nguyễn thị nga tổng hợp và đánh giá tác dụng kháng ung thư của một số dẫn chất n hydroxybenzamid mới mang khung 4 oxoquinazolin

Từ cơ sở của các nghiên cứu trên, đề tài “Tổng hợp và đánh giá tác dụng kháng ung thư của một số dẫn chất N-hydroxybenzamid mới mang khung 4-oxoquinazolin” được thực hiện với hai mục t

TỔNG QUAN

HISTON DEACETYLASE

1.1.1 Giới thiệu về enzym histon deacetylase

Trong nhân tế bào người, các nucleosome cấu tạo lên nhiễm sắc thể được hình thành từ sợi ADN có độ dài khoảng 145 – 147 nucleotid quấn quanh lõi octamer histon bao gồm hai bản sao của mỗi loại protein histon: H2A, H2B, H3 và H4 [49] Các nghiên cứu chỉ ra rằng các biến đổi sau dịch mã (PTM – Post-translational modification) trên histon làm thay đổi điện tích và cấu trúc các đầu tận cùng của protein, từ đó gây ra sự thay đổi mức độ tháo xoắn của chất nhiễm sắc và cuối cùng gây kích hoạt hoặc ức chế quá trình phiên mã trong tế bào [39], [90] Các biến đổi này bao gồm acetyl hóa, methyl hóa, phosphoryl hóa, ubiquityl hóa, sumoyl hóa… trong đó quá trình acetyl hóa histon là một trong những biến đổi phổ biến nhất và đóng vai trò vô cùng quan trọng trong điều hòa biểu hiện gen [42]

Quá trình chuyển đổi giữa hai dạng acetyl hóa và deacetyl hóa của histon là một quá trình thuận nghịch và được xúc tác bởi hai loại enzym là histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) Enzym HAT có vai trò chuyển nhóm acetyl từ acetyl coenzym A vào nhóm ε-amino của lysin tận cùng trong chuỗi protein histon và làm cho nhóm ε-amino của lysin mất điện tích dương Điều này sẽ dẫn đến sự giảm tương tác giữa nhóm phosphat mang điện tích âm trên chuỗi ADN và protein histon, nhiễm sắc thể sẽ được tháo xoắn và tạo điều kiện cho quá trình phiên mã diễn ra [69] Ngược lại, các enzym HDAC xúc tác cho quá trình loại bỏ nhóm acetyl, làm cho đầu N của histon tích điện dương nhiều hơn Kết quả, histon tương tác mạnh với chuỗi ADN, nhiễm sắc thể cuộn xoắn gây ức chế quá trình phiên mã [71]

Hình 1.1 Vai trò của HDAC và HAT

3 Ngoài protein histon, các HDAC còn tham gia vào quá trình deacetyl hóa các protein mục tiêu khác bao gồm các yếu tố phiên mã như yếu tố ức chế khối u p53, họ Runx, yếu tố phiên mã GATA, NF-κB Nhìn chung, quá trình acetyl hóa các yếu tố phiên mã này giúp hoạt hóa quá trình phiên mã Bên cạnh đó, các HDAC còn deacetyl hóa một số protein tham gia vào quá trình phát triển, biệt hóa và apoptosis của tế bào Sự bất thường trong quá trình acetyl hóa và deacetyl các protein không histon này liên quan đến cơ chế của nhiều căn bệnh ung thư [30]

1.1.2 Phân loại Ở người, đến nay 18 loại enzym HDAC đã được phát hiện và được phân loại thành

2 họ và 4 nhóm dựa trên sự tương đồng cấu trúc với các HDAC của nấm men ( Bảng

Bảng 1.1 Phân loại các HDAC

Protein tương đồng ở nấm men (S cerevisiae)

Vị trí trong tế bào

Nhóm II Hda1 Phân nhóm IIa

Nhân tế bào, tế bào chất Phân nhóm IIb HDAC6,

Nhóm IV HDAC11 Nhân tế bào, tế bào chất

Họ Sir2 Nhóm III Sir2, Hst1-4 SIRT1-7

Nhân tế bào, tế bào chất, ty thể Trong đó, các HDAC nhóm I, II, IV được coi là các HDAC kinh điển, có cơ chế xúc tác phụ thuộc vào ion Zn 2+ và các enzym này bị ức chế bởi các chất có khả năng tạo phức chelat với ion Zn 2+ Ngược lại, các HDAC nhóm III là các sirtuin có cơ chế hoạt động phụ thuộc coenzym NAD + và không bị ức chế bởi các hợp chất trên [84] Trong khóa luận này, định nghĩa các chất ức chế HDAC được sử dụng cho các chất có mục tiêu tác động là nhóm các HDAC kinh điển

1.1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động

Mặc dù có cấu trúc đa dạng với số lượng các acid amin thay đổi từ 347 ở HDAC11 đến 1215 ở HDAC6, các HDAC phụ thuộc kẽm đều có vùng deacetylase được bảo tồn

4 [72] Đến nay, cấu trúc tinh thể bằng phương pháp nhiễu xạ tia X của hầu hết các HDAC đã được báo cáo, trừ HDAC 5, 9 và 11 Từ đó, cấu trúc trung tâm hoạt động các HDAC đã được xác định, nhìn chung gồm 2 phần: (1) Kênh enzym dạng hình túi dài và hẹp, gồm miệng túi, thân túi chứa cơ chất lysin ở dạng acetyl hóa của protein trong quá trình xúc tác và phần xúc tác trực tiếp loại nhóm acetat, (2) ion Zn 2+ nằm ở cuối kênh enzym, tham gia trực tiếp vào quá trình loại nhóm acetyl [55], [73]

Chú thích: SP: side pocket, LP: lower pocket, FP: foot pocket

A: HDAC2 người với phối tử vorinostat, PDB ID: 4LXZ

B: HDAC8 Schistosoma mansoni với cơ chất TH65, PDB ID: 6HTH

C: HDAC4 người với cơ chất là dẫn chất của acid cyclopropylhydroxamic, PDB ID: 4CBY

D: HDAC2 người với cơ chất là dẫn chất của p-thienyl-anilinobenzamid, PDB ID: 4LY1

Hình 1.2 Cấu trúc trung tâm hoạt động của các HDAC [55]

Bên cạnh đó, ngoài phần kênh enzym chính ở trên có mặt trong tất cả các HDAC, vùng xúc tác còn có thể có thêm các túi phụ như túi bên (side pocket), túi dưới (lower pocket) và túi chân (foot pocket) Các túi phụ này có thể được mở hoặc đóng phụ thuộc vào phối tử liên kết và các loại HDAC khác nhau [55] Ngoài miền xúc tác thứ nhất, ở các HDAC nhóm IIb còn tồn tại một miền xúc tác thứ hai có hoạt tính xúc tác hoặc không [31]

Hình 1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động của Y306F HDAC8 (PDB ID: 2V5W) [28]

Vào năm 2004, cấu trúc tinh thể của enzym HDAC8 nằm trong phức hợp với các chất ức chế HDAC có cấu trúc acid hydroxamic đã được công bố [73], [79] Trong đó,

5 bề mặt kênh enzym được cấu tạo từ một số acid amin kỵ nước như Phe, His, Tyr, Gly, Met có vai trò tạo liên kết van der Waals với cơ chất Ngoài ra, trong lòng kênh còn chứa một số phân tử nước tham gia vào quá trình deacetyl hóa của enzym Khi enzym xúc tác, ion Zn 2+ có thể tạo 3 liên kết phối trí với các acid amin (2 Asp và 1 His), 1 liên kết phối trí với nhóm acetyl của lysin đầu N đã được acetyl hóa của protein histon và 1 liên kết phối trí với 1 phân tử nước Khi tương tác với các chất ức chế, 2 liên kết phối trí với nhóm acetyl và với nước sẽ được thay thế bởi các liên kết với vùng gắn kẽm của chất ức chế

