NGUYỄN QUANG THẾ vũ TỔNG hợp và THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG tế bào UNG THƯ của một số dẫn CHẤT ACETOHYDRAZID mới MANG dị VÒNG 2 OXOINDOLIN HƯỚNG HOẠT HOÁ ENZYM CASPASE KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN QUANG THẾ VŨ TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT ACETOHYDRAZID MỚI MANG DỊ VỊNG 2-OXOINDOLIN HƯỚNG HOẠT HỐ ENZYM CASPASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2022 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN QUANG THẾ VŨ Mã sinh viên: 1701679 TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT ACETOHYDRAZID MỚI MANG DỊ VÒNG 2-OXOINDOLIN HƯỚNG HOẠT HỐ ENZYM CASPASE KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đỗ Thị Mai Dung TS Dương Tiến Anh Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa Dược HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Trước trình bày phần nội dung đề tài khóa luận mình, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người suốt thời gian qua hỗ trợ, động viên giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp cách tốt Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến với người thầy, người đáng kính tơi: GS TS Nguyễn Hải Nam, PGS TS Phan Thị Phương Dung, PGS TS Trần Phương Thảo, TS Đỗ Thị Mai Dung - Bộ mơn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội Thầy cô tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành khóa luận mà ln có dẫn xác, kịp thời động viên tơi lúc khó khăn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, cô giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ mơn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Trường Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực khóa luận Cuối cùng, tơi muốn cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị bạn nhóm nghiên cứu mơn Hóa Dược khố 70, 71, 72 hỗ trợ gắn bó suốt quãng thời gian nghiên cứu Đặc biệt TS Dương Tiến Anh, anh ln tận tình bảo giúp tơi vượt qua khó khăn ngày đầu chập chững làm quen với môi trường công việc nghiên cứu Hà Nội, ngày 24 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Quang Thế Vũ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) 1.1.1 Giới thiệu apoptosis 1.1.2 Các giai đoạn trình apoptosis 1.1.3 Sự chết tế bào theo chương trình bệnh ung thư 1.2 Enzym caspase 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Cấu trúc 1.2.3 Phân loại 1.2.4 Vai trò enzym caspase chết tế bào theo chương trình 1.3 Các chất hoạt hóa enzym caspase 1.3.1 Vai trò ion kẽm hoạt hóa hoạt động caspase-3 1.3.2 Một số chất hoạt hóa caspase-3 1.4 Hoạt tính sinh học số dẫn chất mang khung 2-oxoindolin 12 1.4.1 Hoạt tính kháng tế bào ung thư 12 1.4.2 Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm 14 1.4.3 Hoạt tính kháng virus 15 1.4.4 Một số hoạt tính sinh học khác 15 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 17 2.1.1 Hóa chất 17 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.2.1 Hóa học 18 2.2.2 Thử hoạt tính sinh học dẫn chất tổng hợp 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Hoá học 18 2.3.2 Thử hoạt tính sinh học 19 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 Hoá học 22 3.1.1 Tổng hợp hoá học 22 3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 28 3.1.3 Khẳng định cấu trúc 29 3.2 Thử hoạt tính sinh học 35 3.2.1 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 35 3.2.2 Thử tác dụng hoạt hoá enzym caspase-3 36 3.3 Bàn luận 37 3.3.1 Tổng hợp hoá học 37 3.3.2 Khẳng định cấu trúc 42 3.3.3 Thử hoạt tính sinh học 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị carbon-13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) 5-FU AcOH ADN : 5-Fluorouracil : Acid acetic : Acid deoxyribonucleic APAF-1 : Nhân tố hoạt hoá enzym protease apoptosis (Apoptotic protease activating factor 1) ASAP HTS : Giải trình tự Amplicon thông lượng cao (Amplicon Sequence Analysis Pipeline High-Throughput Sequencing) Bad Bak Bax Bcl-2 Bel-7402 : : : : : Bid Bim BIODS CDK d dADP : BH3-interacting domain death agonist : Bcl-2-like protein 11 : Tổng hợp thuốc theo định hướng sinh học (Biology-oriented drug synthesis) : Miền tổ hợp hoạt hoá caspase (Caspase activation and recruitment domain) : Kinase phụ thuộc cyclin (Cyclin-dependent kinase) : Pic đôi phổ 1H-NMR (Doublet) : Deoxyadenosin diphosphat dATP DCM dd DD DED DISC DMA DMEM : : : : : : : : DMF DMSO : Dimethylformamid : Dimethylsulfoxid CARD Bcl-2-associated agonist of cell death Bcl-2 homologous antagonist killer Bcl-2-associated X protein B-cell lymphoma Dòng tế bào ung thư biểu mô gan người Deoxyadenosin triphosphat Dicloromethan Pic đôi lần phổ 1H-NMR (Doublet of doublet) Miền gây chết (Death domain) Miền gây hiệu ứng chết (Death effector domain) Phức hợp tín hiệu gây chết (Death-inducing signaling complex) N,N-dimethylacetamid Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO-d6 : Dimethylsulfoxid deuteri hóa ESI : Ion hóa phun bụi điện tử (Electrospray ionization) EtOH : Ethanol FADD : Protein có miền gây chết liên kết với thụ thể Fas FAK FBS (Fas-associated death domain protein) : Kinase kết dính khu trú (Focal adhesion kinase) : Huyết bào thai bò (Fetal Bovine Serum) FDA : Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (U.S Food and Drug Administration) H (%) : Hiệu suất (%) HCT-116 : Dòng tế bào ung thư đại trực tràng người HIV-1 RT : Enzym phiên mã ngược virus HIV-1 (HIV-1 reverse transcriptase) HIV-1-IIIB : Human Immunodeficiency Virus type (IIIB Strain) HL-60 HOMO HRMS : Dòng tế bào ung thư bạch cầu người : Highest Occupied Molecular Orbital : Phổ khối lượng độ phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy) IC50 ICE : Nồng độ ức chế 50% (The half maximal inhibitory concentration) : Enzym chuyển hoá interleukin-1β (Interleukin-1β converting enzyme) : Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) : Hằng số ghép cặp phổ 1H-NMR (Hz) : Lowest Unoccupied Molecular Orbital : Đa pic phổ 1H-NMR (Multiplet) : Acetonitril : Methanol IR J LUMO m MeCN MeOH MIC MOMP MS NCI-60 NMP NNRTI : Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration) : Sự thẩm thấu qua màng ty thể (Mitochondrial outer membrane permeabilization) : Phổ khối lượng (Mass Spectrometry) : Nhóm gồm 60 dịng tế bào ung thư người Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ đưa vào nghiên cứu : N-methyl-2-pyrrolidon : Chất ức chế enzym phiên mã ngược nucleosid (Non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor) NOD : Miền liên kết nucleotid oligome hóa (Nucleotide-binding and oligomerization domain) Noxa : Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein OD : Mật độ quang (Optical Density) OVCAR-3 p53 PAC-1 : Dịng tế bào ung thư biểu mơ buồng trứng người : Gen áp chế khối u p53 (tumor protein p53) : Hợp chất hoạt hóa procaspase PBS (Procaspase-activating compound 1) : Dung dịch đệm phosphat (Phosphate-buffered saline) PC3 : Dịng tế bào ung thư biểu mơ tuyến tiền liệt PYK2 : Tyrosin kinase giàu prolin (Proline-rich tyrosine kinase 2) Rf : Hệ số lưu giữ sắc ký lớp mỏng RKO s : Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết người : Pic đơn phổ 1H-NMR (Singlet) SAR SJSA-1 SNU-398 SRB : : : : Liên quan cấu trúc - tác dụng (Structure-Activity Relationship) Dòng tế bào ung thư xương người Dịng tế bào ung thư biểu mơ gan người Sulforhodamin B SW620 t TLC TMS TNF tºnc UV VEGF : : : : : : : : Dòng tế bào ung thư đại tràng người Pic ba phổ 1H-NMR (Triplet) Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) Tetramethylsilan Yếu tố hoại tử khối u (Tumor necrosis factor) Nhiệt độ nóng chảy Tử ngoại (Ultraviolet) Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (Vascular endothelial growth factor) XIAP : Chất ức chế protein apoptosis liên kết với nhiễm sắc thể X (X-linked inhibitor of apoptosis protein) : Nhóm gắn kẽm (Zinc binding group) : Độ chuyển dịch hóa học (phần triệu) phổ NMR : Số sóng ứng với dao động hoá trị phổ IR ZBG δ (ppm) ν DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại enzym caspase Trang Bảng 3.1 Các số lý hố hiệu suất tồn phần dẫn chất IVa-g 28 Bảng 3.2 Kết kiểm tra độ tinh khiết dẫn chất IVa-g 29 Bảng 3.3 Kết phân tích phổ hồng ngoại dẫn chất IVa-g 29 Bảng 3.4 Kết phân tích phổ khối lượng dẫn chất IVa-g 30 Bảng 3.5 Kết phân tích phổ 1H-NMR dẫn chất IVa-g 31 Bảng 3.6 Kết phân tích phổ 13C-NMR dẫn chất IVa-g 33 Bảng 3.7 Kết thử hoạt tính kháng tế bào ung thư dẫn chất IVa-g 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Các giai đoạn trình apoptosis Trang Hình 1.2 Q trình hoạt hóa apoptosis thơng qua enzym caspase Hình 1.3 Cấu trúc chung hợp chất N-acylhydrazon (a) cấu trúc phức chất N-acylhydrazon với ion kẽm (b) Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo hợp chất PAC-1 10 Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo hợp chất WF-210 WF-208 10 Hình 1.6 Cơng thức cấu tạo hợp chất 11 Hình 1.7 Công thức cấu tạo hợp chất 11 Hình 1.8 Liên quan cấu trúc - hoạt tính kháng tế bào ung thư (SAR) dẫn 12 chất 2-oxoindolin Hình 1.9 Cơng thức cấu tạo Sunitinib Semaxanib 13 Hình 1.10 Cơng thức cấu tạo hợp chất 10 13 Hình 1.11 Cơng thức cấu tạo hợp chất 11 14 Hình 1.12 Cơng thức cấu tạo hợp chất 12 13 14 Hình 1.13 Cơng thức cấu tạo hợp chất 14 15 Hình 1.14 Cơng thức cấu tạo ba hợp chất 15, 16, 17 15 Hình 1.15 Cơng thức cấu tạo số dẫn chất 2-oxoindolin mang hoạt tính sinh học Hình 3.1 Biểu đồ kết thử tác dụng hoạt hố enzym caspase-3 dẫn chất IVg Hình 3.2 Các sản phẩm C-alkyl hố tạo thành sau phản ứng 16 Hình 3.3 Cơng thức cấu tạo sản phẩm phụ tạo thành 41 Hình 3.4 Phổ HRMS dẫn chất IVb 44 Hình 3.5 Công thức cấu tạo dẫn chất IVa-g 45 Hình 3.6 Các đồng phân cấu dạng có dẫn chất acetohydrazid 47 Hình 3.7 Cấu trúc cộng hưởng liên kết amid 47 Hình 3.8 Sự xen phủ orbital σCO σ*NH hai đồng phân anti/E syn/E Hình 3.9 Khả tạo liên kết hydro liên phân tử đồng phân syn/E 48 Hình 3.10 Biểu đồ so sánh độc tính tế bào dẫn chất IVa-g với 5-FU 50 PAC-1 dòng tế bào ung thư thử nghiệm 36 39 49 Phụ lục 14 Phổ MS hợp chất IVg PL-14 Phụ lục 15 Phổ 1H-NMR hợp chất IVa PL-15 Phụ lục 16 Phổ 1H-NMR hợp chất IVb PL-16 Phụ lục 17 Phổ 1H-NMR hợp chất IVc PL-17 Phụ lục 18 Phổ 1H-NMR hợp chất IVd PL-18 Phụ lục 19 Phổ 1H-NMR hợp chất IVe PL-19 Phụ lục 20 Phổ 1H-NMR hợp chất IVf PL-20 Phụ lục 21 Phổ 1H-NMR hợp chất IVg PL-21 Phụ lục 22 Phổ 13C-NMR hợp chất IVa PL-22 Phụ lục 23 Phổ 13C-NMR hợp chất IVb PL-23 Phụ lục 24 Phổ 13C-NMR hợp chất IVc PL-24 Phụ lục 25 Phổ 13C-NMR hợp chất IVd PL-25 Phụ lục 26 Phổ 13C-NMR hợp chất IVe PL-26 Phụ lục 27 Phổ 13C-NMR hợp chất IVf PL-27 Phụ lục 28 Phổ 13C-NMR hợp chất IVg PL-28 ... Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN QUANG THẾ VŨ Mã sinh viên: 1701679 TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT ACETOHYDRAZID MỚI MANG DỊ VÒNG 2- OXOINDOLIN HƯỚNG HOẠT... DMSO-d6 2. 3 .2 Thử hoạt tính sinh học 2. 3 .2. 1 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro chất tổng hợp được thực khoa Dược, trường... 2. 2 .2 Thử hoạt tính sinh học dẫn chất tổng hợp - Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro dòng tế bào người, bao gồm: ung thư đại tràng (SW 620 ), ung thư biểu mô tuyến tiền liệt (PC3) ung thư