp 1770-7 Schmidt R J., et al (2012), "Maternal periconceptional folic acid intake and risk of 59 autism spectrum disorders and developmental delay in the CHARGE (CHildhood Autism Risks from Genetics and Environment) case-control study", Am J Clin Nutr 96(1), pp 80-9 Shi Y., et al (2004), "Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase 60 61 62 63 64 65 homolog LSD1", Cell 119(7), pp 941-53 Hoyer-Fender Sigrid (2020), "Transgenerational effect of drug-mediated inhibition of LSD1 on eye pigment expression in Drosophila", BMC Ecology 20(1), p 62 Simon A F., et al (2012), "A simple assay to study social behavior in Drosophila: measurement of social space within a group", Genes Brain Behav 11(2), pp 24352 Song C., et al (2016), "The Hypolipidemic Effect of Total Saponins from Kuding Tea in High-Fat Diet-Induced Hyperlipidemic Mice and Its Composition Characterized by UPLC-QTOF-MS/MS", J Food Sci 81(5), pp H1313-9 Song Jia-Le, et al (2013), "Anti-inflammatory effects of kudingcha methanol extract (Ilex kudingcha C.J Tseng) in dextran sulfate sodium-induced ulcerative colitis", Mol Med Rep 8(4), pp 1256-1262 Subedi Rambhadur, Vartak Rekha, and Kale Purushottam (2017), "Management of stress exerted by hydrogen peroxide in Drosophila melanogaster using Abhrak bhasma", Journal of Applied Pharmaceutical Science 7, pp 65-71 Thuong Phuong Thien, et al (2009), "Antioxidant activity and principles of Vietnam bitter tea Ilex kudingcha", Food Chemistry 113(1), pp 139-145 66 Tick B., et al (2016), "Heritability of autism spectrum disorders: a meta-analysis of 67 twin studies", J Child Psychol Psychiatry 57(5), pp 585-95 Ueoka I., et al (2020), "Autism Spectrum Disorder-Related Syndromes: Modeling with Drosophila and Rodents ", Int J Mol Sci 21(21) 68 Vallianatos C N and Iwase S (2015), "Disrupted intricacy of histone H3K4 methylation in neurodevelopmental disorders", Epigenomics 7(3), pp 503-19 69 Wan P., et al (2019), "Anti-inflammatory effects of dicaffeoylquinic acids from Ilex kudingcha on lipopolysaccharide-treated RAW264.7 macrophages and potential mechanisms", Food Chem Toxicol 126, pp 332-342 70 Wang Zheng and Clifford Michael N (2008), "Analysis of chlorogenic acids in beverages prepared from Chinese health foods and investigation, in vitro, of effects 71 72 73 74 75 76 77 78 on glucose absorption in cultured Caco-2 cells" 108(1), pp 369-373 Wise A., et al (2015), "Drosophila mutants of the autism candidate gene neurobeachin (rugose) exhibit neuro-developmental disorders, aberrant synaptic properties, altered locomotion, and impaired adult social behavior and activity patterns", J Neurogenet 29(2-3), pp 135-43 Wüpper S., Lüersen K., and Rimbach G (2020), "Chemical Composition, Bioactivity and Safety Aspects of Kuding Tea-From Beverage to Herbal Extract", Nutrients 12(9) Wynder C., Stalker L., and Doughty M L (2010), "Role of H3K4 demethylases in complex neurodevelopmental diseases", Epigenomics 2(3), pp 407-18 Zeidan J., et al (2022), "Global prevalence of autism: A systematic review update", Autism Res 15(5), pp 778-790 Zerbo O., et al (2015), "Interpregnancy Interval and Risk of Autism Spectrum Disorders", Pediatrics 136(4), pp 651-7 Zhang CK (1994), "Survey of Kudingcha original plant and commodity" 17, pp 1314 Zhu F., et al (2009), "Comparison of major phenolic constituents and in vitro antioxidant activity of diverse Kudingcha genotypes from Ilex kudingcha, Ilex cornuta, and Ligustrum robustum", J Agric Food Chem 57(14), pp 6082-9 Zhu LF, et al (1994), "The cardiovascular pharmacological research on Kudingcha" 17, pp 37-40 Tiếng Pháp 79 Sepel L.M.N and E.L.S Loreto (2010), "Um século de Drosophila na genética Genética na Escola", pp 42-47 Trang Web 80 Be Aware of Potentially Dangerous Products and Therapies that Claim to Treat Autism (2019), accessed 8/5/2023, from https://www.fda.gov/consumers/consumerupdates/be-aware-potentially-dangerous-products-and-therapies-claim-treatautism 81 Medication Treatment for Autism (2021), accessed 1/5/2023, from https://www.nichd.nih.gov/health/topics/autism/conditioninfo/treatments/medicatio n-treatment#f3 PHỤ LỤC Phụ lục Sơ đồ quy trình chiết xuất cao tiêu chuẩn Chè đắng Lá Chè đắng o Cồn 65% (tỷ lệ 1/10 w/v) Sấy khô (50 C), nghiền nhỏ Bột CĐ khô Ngâm (48,6 giờ) Dịch chiết cồn o Nước (tỷ lệ 4/1) Cô (áp suất thấp, 50 C) đến tỷ lệ 1:2 w/v Cắn Phân tán, để qua đêm, lọc bỏ tủa Dịch lọc o Sấy chân không (60 C) Cao chiết (hàm ẩm < 5%) Phụ lục Phương trình hồi quy tuyến tính chất chuẩn MDA 1.0 y = 0,0258x + 0,0215 Độ hấp thụ 0.8 R2 = 0,9994 0.6 0.4 0.2 0.0 10 15 20 25 Hàm lượng MDA (nmol/ml) 30 35