Việc nghiên cứu đầy đủ các đặc điểm cấu trúc trung tâm hoạt động của các HDAC góp phần giúp làm rõ cơ chế tác dụng của các chất ức chế đã biết cũng như tìm kiếm được các hợp chất tiềm năng có hoạt tính ức chế HDAC mới Đồng thời dựa trên hiểu biết về sự khác biệt trong đặc điểm cấu trúc trung tâm hoạt động của các HDAC, các chất ức chế chọn lọc đã được thiết kế giúp tăng hoạt tính và giảm các tác dụng không mong muốn

Một số cơ chế deacetyl hóa tại trung tâm hoạt động của HDLP (histon deacetylase- like protein) đã được đề xuất bởi các nhóm nghiên cứu của Finnin [24], Vanommeslaeghe [80] và Corminboeuf [17] Quá trình deaetyl hóa acetyl lysin đầu N của HDLP được thực hiện với sự tham gia của ion Zn 2+ và một số acid amin ở đáy kênh enzym như Asp258, Asp168, His170, Tyr297, cặp His131-Asp166, cặp His132- Asp173, trong đó Zn 2+ luôn tạo phức với 5 liên kết phối trí

Những năm tiếp theo, nhờ những hiểu biết về cấu trúc trung tâm hoạt động, cơ chế xúc tác của HDAC8 được đề xuất và dần hoàn thiện [27], [28] Nghiên cứu trên HDAC8 thể đột biến tại vị trí một số acid amin của Gantt và cộng sự cho thấy cặp His143-Asp183 đóng vai trò đồng xúc tác acid/base cho quá trình deacetyl Trong khi đó, cặp His142- Asp176 được đề xuất có vai trò tạo tương tác tĩnh điện giữa nhóm imidazol tích điện dương của His142 và trạng thái chuyển tiếp mang điện tích âm từ đó giúp ổn định hệ Ngoài ra, His142 còn giúp ổn định phân tử nước liên kết với ion kẽm Bên cạnh đó, Tyr306 tạo liên kết hydro với oxy trong nhóm carbonyl của acetyl lysin để ổn định cấu trúc trạng thái chuyển tiếp tứ diện [28]

Cấu trúc trung tâm hoạt động của các HDAC phụ thuộc kẽm hầu như được bảo tồn ở các nhóm Tuy nhiên, ở các HDAC thuộc nhóm IIa (HDAC4, 5, 7, 9), vai trò ổn định trạng thái chuyển tiếp của Tyr được thay thế bởi His Do vị trí của His được cho là quá xa nên không thể thay thế được chức năng của Tyr Vì vậy, hoạt tính xúc tác của các enzym nhóm IIa yếu hơn nhiều so với các nhóm khác [45]

Hình 1.4 Cơ chế xúc tác của HDAC8 được đề xuất bởi Gantt và cộng sự năm 2016

1.1.5 HDAC và bệnh lý ung thư

Các bất thường trong biểu hiện của các HDAC được công bố là có liên quan trong một số bệnh lý như thoái hóa thần kinh, rối loạn chuyển hóa, rối loạn miễn dịch, viêm nhiễm, tim mạch, hô hấp và đặc biệt trong ung thư [72], [77] Năm 2005, Fraga và cộng sự đã chứng minh rằng sự thiếu hụt trạng thái monoacetyl của histon H4 ở Lys16 là một dấu hiệu phổ biến trong các tế bào khối u Quá trình này diễn ra sớm và tích lũy trong sự hình thành khối u đã chứng tỏ mối liên hệ của HDAC đến căn bệnh ung thư [25] Trong một số loại ung thư, các HDAC nhóm I chủ yếu được quan sát thấy có sự biểu hiện quá mức so với tế bào thường [6] như các HDAC 1, 2, 3 trong ung thư tế bào thận [26], ung thư đại trực tràng và dạ dày [83], ung thư hạch Hodgkin cổ điển [1]; HDAC 8 trong u nguyên bào thần kinh ở trẻ em [62] Ngược lại, hoạt động của các HDAC nhóm IIa đóng vai trò kép trong ung thư bao gồm thúc đẩy tăng sinh hoặc ức chế khối u tùy thuộc vào điều kiện tế bào [6] Ở nhóm IIb, HDAC6 thường có mức độ biểu hiện cao trong sự hình thành các khối u trong khi đó HDAC10 có mức độ biểu hiện thấp hoặc cao tùy thuộc vào loại ung thư [6] Các nghiên cứu gần đây về thành viên phát hiện mới nhất của họ các histon deacetylase là HDAC11 cho thấy biểu hiện của enzym này hầu hết đều tăng trong các khối u như ung thư vú, ung thư biểu mô tế bào gan và ung thư biểu mô tiết niệu vùng thận [47]

Các nghiên cứu trên đã chỉ ra rằng mức độ biểu hiện của các HDAC có thể tăng hoặc giảm trong các khối u khác nhau so với mô bình thường Sự thay đổi trong hoạt

CÁC CHẤT ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE

1.2.1 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC trong sinh lý ung thư

Vai trò của các chất ức chế HDAC (HDACi) được thể hiện thông qua nhiều cơ chế khác nhau như ảnh hưởng đến chu kì tế bào, thúc đẩy quá trình apoptosis, ức chế hình thành mạch, tác động đến quá trình sửa chữa ADN, ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch và một số cơ chế khác [92]

Hình 1.5 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

1.2.1.1 Ảnh hưởng đến chu kì tế bào

Các HDACi có tác dụng gia tăng sự biểu hiện của gen CDKN1A (mã hóa protein kinase phụ thuộc cyclin (CDK) p21), từ đó ức chế sự hình thành các dimer từ cyclin và CDK, kết quả gây ngừng chu kì tế bào và ức chế sự biệt hóa tế bào [65] Bên cạnh đó, biểu hiện của p21 được điều hòa dương tính bởi p53 thông qua sự tương tác của protein này với phức hợp khởi đầu của p21 Do vậy, việc sử dụng các HDACi làm ức chế quá trình deacetylase các p53 sẽ giúp tăng biểu hiện các p21 [61] Ngoài ra, các HDACi có khả năng ức chế sự biểu hiện các gen mã hóa cyclin A và cyclin D, ức chế sự hoạt động của các kinase CDK2 và CDK4, gây bắt giữ chu kì tế bào [64], [70]

1.2.1.2 Ảnh hưởng đến quá trình apoptosis

Các HDACi thúc đẩy quá trình apoptosis thông qua cả hai con đường thụ thể gây chết (death receptor pathway) và con đường ty thể nội tại (intrinsic mitochondrial pathway), gây điều hòa các gen thúc đẩy hoặc ức chế apoptosis [53] Trong con đường

8 ngoại sinh, các HDACi kích thích apoptosis thông qua các cơ chế gồm điều hòa các thụ thể gây chết trên bề mặt tế bào (TRAILR, TNFR…) và/hoặc biểu hiện của các phối tử, giảm mức độ của các protein ức chế giống FLICE trong tế bào chất (c-FLIP) và tăng sự hình thành phức hợp tín hiệu gây chết (DISC) [88] Mặt khác, các HDACi chủ yếu giúp giảm biểu hiện của các protein ức chế apoptosis Bcl-2, Bcl-xL và tăng biểu hiện của các protein pro-apoptosis như Bax, Bak trong các con đường nội sinh [88]

