NGUYỄN THỊ THU HẰNG TỔNG hợp và ĐÁNH GIÁ tác DỤNG KHÁNG UNG THƯ của một số dẫn CHẤT n ACYLHYDRAZON mới LAI hóa ONCRASIN 1 HƯỚNG HOẠT hóa ENZYM CASPASE KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HẰNG Mã sinh viên: 1701162 TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT N-ACYLHYDRAZON MỚI LAI HÓA ONCRASIN-1 HƯỚNG HOẠT HÓA ENZYM CASPASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Phan Thị Phương Dung TS Đỗ Thị Mai Dung Nơi thực Bộ mơn Hóa dược HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất người đồng hành, hỗ trợ động viên tơi suốt q trình nghiên cứu khoa học thực khóa luận tốt nghiệp Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Hải Nam, PSG.TS Phan Thị Phương Dung, TS Đỗ Thị Mai Dung, TS Dương Tiến Anh Thầy cô anh tận tình hướng dẫn tơi từ ngày đầu chập chững làm nghiên cứu khoa học, đưa lời khun bổ ích động viên tơi lúc khó khăn, giúp tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp cách tốt Tôi xin gửi lời cảm ơn đến giảng viên, anh chị kĩ thuật viên Bộ mơn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Thầy cô anh chị tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè tất thành viên tham gia nghiên cứu khoa học mơn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt anh Bùi Xuân Trường, chị Hoàng Bảo Ngọc, anh Phan Huy Đức, bạn Trịnh Thị Minh Ngọc, bạn Nguyễn Quang Thế Vũ, bạn Nguyễn Đức Thịnh, em K73, K74 nhóm nghiên cứu Tổng hợp hóa dược Sự đồng hành giúp đỡ người nguồn động viên to lớn suốt thời gian thực nghiên cứu Với lòng biết ơn chân thành nhất, xin cảm ơn giúp đỡ tất người Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hằng MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC SƠ ĐỒ DANH MỤC BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Enzym caspase .2 1.1.1 Giới thiệu enzym caspase .2 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Cấu trúc chung caspase 1.1.4 Cơ chế hoạt hóa enzym caspase trình apoptosis .5 1.1.5 Enzym caspase-3 sinh lý bệnh ung thư 1.2 Các chất hoạt hóa enzym caspase-3 1.2.1 Chất hoạt hóa procaspase-3 - PAC-1 1.2.3 Các dẫn chất khác 1.3 Quinazolin ứng dụng điều trị ung thư 10 1.3.1 Quinazolin dẫn chất 10 1.3.2 Các phương pháp tổng hợp khung quinazolin-4(3H)-on 11 1.4 Oncrasin-1 hoạt tính kháng ung thư .13 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15 2.1.1 Hóa chất 15 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ .15 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1 Tổng hợp hóa học .16 2.2.2 Đánh giá tác dụng sinh học dẫn chất tổng hợp 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu .16 2.3.1 Hóa học 16 2.3.2 Đánh giá hoạt tính sinh học .17 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 Hóa học 19 3.1.1 Tổng hợp hóa học .19 3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết .27 3.1.3 Khẳng định cấu trúc 28 3.2 Hoạt tính sinh học 32 3.2.1 Đánh giá độc tính tế bào ung thư .32 3.2.2 Đánh giá khả hoạt hóa caspase-3 33 3.3 Bàn luận .34 3.3.1 Tổng hợp hóa học .34 3.3.2 Khẳng định cấu trúc 36 3.3.3 Hoạt tính sinh học 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 5-FU 5-fluorouracil Ac-DEVD-pNA Acetyl Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilid Bcl-2 CARD B-cell lymphoma Vùng tương tác tập hợp caspase (Caspase recruitment domain) d Vạch đôi (doublet) DCM Diclomethan DED Vùng tương tác gây chết (Death effector domain) DMF N,N-dimethylformamid DMSO Dimethyl sulfoxid EC50 Nồng độ hiệu 50% (The half maximal effective concentration) ESI Ion hóa phun mù điện tử (Electrospray ionization) EtOH Ethanol FAM-DEVD-fmk Chất phát huỳnh quang ức chế caspase-3 FasL Phối tử gây chết Fas (Fas ligand) FDA Cơ quan quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ (U.S Food and Drug Aministratrion) h Giờ IC50 Nồng độ ức chế tối đa 50% ICE (The half maximal inhibitory concentration) Enzym chuyển hóa interleukin-1β (Interleukin-1β-converting enzyme) IPA Chất ức chế protein apoptosis (Inhibitors of protein apoptosis) IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) J KRIBB Hằng số tương tác Viện nghiên cứu sinh học công nghệ sinh học Hàn Quốc (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) m Đa vạch (multiplet) MCF-7 MeOH Tế bào ung thư vú người Methanol MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry) NCI-H23 Ung thư phổi không tế bào nhỏ người NMDA N-methyl-D-aspartat receptor p53 Protein ức chế khối u PAC-1 Chất hoạt hóa procaspase-3 (Procaspase-activating compound 1) PARP Poly(ADP-ribose) polymerase PBS Dung dịch muối đệm phosphat (Phosphate-buffered saline) PC3 Ung thư biểu mô tuyến tiền liệt người PKCι Protein kinase C-ι Rf Hệ số lưu giữ s Vạch đơn (Singlet) SRB Sulforhodamin B SW620 Ung thư đại tràng người Tnc Nhiệt độ nóng chảy T29 Tế bào biểu mô buồng trứng người T29Ht1 Tế bào T29 đột biến gen H-Ras T29Kt1 Tế bào T29 đột biến gen K-Ras TLC Sắc kí lớp mỏng (Thin layer chromatography) TMS TNF Tetramethylsilan Yếu tố hoại tử khối u (Tumor necrosis factor) TRAIL Phối tử kích hoạt apoptosis liên quan đến TNF (TNF-related apoptosis-inducing ligand) U937 Tế bào ung thư hạch bạch huyết người ν Dao động hóa trị δ Độ dịch chuyển hóa học (ppm) DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Hiệu suất toàn phần trình tổng hợp dẫn chất Va-f 27 Bảng 3.2 Giá trị Rf nhiệt độ nóng chảy dẫn chất Va-f 28 Bảng 3.3 Kết phổ IR dẫn chất Va-f 28 Bảng 3.4 Kết phổ MS dẫn chất Va-f 29 Bảng 3.5 Kết phổ 1H-NMR dẫn chất Va-f 30 Bảng 3.6 Kết phổ 13C-NMR dẫn chất Va-f 31 Bảng 3.7 Kết đánh giá độc tính số dịng tế bào ung thư 33 Bảng 3.8 Kết đánh giá khả hoạt hóa caspase-3 dẫn chất Vc 33 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Q trình apoptosis hoại tử tế bào Hình 1.2 Phân loại caspase Hình 1.3 Cấu trúc chung caspase Hình 1.4 Hai đường hoạt hóa q trình apoptosis Hình 1.5 Sự phân cắt tái xếp chuỗi protein trình hoạt hóa enzym caspase Hình 1.6 Cấu trúc PAC-1 Hình 1.7 Cơ chế hoạt hóa procaspase-3 PAC-1 Hình 1.8 Cấu trúc S-PAC-1 Hình 1.9 Cấu trúc WF-210 WF-208 10 Hình 1.10 Cấu trúc quinazolin dẫn chất quinazolinon 10 Hình 1.11 Một số thuốc điều trị ung thư có cấu trúc quinazolin cấp phép FDA 11 Hình 1.12 Cấu trúc oncrasin-1 13 Hình 3.1 Phổ hồng ngoại dẫn chất Vb 37 Hình 3.2 Phổ khối lượng dẫn chất Va 38 Hình 3.3 Các cấu dạng có dẫn chẫn Va-f 39 Hình 3.4 Các tương tác cấu dạng syn-E anti-E 40 Hình 3.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR dẫn chất Va 40 Hình 3.6 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR dẫn chất Va 41 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1 Quy trình tổng hợp 2-ethoxy-4(3H)-quinazolinon theo Griess cộng 11 Sơ đồ 1.2 Phản ứng Niementowski 12 Sơ đồ 1.3 Quy trình tổng hợp dẫn chất quinazolin-4(3H)-on sử dụng tác nhân Vilsmeier 12 Sơ đồ 1.4 Quy trình tổng hợp Piriqualon 12 Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp dẫn chất Va-f 19 Sơ đồ 3.2 Phản ứng tổng hợp chất trung gian IIa 19 Sơ đồ 3.3 Phản ứng tổng hợp chất trung gian IIIa 20 Sơ đồ 3.4 Phản ứng tổng hợp chất trung gian IVa 20 Sơ đồ 3.5 Phản ứng tổng hợp dẫn