1.2.1.3 Ảnh hưởng đến sự hình thành mạch

Nồng độ oxy thấp tại vị trí các khối u có thể gây ra quá trình tăng cường hình thành mạch để nuôi dưỡng các tế bào ung thư Bằng cách điều hòa tăng cường sự biểu hiện các gen mã hóa các protein ức chế khối u p53, pVHL, protein chống tạo mạch activin

A, neurofibromin 2, thrombospondin 1 đồng thời giảm sự phiên mã yếu tố cảm ứng thiếu oxy (HIF1-α), yếu tố tăng trưởng nội mạch (VEGF), thụ thể miền chèn kinase (KDR), yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGF), yếu tố tăng trường nguyên bào sợi cơ bản (bFGF) trong các tế bào ung thư, các HDACi có vai trò ức chế sự hình thành mạch máu tham gia nuôi dưỡng các khối u, cản trở quá trình di căn [38], [48]

1.2.1.4 Ảnh hưởng đến quá trình sửa chữa ADN

Các HDACi làm giảm sự biểu hiện của các protein giữ vai trò sửa chữa ADN như các protein kiểm soát tái tổ hợp tương đồng (HR), sửa lỗi ghép cặp ADN (MMR), sửa chữa cắt bỏ nucleotide (NER) và sửa chữa cắt bỏ base (BER), từ đó gây phá hủy ADN cũng như quá trình apoptopsis trong các tế bào ung thư [40] Bên cạnh đó, các HDACi ức chế quá trình deacetyl hóa làm cho nhiễm sắc thể duỗi xoắn, ADN dễ phơi nhiễm với các yếu tố gây hại như tia cực tím, bức xạ, thuốc độc tế bào và các gốc oxy hóa tự do, kết quả gây đứt gãy các sợi kép ADN (DSB) [51]

1.2.1.5 Ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch

Sự nhận biết và loại bỏ các tế bào khối u bởi các tế bào T đặc hiệu khối u phụ thuộc vào mức độ biểu hiện của các kháng nguyên liên quan đến khối u (TAA) và phức hợp hòa hợp mô chủ yếu loại I (MHCI) trên tế bào ung thư Các chất ức chế HDAC có thể làm tăng sự biểu hiện các TAA và MHCI từ đó giúp tăng sự tiêu diệt khối u thông qua cơ chế miễn dịch [43] Ngoài ra, các HDACi còn được chứng minh có khả năng tăng cường chức năng của các tế bào NK thông qua tăng biểu hiện của các phối tử hoạt hóa các tế bào này Tuy nhiên, việc làm tăng biểu hiện các MHCI sẽ ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng nhận biết và tiêu diệt các tế bào khối u của tế bào NK [4]

Dựa trên đặc điểm cấu trúc, các chất ức chế HDAC có thể được chia thành 5 nhóm: các acid hydroxamic, các acid béo chuỗi ngắn, các benzamid, peptid vòng và các ceton ái điện tử [14]

Hình 1.6 Phân loại các chất ức chế HDAC theo cấu trúc

Các HDACi được phát hiện cho đến nay chủ yếu là các chất ức chế không chọn lọc, tác động lên nhiều loại HDAC Trong đó, acid hydroxamic vorinostat (SAHA) là HDACi đầu tiên được FDA phê duyệt trong điều trị u lympho tế bào T ở da (CTCL) vào năm 2006 Những năm tiếp theo, có 3 chất ức chế HDAC được FDA phê duyệt bao gồm romidepsin (2009 - CTCL), belinostat (2014 - u lympho tế bào T ngoại vi (PTCL)) và panobinostat (2015 - đa u tủy (MM)) Chidamid là benzamid đầu tiên được Trung Quốc và Nhật Bản chấp thuận sử dụng trong điều trị PTCL tái phát và khó điều trị vào năm

2015 Bên cạnh đó, các thuốc này cũng cho thấy tiềm năng trong điều trị nhiều loại ung thư khác như ung thư cổ tử cung, ung thư não, ung thư vú [20], [63] Đầu năm 2024, một chất ức chế HDAC mới thuộc nhóm các acid hydroxamic là givinostat đã được FDA phê duyệt trong điều trị bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne [56]

1.2.3 Cấu trúc chung của các HDACi

Dựa vào những hiểu biết về cấu trúc trung tâm hoạt động của các HDAC, mô hình pharmacophore đầu tiên của các HDACi được xây dựng gồm ba phần: nhóm gắn kẽm

10 ZBG (zinc binding group), vùng cầu nối (linker) và vùng nhận diện bề mặt (cap group) ( Hình 1.7 ) [50]

Hình 1.7 Mô hình pharmacophore cổ điển và mở rộng của các HDACi

Các nhóm gắn kẽm thường được sử dụng trong các HDACi đã được phê duyệt hoặc đang trong quá trình thử nghiệm lâm sàng bao gồm acid hydroxamic, benzamid, acid carboxylic và thiol Bên cạnh đó, một số ZBG mới cũng được phát triển với mong muốn tạo ra một nhóm ZBG lý tưởng như imidazol thion, tropolon, 3-hydroxypyridin- 2-thion, carboxamid, benzoylhydrazid, trifluoromethyloxadiazolyl… Việc thay thế acid hydroxamic hay benzamid bởi các nhóm ZBG mới thường dẫn đến giảm hoạt tính so với các chất ban đầu Trong số các ZBG trên, acid hydroxamic là nhóm phổ biến nhất cho khả năng gắn ion kẽm tốt Tuy vậy, việc sử dụng các HDACi nhóm này có thể gây ra một số tác dụng không mong muốn do nguy cơ tương tác của nhóm acid hydroxamic với các enzym phụ thuộc kẽm khác Để hạn chế vấn đề này, cấu trúc của các nhóm nhận diện bề mặt và nhóm liên kết được thay đổi để tăng tính chọn lọc với các HDAC [89]

Chú thích: Carbon: xanh lá, nitro: xanh lam, oxy: đỏ

Hình 1.8 Tương tác của nhóm ZBG acid hydroxamic với trung tâm hoạt động của

11 Vùng cầu nối có vai trò liên kết vùng ZBG với vùng nhận diện bề mặt và tham gia tương tác với các acid amin trong lòng kênh enzym Cấu trúc của vùng này khá đa dạng, thường là các hydrocarbon thẳng hoặc vòng, có thể no hoặc không no [66] Một số hợp phần trong cấu trúc vùng linker của các chất đã được chứng minh có hoạt tính ức chế như nhóm heptanamid (SAHA, ricolinostat), cinnamamid (belinostat, panobinostat), benzamid (givinostat, tubastatin A) Tùy cấu trúc từng HDAC khác nhau, vùng cầu nối được thiết kế nhằm tăng tính chọn lọc với một số HDAC nhất định [55]

Vùng nhận diện bề mặt tương tác với các acid amin ở miệng túi xúc tác deacetylase có cấu trúc thường là các nhóm thân dầu, thường gặp nhất là các hệ vòng thơm [66] Một số hợp phần có hoạt tính sinh học có thể được đưa vào cấu trúc của các HDACi với vai trò là nhóm nhận diện bề mặt như indol [37], imidazol, benzimidazol [60], indirubin [3], quinazolin [36]…

KHUNG QUINAZOLIN VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ

1.3.1 Khung quinazolin và các dẫn chất

Quinazolin (1,3-diazanaphthalen/ benzodiazin) là một dị vòng chứa N với cấu trúc bao gồm một vòng benzen và một vòng pyrimidin Quinazolin có 3 đồng phân cấu tạo khác gồm cinnolin (1,2-benzodiazin), phthalazin (2,3-benzodiazin) và quinoxalin (1,4-

12 benzodiazin), các cấu trúc này đều có hoạt tính sinh học đa dạng và những ứng dụng quan trọng trong y học, dược phẩm và nông nghiệp [52]

Hình 1.10 Cấu trúc hóa học của quinazolin, các đồng phân của quinazolin và các quinazolinon

Quinazolinon (ketoquinazolin) là dẫn chất chứa thêm nhóm carbonyl của quinazolin Hợp phần quinazolinon có trong cấu trúc của hơn 200 các alkaloid tự nhiên có hoạt tính đa dạng được phân lập từ thực vật, động vật và vi sinh vật [57] Dựa vào vị trí nhóm oxo, có thể phân loại các quinazolinon thành 3 nhóm: quinazolin-2(1H)-on, quinazolin-4(3H)-on, quinazolin-2,4(1H,3H)-dion Trong đó, quinazolin-4(3H)-on là khung cấu trúc tiềm năng được sử dụng phổ biến trong thiết kế các hợp chất mới có hoạt tính sinh học [33]

Các hoạt tính sinh học đã được chứng minh của các dẫn chất mang khung quinazolin-4(3H)-on bao gồm tác dụng chống ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng lao, chống viêm, chống co giật, kháng HIV và giảm đau [29]

1.3.2 Một số phương pháp tổng hợp khung quinazolin-4(3H)-on

Một số phương pháp tổng hợp khung và dẫn chất gồm:

(1) Từ anthranilic acid [34]: Trong phản ứng Niementowski, acid anthranilic được phản ứng với formamid ở nhiệt độ cao 130-150°C để thu sản phẩm Đây được coi là phương pháp phổ biến nhất được sử dụng để tổng hợp các quinazolin

Sơ đồ 1.1 Phản ứng tổng hợp quinazolin-4(3H)-on từ anthranilic acid

(2) Từ isotoic anhydrid [12]: anhydrid được phản ứng với các aldehyd và amoni acetat thu được các dẫn chất quinazolin-4(3H)-on khác nhau Phản ứng sử dụng xúc tác gallium triflat trong dung môi DMSO

Sơ đồ 1.2 Phản ứng tổng hợp quinazolin-4(3H)-on từ isotoic anhydrid

(3) Từ o-nitrobenzamid [67]: các dẫn chất thế tại vị trí 2 và 6 của quinazolin-4(3H)- on được tổng hợp bằng phản ứng của các dẫn chất o-nitrobenzamid với các aldehyd khác nhau Xúc tác được sử dụng là natri dithionit trong hỗn hợp DMF và nước với tỉ lệ 9:1 ở 90°C

Sơ đồ 1.3 Phản ứng tổng hợp các dẫn chất quinazolin-4(3H)-on từ o-nitrobenzamid

(4) Từ anthranilamid [59]: các dẫn chất thế khác nhau của benzaldehyd được phản ứng với anthranilamid trong điều kiện xúc tác InCl3 ở nhiệt độ phòng để thu được các sản phẩm 2-arylquinazolin-4-on với hiệu suất cao

Sơ đồ 1.4 Phản ứng tổng hợp các dẫn chất 2-aryl-quinazolin-4(3H)-on từ anthranilamid

(5) Từ 2-halobenzamid [86]: các dẫn chất thế 2-aryl-quinazolin-4(3H)-on được tổng hợp thông qua phản ứng kiểu Ullmann với xúc tác CuBr từ nguyên liệu ban đầu là 2-halobenzamid và các dẫn chất của benzylamin

Sơ đồ 1.5 Phản ứng tổng hợp dẫn chất 2-aryl-quinazolin-4(3H)-on từ 2-halobenzamid

1.3.3 Hoạt tính kháng ung thư của khung quinazolin-4(3H)-on

Nhiều dẫn chất mang khung quinazolin-4(3H)-on đã được thiết kế, tổng hợp và thử hoạt tính trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau Trong đó, idelalisib là thuốc đã được FDA phê duyệt sử dụng trong điều trị bệnh bạch cầu mãn tính dòng tế bào lympho (chronic lymphocytic leukemia) tái phát trong liệu pháp phối hợp với rituximab vào năm

2014 Sau đó, idelalisib tiếp tục được chấp thuận như một liệu pháp đơn trị liệu trong bệnh u lympho tế bào B không Hodgkin dạng nang (follicular B-cell non-Hodgkin lymphoma) tái phát và ung thư tế bào lympho nhỏ (small-lymphocytic lymphoma) tái phát Idelalisib có khả năng ức chế enzym phosphoinositid 3-kinase (PI3K), đặc biệt chọn lọc trên type I của PI3K [5]

Một hợp chất mang khung quinazolin-4(3H)-on khác là raltitrexed được phê duyệt điều trị cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng di căn đặc biệt ở những bệnh nhân không dung nạp 5-fluorouracil Raltitrexed có khả năng ức chế chọn lọc enzym thymidylat synthase từ đó ức chế quá trình tổng hợp ADN Đồng thời, raltitrexed còn được chứng minh có tác dụng trên nhiều loại khối u như ung thư biểu mô ác tính, ung thư dạ dày, ung thư gan [91]

Hình 1.11 Cấu trúc một số dẫn chất mang khung quinazolin-4-(3H)-on có hoạt tính kháng ung thư

PHẢN ỨNG CLICK CỘNG ĐÓNG VÒNG ALKYN – AZID XÚC TÁC ĐỒNG (I) (CUAAC) VÀ ỨNG DỤNG

1.4.1 Giới thiệu về phản ứng CuAAC

Khái niệm “hóa học Click” lần đầu tiên được đưa ra bởi nhóm các nhà khoa học Kolb, Finn và Sharpless vào năm 2001 để chỉ các phản ứng nhằm tạo ra các sản phẩm bằng cách kết nối các phân tử nhỏ với nhau thông qua các liên kết dị hợp tử (C-X-C) Đặc điểm của các phản ứng này là điều kiện đơn giản, không sử dụng dung môi hoặc dung môi sử dụng lành tính hoặc dễ loại bỏ, hiệu suất cao, chỉ tạo ra các sản phẩm phụ không độc hại, có thể loại bằng các phương pháp đơn giản không sắc ký [41]

Sơ đồ 1.6 Phản ứng cộng đóng vòng alkyn – azid

15 Trong “hóa học Click”, phản ứng cộng đóng vòng giữa azid và alkyn được biết đến phổ biến nhất Phản ứng diễn ra trong điều kiện không xúc tác ở nhiệt độ cao tạo ra hỗn hợp sản phẩm gồm 2 đồng phần chứa nhóm 1,2,3-triazol có nhóm thế ở vị trí 1,4 và 1,5 với tỉ lệ gần ngang nhau [46]

Năm 2002, hai nhóm nghiên cứu của Sharpless và Meldal đã công bố độc lập về hiệu quả của việc sử dụng xúc tác đồng trong phản ứng này [68], [78] Đặc điểm chung của hai nghiên cứu là đều sử dụng Cu(I) làm xúc tác, phản ứng chỉ tạo ra đồng phân chứa các nhóm thế ở vị trí 1,4 với hiệu suất cao Nhờ đặc tính chọn lọc khi sử dụng Cu(I), phản ứng CuAAC được ứng dụng rộng rãi trong tổng hợp hữu cơ nói chung cũng như trong hóa dược nói riêng