chất Va 21 Sơ đồ 3.6 Quy trình tổng hợp dẫn chất Vb 21 Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hợp dẫn chất Vc 22 Sơ đồ 3.8 Quy trình tổng hợp dẫn chất Vd 24 Sơ đồ 3.9 Quy trình tổng hợp dẫn chất Ve 25 Sơ đồ 3.10 Quy trình tổng hợp dẫn chất Vf 26 Sơ đồ 3.11 Cơ chế đề xuất cho phản ứng tổng hợp chất trung gian IIa-f 34 Sơ đồ 3.12 Cơ chế đề xuất cho phản ứng tổng hợp chất trung gian IIIa-f 35 Sơ đồ 3.13 Cơ chế đề xuất cho phản ứng tổng hợp chất trung gian IVa-f 35 Sơ đồ 3.14 Cơ chế đề xuất cho phản ứng tổng hợp dẫn chất Va-f 36 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Kết độc tính tế bào dẫn chất Va-f 42 Biểu đồ 3.2 Kết đánh giá khả hoạt hóa caspase-3 dẫn chất Vc43 CTPT: C26H19ClFN5O2 M = 487,1211 Phụ lục 12: Phổ khối lượng MS dẫn chất Vf PL-12 Phụ lục 13: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR dẫn chất Va PL-13 Phụ lục 14: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR dẫn chất Vb PL-14 Phụ lục 15: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR dẫn chất Vc PL-15 Phụ lục 16: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR dẫn chất Vd PL-16 Phụ lục 17: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR dẫn chất Ve PL-17 Phụ lục 18: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR dẫn chất Vf PL-18 Phụ lục 19: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR dẫn chất Va PL-19 Phụ lục 20: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR dẫn chất Vb PL-20 Phụ lục 21: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR dẫn chất Vc PL-21 Phụ lục 22: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR dẫn chất Vd PL-22 Phụ lục 23: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR dẫn chất Ve PL-23 Phụ lục 24: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR dẫn chất Vf PL-24 College of Pharmacy, Chungbuk National University, 12 Gaesin, Heungduk, Cheongju, Chungbuk 361-763, KOREA Report on Bioactivity of Compounds Cytotoxicity of series Cpd 5a 5b 5c 5d 5e 5f 5g 5h 5i 5j 5k 5l 5m 5-FU PAC-1 Oncrasin-1 Cytotoxicity (IC50,2 M)/Cell lines3 SW620 PC3 NCI-H23 1.01±0.045 3.46±0.082 0.79±0.033 3.32±0.096 0.51±0.049 0.87±0.084 1.21±0.062 0.49±0.014 1.12±0.006 2.82±0.019 1.10±0.051 3.15±0.091 >10 8.84±1.92 2.63±0.016 2.69±0.031 1.05±0.087 3.36±0.031 0.51±0.050 2.76±0.091 0.81±0.061 0.44±0.023 1.16±0.052 0.84±0.030 1.18±0.009 2.97±0.267 0.96±0.053 3.71±0.167 >10 13.61±0.46 2.98±0.139 2.41±0.021 0.63±0.002 1.79±0.080 0.70±0.057 1.35±0.026 0.46±0.007 0.62±0.050 0.92±0.048 0.50±0.023 1.05±0.070 2.26±0.035 0.79±0.008 2.43±0.198 >10 13.45±3.92 2.60±0.012 2.15±0.019 Phụ lục 25: Giấy chứng nhận hoạt tính sinh học PL-25 Va Vb Vc Vd Ve Vf BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HẰNG TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT N-ACYLHYDRAZON MỚI LAI HÓA ONCRASIN-1 HƯỚNG HOẠT HÓA ENZYM CASPASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2022 ... oncrasin-1 - dẫn chất có hoạt tính kháng ung thư [16] tiến hành đề tài ? ?Tổng hợp đánh giá tác dụng kháng ung thư số dẫn chất N-acylhydrazon lai hóa oncrasin-1 hướng hoạt hóa enzym caspase? ?? với... ngun hợp phần quinazolin tiến hành tổng hợp, đánh giá tác dụng kháng ung thư số dẫn chất acetohydrazid lai hóa oncrasin-1 Đề tài khóa luận tốt nghiệp tơi phần thu? ??c nghiên cứu Chi tiết nội dung,... (Vf) 2.2.2 Đánh giá tác dụng sinh học dẫn chất tổng hợp - Đánh giá khả gây độc tế bào dòng tế bào ung thư: ung thư đại tràng người (SW620), ung thư tuyến tiền liệt người (PC3), ung thư phổi không