Các xúc tác đồng (I) được nghiên cứu sử dụng trong phản ứng CuAAC bao gồm [8], [35], [54]:

- Muối đồng hóa trị I: thường sử dụng các muối đồng(I) halogenid (CuCl, CuBr, CuI), đồng(I) acetat hoặc các dạng phức như [Cu(CH3CN)4]PF6, [Cu(CH3CN)4]OTf… Việc sử dụng xúc tác Cu(I) thường yêu cầu sự có mặt của một base amin hoặc nhiệt độ cao để hình thành phức hợp Cu-acetylid

- Muối đồng hóa trị II: Cu(I) được tạo thành in situ từ Cu(II) trong quá trình phản ứng Muối Cu(II) được sử dụng là CuSO4 với sự có mặt của chất khử natri ascorbat hoặc TCEP Cu(OAc)2 có thể được sử dụng độc lập không cần chất khử do tính oxy hóa mạnh, có thể được khử thành Cu(I) nhờ các alkyn

- Kim loại đồng: có thể sử dụng các dạng khác nhau như dạng bột hoặc dạng nano với sự có mặt của CuSO4 hoặc không để tạo Cu(I)

Sơ đồ 1.7 Cơ chế phản ứng CuAAC do Sharpless và cộng sự đề xuất năm 2002

Cơ chế của phản ứng CuAAC lần đầu tiên được đề xuất bởi nhóm của Folkin, Sharpless và cộng sự vào năm 2002 ( Sơ đồ 1.7 ) Chu trình phản ứng chỉ có sự tham gia của một nguyên tử đồng và trải qua sự hình thành một phức trung gian 6 cạnh [68] Gần đây, Folkin và cộng sự đã chứng minh và đề xuất một cơ chế mới trong đó có sự tham gia của nguyên tử đồng thứ hai trong chu trình phản ứng ( Sơ đồ 1.8 ) Trong đó,

2 nguyên tử đồng được chứng minh tương đương về mặt hóa học Ban đầu lần lượt là sự hình thành phức hợp giữa phân tử alkyn với nguyên tử Cu(I) thứ nhất thông qua liên kết π và với nguyên tử Cu(I) thứ hai thông qua liên kết σ Sau đó, phức hợp này phản ứng với phân tử azid để tạo nên phức hợp trung gian chứa 2 nguyên tử đồng Cuối cùng là quá trình loại lần lượt hai nguyên tử đồng để tạo sản phẩm 1,2,3-triazol chọn lọc tại vị trí thế 1,4 [85]

Sơ đồ 1.8.Cơ chế phản ứng CuAAC do Folkin và cộng sự đề xuất năm 2013

1.4.3 Ứng dụng phản ứng Click trong tổng hợp các hợp chất mang cấu trúc 1,2,3- triazol có hoạt tính sinh học

1,2,3-triazol là một dị vòng năm cạnh chứa 3 nguyên tử N, có thể được tạo thành dễ dàng và chọn lọc thông qua phản ứng cộng đóng vòng alkyn – azid sử dụng xúc tác Cu(I) Đây là một hợp phần vô cùng quan trọng và tiềm năng trong nghiên cứu hóa dược dựa trên những tính chất đặc biệt của cấu trúc này Nhìn chung, 1,2,3-triazol ổn định về mặt hóa học, không bị ảnh hưởng bởi các quá trình oxy hóa, khử cũng như các điều kiện thủy phân trong môi trường acid và base Chúng còn có độ phân cực lớn (khoảng 5 D), có khả năng tạo liên kết hydro, liên kết lưỡng cực – lưỡng cực và tương tác π xếp chồng (π stacking interaction) từ đó có thể tạo tương tác với các đích sinh học và giúp tăng độ tan [32] Đồng thời, 1,2,3-triazol còn đóng vai trò là một nhóm cấu đẳng sinh học (bioisostere), có khả năng thay thế các nhóm cấu trúc khác như amid, ester, các dị vòng… trong nghiên cứu phát triển thuốc mới [10]

Dị vòng 1,2,3-triazol được tìm thấy trong những chất có hoạt tính sinh học đa dạng như kháng khuẩn, kháng viêm, chống lao, chống HIV, chống virus và đặc biệt là kháng ung thư Tác dụng kháng ung thư của 1,2,3-triazol được chứng minh thông qua một số cơ chế ức chế các enzym như carbonic anhydrase (CA), aromatase, tryptophan-2,3- dioxygenase (TDO), thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mạch (VEGFR), thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) [2] Điều này cho thấy tiềm năng của cấu trúc này trong thiết kế, tổng hợp các chất có hoạt tính kháng ung thư mới

Năm 2008, Chen và cộng sự đã thiết kế một dãy các acid hydroxamic chứa khung 1,2,3-triazol dựa trên cấu trúc của SAHA thông qua phản ứng CuAAC Kết quả cho thấy nhóm 1,2,3-triazol phù hợp làm nhóm liên kết (CU) đồng thời thu được một số hợp chất có hoạt tính ức chế HDAC mạnh hơn SAHA nhiều lần [13]

Hình 1.12 Cấu trúc các dẫn chất HDACi trong nghiên cứu của Chen và cộng sự

Một nghiên cứu khác của Suzuki và cộng sự đã thiết kế, tổng hợp và thử hoạt tính ức chế HDAC của một loạt các dẫn chất N-hydroxybenzamid chứa cấu trúc 1,2,3-triazol với mục đích tìm kiếm các chất ức chế chọn lọc HDAC8 Sau khi sàng lọc, hợp chất

C149 có nhóm Cap là phenylthiomethyl cho hoạt tính ức chế chọn lọc HDAC8 mạnh hơn một chất ức chế chọn lọc HDAC8 khác là PCI-34058 với giá trị IC50 lần lượt là 0,07 và 0,31 àM [76]

Hình 1.13 Cấu trúc các chất ức chế chọn lọc HDAC8 trong nghiên cứu của Suzuki và cộng sự

ĐỊNH HƯỚNG THIẾT KẾ CẤU TRÚC

Quá trình nghiên cứu phát triển các chất ức chế HDAC mới thường được tiếp cận theo 4 hướng: thay đổi nhóm gắn kẽm, thay đổi nhóm liên kết, thay đổi vùng cầu nối và thay đổi nhóm nhận diện bề mặt

Nhóm gắn kẽm: Nhiều nhóm ZBG đã được sử dụng trong cấu trúc các HDACi như acid hydroxamic, benzamid, acid carboxylic và thiol Trong đó, acid hydroxamic là nhóm gắn kẽm tiềm năng nhất với hoạt tính ức chế cao đồng thời 4 trên 5 thuốc được

18 FDA phê duyệt sử dụng trong lâm sàng mang cấu trúc này Vì vậy, đề tài quyết định sử dụng acid hydroxamic làm nhóm gắn kẽm khi định hướng thiết kế cấu trúc các dẫn chất HDACi mới

Vùng nhận diện bề mặt: cấu trúc vùng nhận diện bề mặt thường là các nhóm thân dầu, hay gặp nhất là các hệ vòng thơm để tạo tương tác với các acid amin ở miệng túi xúc tác Gần đây, một hướng đi mới trong thiết kế các chất ức chế HDAC là đưa các khung cấu trúc có hoạt tính kháng ung thư vào nhóm nhận diện bề mặt Khóa luận đã sử dụng khung 4-oxoquinazolin với một số nhóm thế khác nhau để khảo sát mối liên quan cấu trúc – tác dụng sinh học

Nhóm liên kết: Vòng 1,2,3-triazol được tìm thấy trong nhiều chất có hoạt tính sinh học tiềm năng đặc biệt là tác dụng kháng ung thư Đồng thời, dị vòng này còn đóng vai trò một nhóm cấu đẳng sinh học, có khả năng thay thế nhiều nhóm cấu trúc khác trong nghiên cứu phát triển thuốc mới Do vậy, khóa luận đã sử dụng 1,2,3-triazol để thay thế nhóm amid trong nhóm liên kết của SAHA

Vùng cầu nối: Một số hợp chất mang khung benzamid làm cầu nối đang được nghiên cứu lâm sàng trong điều trị ung thư như givinostat [15], tubastatin A [11], nexturastat [75] Điều này chứng tỏ tiềm năng của hợp phần này trong phát triển các HDACi mới

Từ các lý do trên, đề tài đã thiết kế 6 các dẫn chất N-hydroxybenzamid mới mang khung 4-oxoquinazolin và hợp phần 1,2,3-triazol với sự thay đổi các nhóm thế trên vòng quinazolin với mong muốn có thể tìm ra các chất có hoạt tính ức chế HDAC và tác dụng kháng ung thư tiềm năng

Hình 1 14 Định hướng thiết kế cấu trúc các dẫn chất N-hydroxybenzamid mới

NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

Các hóa chất, dung môi sử dụng cho tổng hợp hóa dược đạt tiêu chuẩn AR (tinh khiết phân tích Analytical Reagent – AR), được mua từ công ty Sigma - Aldrich hoặc Fluka hoặc Merck Các dung môi, hóa chất này đều được sử dụng trực tiếp, không trải qua thêm bất kỳ quá trình tinh chế nào Bao gồm:

- Propargyl bromid (80% (khối lượng/khối lượng) trong toluen)

Các dung môi hóa chất khác như: nước cất, aceton, dicloromethan (DCM), methanol (MeOH), acetonitril (MeCN), ethyl acetat (EA), N,N-dimethylformamid

(DMF), K2CO3, KI, Na2SO4, CuI, NaOH, HCl, FeCl3…

- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 và 100 ml có nút mài, bình nón, bình chiết, phễu thủy tinh, pipet, ống đong, cốc có mỏ, khuấy từ các loại

- Bình chạy sắc ký Camag, bản mỏng silicagel F254 (Merck), đèn tử ngoại Camag bước sóng 254 nm và 366 nm

- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimazu

- Tủ lạnh Memmert, tủ sấy Memmert

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC, máy cất quay chân không Buchi R-210

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital

- Máy đo phổ hồng ngoại: Shimadzu FTIR Affinity-1S tại khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy đo phổ khối: Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS (United States) – Viện Hóa Sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AC-500 MHz tại khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Tủ nuôi cấy Vision scientific Co.Ltd (model VS-9108 MS), tủ làm thực nghiệm (Vision bio-safety clean beach)

- Kính hiển vi Nikon – FX-35DX để đếm tế bào, kính hiển vi: Zeiss, Celldiscoverer7 với ống kính 40X để quan sát hình thái tế bào, máy ly tâm Union 5KR, máy lắc Vortex genie 2

- Tủ lạnh giữ môi trường nuôi cấy, bồn làm ấm môi trường nuôi cấy đến 37°C Jeio tech SWB-03, tủ giữ mẫu -18°C (DIOS)

- Pipep Gilson cỏc loại 1000; 200; 20; 2-20; 1-10 àl

- Máy đo độ hấp thụ huỳnh quang VICTOR (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

N-Hydroxy-4-((4-((4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1- yl)methyl)benzamid (7a)

N-Hydroxy-4-((4-((6-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)methyl)benzamid (7b)

N-Hydroxy-4-((4-((7-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)methyl)benzamid (7c)

4-((4-((6-Cloro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1- yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (7d)

4-((4-((6-Bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1- yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (7e)

4-((4-((7-Bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1- yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (7f)

- Kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất tổng hợp được bằng nhiệt độ nóng chảy và sắc ký lớp mỏng

- Khẳng định cấu trúc các dẫn chất dựa trên phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân giải cao (HRMS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C- NMR)

2.2.2 Đánh giá hoạt tính sinh học

- Đánh giá tác dụng ức chế histon deacetylase tổng chiết từ tế bào Hela của các dẫn chất tổng hợp được

- Thử tác dụng gây độc in vitro của các dẫn chất tổng hợp được trên một dòng tế bào thường: dòng tế bào nguyên bào sợi phổi ở thai nhi (MRC-5) và hai dòng tế bào ung thư người: ung thư đại tràng (SW620), ung thư vú (MDA-MB-231)

- Thử tác dụng lên chu kỳ tế bào và tác dụng lên quá trình apoptosis đối với dòng tế bào ung thư đại tràng ở người SW620 của dẫn chất đại diện 7d.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Dựa trên những nguyên tắc, phương pháp cơ bản của tổng hợp hữu cơ để tổng hợp

6 dẫn chất N-hydroxybenzamid mới Các phản ứng sử dụng bao gồm:

- Phản ứng thế brom bằng azid [22]

- Phản ứng ngưng tụ vòng quinazolin [34]

- Phản ứng cộng đóng vòng alkyn – azid xúc tác đồng hóa trị I [78]

- Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic sử dụng hydroxylamin hydroclorid với tác nhân kiềm [16]

2.3.1.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng 2 phương pháp:

- Nhiệt độ nóng chảy: xác định nhiệt độ nóng chảy của 6 dẫn chất tổng được bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy

- Sắc ký lớp mỏng: theo dõi quá trình phản ứng, thời điểm kết thúc phản ứng, kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau tinh chế

+ Pha tĩnh: bản mỏng silicagel 60 F254, hoạt hóa ở 110℃ trong 30 phút

+ Pha động: hệ dung môi phụ thuộc vào bản chất chất phân tích

+ Chất phân tích được hòa tan trong dung môi thích hợp và được đưa lên bản mỏng Tiến hành đưa bản mỏng vào bình chứa pha động đã bão hòa dung môi để chạy sắc ký và quan sát kết quả dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

2.3.1.3 Phương pháp xác định cấu trúc

Các chất sau khi được tổng hợp và kiểm tra độ tinh khiết được xác định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân giải cao (HRMS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon ( 13 C-NMR)

- Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy Shimadzu FTIR Affinity-1S tại khoa Hóa học – trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, với kỹ thuật viên nén KBr, quét phổ ở vùng 4000-400 cm -1 Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỉ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không loại bỏ hơi ẩm Phổ được ghi ở độ phân giải 4 cm -1

- Phổ khối lượng phân giải cao (HRMS): ghi bằng máy khối phổ Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS (United States) – Viện Hóa Sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng phương pháp ion hóa phun mù điện tử ESI,

22 dung môi là MeOH Tùy theo phương thức bẫy ion ESI (+) hoặc ESI (-) mà ion trên phổ ghi nhận được là dương hay âm

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR và 13 C-NMR): ghi bằng máy Bruker AV-

500 tại khoa Hóa học - trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Phổ 1 H-NMR được đo ở tần số 500 MHz, phổ 13 C-NMR được đo ở tần số 125 MHz Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), vạch 0 ppm tương ứng với pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), dung môi pha mẫu là DMSO- d6, nhiệt độ ghi phổ khoảng 300 K

2.3.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

2.3.1 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế histon deacetylase

Thử tác dụng ức chế HDAC trên hỗn hợp HDAC tổng tách từ tế bào Hela bằng phương pháp đo huỳnh quang sử dụng bộ Fluorogenic HDAC Assay Kit (Enzo Life Sciences Inc.) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Bộ kit bao gồm cơ chất là các peptid có chuỗi bên lysin đã được acetyl hóa Khi ủ cơ chất với hỗn hợp HDAC tổng, quá trình deacetyl sẽ diễn ra, sau đó thêm một dung dịch đặc biệt của nhà sản xuất (HDAC Assay Developer), dung dịch thử sẽ phát huỳnh quang Dựa vào mức độ huỳnh quang phát ra, tác dụng ức chế HDAC sẽ được xác định [82]

Hình 2.1 Nguyên tắc đánh giá hoạt tính ức chế enzym HDAC

Thành phần bộ kit bao gồm: HDAC tổng chiết từ tế bào Hela, cơ chất phát quang HDAC, chất khai triển định lượng (HDAC Assay Developer), trischostatin A, dung dịch đệm (HDAC Assay Buffer)

- Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử

Trước khi tiến hành đánh giá tác dụng ức chế HDAC, các mẫu thử nghiệm dạng bột được hòa tan trong dimethyl sulfoxid (DMSO) để tạo dung dịch gốc nồng độ 10

23 mg/ml Các dung dịch gốc sau đó được pha loãng bằng môi trường DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) không có huyết thanh để tạo các dung dịch ở nồng độ 0,01; 0,03; 0,1; 0,3 àg/ml Nồng độ DMSO cuối cựng khụng vượt quỏ 0,1% và mẫu đối chứng DMSO được thêm vào một nhóm lỗ thử để có nồng độ DMSO đúng bằng nồng độ DMSO ở các lỗ có mẫu thử

Thêm lần lượt các chất sau vào trong các giếng thử:

+ Dung dịch gốc của nhà sản xuất: 5 àl cơ chất phỏt huỳnh quang HDAC Fluorogenic (200 àM) + 5 àl BSA (1 mg/ml) + 30 àl dung dịch đệm HDAC Assay Buffer

+ 5 ml dung dịch của các chất cần đánh giá (Test Inhibitor) đã được chuẩn bị sẵn như trên Đối với giếng chứa chất chứng dương (Positive Control) và mẫu trắng (Blank), thêm 5 ml dung dịch tương tự mà không chứa chất ức chế gọi là dung dịch đệm ức chế (Inhibitor Buffer) Thờm 5 àl dung dịch pha loóng Trichostatin A (20 àM) vào giếng chứng ức chế (Inhibitor Control)

+ 5 ml HDAC Assay Buffer vào các giếng trắng (Blank)

+ Bắt đầu phản ứng bằng cỏch thờm 5 àl enzym HDAC pha loóng (1 ng/àl) vào các giếng chứng dương (Positive Control), giếng các chất cần đánh giá (Test Inhibitor) và giếng chất chứng ức chế (Inhibitor Control) Ủ ở 37ºC trong 30 phút

Thờm 50 àl HDAC Assay Developer (2x) vào mỗi giếng Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

- Bước 3: Đọc kết quả Đọc kết quả của mẫu trong máy đo hấp thụ huỳnh quang VICTOR (PerkinElmer, Waltham, MA, USA), có khả năng kích thích ở bước sóng trong khoảng 360 nm và phát hiện bước sóng phát ra trong khoảng 460 nm (độ hấp thụ được đo 2 lần ở mỗi bước sóng) Giá trị của giếng trắng (Blank) được trừ khỏi tất cả các giá trị khác Kết quả độ hấp thụ (của 2 lần thí nghiệm) được đưa vào phần mềm excel tính toán để thu được phần trăm trung bình mẫu thử gắn với HDAC Giá trị IC50 được tính bằng GraphPad Prism 5.0 (Phần mềm GraphPad, San Diego, CA, Hoa Kỳ) bằng phương pháp xây dựng đường cong biểu thị quan hệ giữa phần trăm tế bào sống và logarit của nồng độ chất thử Độ lệch chuẩn tương đối không quá 10%

2.3.2 Phương pháp thử tác dụng gây độc tế bào in vitro

Thử tác dụng gây độc tế bào in vitro được thực hiện tại Khoa Dược, trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp Sulforhodamin B (SRB) [81] và giá trị IC50 được tính theo phương pháp Probits

24 Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào sống dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamin B (SRB) Giá trị OD máy đo được tỷ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào sống càng nhiều thì giá trị OD càng lớn

Hình 2.2 Nguyên tắc SRB đánh giá tác dụng gây độc tế bào

Dòng tế bào thử nghiệm: Thử hoạt tính ức chế tế bào trên một dòng tế bào thường và hai dòng tế bào ung thư gồm:

- MRC-5: dòng tế bào nguyên bào sợi phổi ở thai nhi

- SW620: tế bào ung thư đại tràng ở người

- MDA-MB-231: tế bào ung thư vú người

Các dòng tế bào này được mua từ Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) có bổ sung một số thành phần cần thiết

Chất đối chiếu dương tính: SAHA (Vorinostat), ADR (Adriamycin)

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN

HÓA HỌC

Các dẫn chất N-hydroxybenzamid mục tiêu (7a-f) được tổng hợp qua quy trình 5 bước được mô tả thông qua sơ đồ dưới đây:

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung của các dẫn chất 7a-f 3.1.1.1 Tổng hợp nguyên liệu methyl 4-(azidomethyl)benzoat (2)

Sơ đồ 3.2 Phản ứng tổng hợp nguyên liệu methyl 4-(azidomethyl)benzoat

Hòa tan 1603 mg (7,0 mmol) methyl 4-(bromomethyl)benzoat (1) 30 ml MeOH trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 ml Thêm 2,3 g (35 mmol) NaN3 vào bình và đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng trong 8 giờ

Sau khi phản ứng kết thúc, loại dung môi bằng cất quay dưới áp suất giảm Sau đó, phân tán cắn thu được vào nước và chiết thu sản phẩm từ hỗn dịch trong nước bằng dicloromethan (DCM), chiết 3 lần mỗi lần 30 ml Dịch chiết được làm khan bằng

Na2SO4, sau đó cất quay loại hết dung môi thu được sản phẩm (2)

Cảm quan: chất lỏng màu vàng nhạt

Rf = 0,55 (hệ dung môi pha động DCM)

28 Nguyên liệu 4-(azidomethyl)benzoat sẽ được sử dụng cho phản ứng tổng hợp dãy các dẫn chất 7a-f tiếp theo

3.1.1.2 Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-4-((4-((4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H- 1,2,3-triazol-1-yl)methyl)benzamid (7a) a Tổng hợp chất quinazolin-4(3H)-on (4a)

Sơ đồ 3.3 Phản ứng tổng hợp chất 4a

Cân 205,5 mg acid 2-aminobenzoic (3a) (1,5 mmol) và 337,5 mg formamid (7,5 mmol) vào bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml Đun hỗn hợp phản ứng tại 120°C trong khoảng 6 giờ Phản ứng được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

Kết thúc phản ứng, phân tán hỗn hợp sản phẩm vào 40 ml dung dịch natri hydrocarbonatthấy xuất hiện tủa sản phẩm màu nâu nhạt tạo thành Tiến hành lọc, rửa tủa với nước cất lạnh 3 lần mỗi lần 10 ml và sau đó sấy sản phẩm ở 60°C trong khoảng

Cảm quan: chất rắn màu nâu nhạt

Rf = 0,40 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 15:1) b Tổng hợp chất 3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5a)

Phân tán 206,9 mg chất 4a vào 15 ml aceton trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml Thêm 391,1 mg K2CO3 (2,8 mmol, 2 đương lượng), đun hồi lưu hỗn hợp trong khoảng 1 giờ Sau đó, thêm 28,20 mg KI (0,17 mmol, 0,12 đương lượng) và 210,8 mg propargyl bromid 80% (khối lượng/khối lượng) trong toluen (1,77 mmol, 1 đương lượng) vào bình cầu, tiếp tục khuấy hỗn hợp phản ứng ở 60°C trong 3 giờ Theo dõi phản ứng bằng TLC đến khi không còn xuất hiện vết của chất 4a trên sắc ký đồ

29 Sau khi hết nguyên liệu đầu, cô quay loại aceton ở áp suất giảm thu được hỗn hợp chất rắn Tiến hành phân tán chất rắn vào nước và chiết với DCM (3 lần x 30 ml), thu pha DCM và làm khan bằng Na2SO4 Cất quay chân không loại DCM thu được sản phẩm màu vàng nhạt (chất 5a)

Cảm quan: chất rắn màu vàng nhạt

Rf = 0,72 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất methyl 4-((4-((4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1- yl)methyl)benzoat (6a)

Hòa tan 184,0 mg chất 5a (1,0 mmol) và 191,0 mg 4-(azidomethyl)benzoat (2) (1 mmol) vào 10 ml MeCN trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml Sau đó thêm 191,0 mg CuI (1,0 mmol) và khuấy hỗn hợp phản ứng ở 50°C trong 3-4 giờ

Xử lý phản ứng Để nguội bình phản ứng đến nhiệt độ phòng, cất quay loại dung môi MeCN dưới áp suất giảm thu được hỗn hợp cắn rắn Phân tán hỗn hợp rắn vào 30 ml dung dịch EA và kiềm hóa hỗn hợp bằng dung dịch Na2CO3 để kết tủa muối đồng dưới dạng hydroxyd Tiến hành lọc hỗn hợp thu được qua phễu lọc Buchner với chất trợ lọc Celite để loại bỏ kết tủa không tan Sau đó, gạn dịch lọc ở trên thu pha dung môi hữu cơ và pha nước được tiếp tục chiết với ethyl acetat (2 lần x 30 ml) Gộp các pha EA, làm khan bằng

Na2SO4 sau đó cô quay loại dung môi thu được sản phẩm là chất rắn màu vàng

Cảm quan: chất rắn màu vàng

Rf = 0,50 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 15:1) d Tổng hợp chất N-hydroxy-4-((4-((4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)methyl)benzamid (7a)

Sơ đồ 3.6 Phản ứng tổng hợp dẫn chất 7a

Phân tán đều 327,8 mg chất 6a vào trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml chứa hỗn hợp 10 ml MeOH và 3 ml DMF, thêm 607,5 mg hydroxylamin hydroclorid (10 đương lượng) Làm lạnh bình phản ứng đến 0°C, sau đó vừa khuấy hỗn hợp vừa nhỏ từ từ dung dịch NaOH bão hòa trong nước vào bình đến pH = 11 – 12 Tiếp tục khuấy hỗn hợp phản ứng ở 0°C trong khoảng 2 giờ đến khi phản ứng kết thúc

Thêm vào bình phản ứng 20 ml nước cất sau đó trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch HCl 5% đến pH = 7 để kết tủa sản phẩm Lọc, rửa tủa bằng nước cất lạnh đến khi dịch lọc trung tính Kết tinh lại sản phẩm bằng hỗn hợp dung môi methanol – nước Sau đó sấy khô tủa ở 60°C Sản phẩm thu được là chất rắn, màu trắng

Cảm quan: chất rắn màu trắng

Rf = 0,38 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 9:1)

3.1.1.3 Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-4-((4-((6-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)- yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)benzamid (7b)

Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hợp dẫn chất 7b a Tổng hợp chất 6-methylquinazolin-4(3H)-on (4b)

Tiến hành và xử lý phản ứng

Quy trình tương tự như tổng hợp 4a, sử dụng 226,5 mg chất 3b thu được 215,1 mg sản phẩm 4b

31 Cảm quan: chất rắn màu nâu nhạt

Rf = 0,42 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 15:1) b Tổng hợp chất 6-methyl-3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5b)

Rf = 0,75 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất methyl 4-((4-((6-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)methyl)benzoat (6b)

Rf = 0,52 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 15:1) d Tổng hợp chất N-hydroxy-4-((4-((6-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H- 1,2,3-triazol-1-yl)methyl)benzamid (7b)

3.1.1.4 Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-4-((4-((7-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)- yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)benzamid (7c)

Sơ đồ 3.8 Quy trình tổng hợp dẫn chất 7c a Tổng hợp chất 7-methylquinazolin-4(3H)-on (4c)

Quy trình tương tự như tổng hợp 4a, sử dụng 226,5 mg chất 3c thu được 219,1 mg sản phẩm 4c

Rf = 0,42 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 15:1) b Tổng hợp chất 7-methyl-3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5c)

Rf = 0,75 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất methyl 4-((4-((7-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)methyl)benzoat (6c)

Rf = 0,52 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 15:1) d Tổng hợp chất N-hydroxy-4-((4-((7-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)benzamid (7c)

3.1.1.5 Tổng hợp dẫn chất 4-((4-((6-cloro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H- 1,2,3-triazol-1-yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (7d)

Sơ đồ 3.9 Quy trình tổng hợp dẫn chất 7d a Tổng hợp chất 6-cloroquinazolin-4(3H)-on (4d)

Quy trình tương tự như tổng hợp 4a, sử dụng 257,3 mg chất 3d thu được 238,8 mg sản phẩm 4d

Rf = 0,43 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 15:1) b Tổng hợp chất 6-cloro-3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5d)

Rf = 0,76 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất methyl 4-((4-((6-cloro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)methyl)benzoat (6d)

Rf = 0,54 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 15:1) d Tổng hợp chất 4-((4-((6-cloro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1- yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (7d)

3.1.1.5 Tổng hợp dẫn chất 4-((4-((6-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H- 1,2,3-triazol-1-yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (7e)

Sơ đồ 3.10 Quy trình tổng hợp dẫn chất 7e a Tổng hợp chất 6-bromoquinazolin-4(3H)-on (4e)

Quy trình tương tự như tổng hợp 4a, sử dụng 324,0 mg chất 3e thu được 305,4 mg sản phẩm 4e

Rf = 0,44 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 15:1) b Tổng hợp chất 6-bromo-3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5e)

Rf = 0,77 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất methyl 4-((4-((6-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)methyl)benzoat (6e)

Rf = 0,55 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 15:1) d Tổng hợp chất 4-((4-((6-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol- 1-yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (7e)

3.1.1.5 Tổng hợp dẫn chất 4-((4-((7-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H- 1,2,3-triazol-1-yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (7f)

Sơ đồ 3.11 Quy trình tổng hợp dẫn chất 7f

36 a Tổng hợp chất 7-bromoquinazolin-4(3H)-on (4e)

Quy trình tương tự như tổng hợp 4a, sử dụng 324,0 mg chất 3f thu được 312,9 mg sản phẩm 4f

Rf = 0,44 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 15:1) b Tổng hợp chất 7-bromo-3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5e)

Rf = 0,78 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất methyl 4-((4-((7-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)methyl)benzoat (6e)

Quy trình tương tự như tổng hợp chất 6a, sử dụng 263,0 mg chất 5f thu được 384,5 mg sản phẩm 6f

Rf = 0,55 (hệ dung môi pha động DCM:MeOH = 15:1) d Tổng hợp chất 4-((4-((7-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol- 1-yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (7e)

Hiệu suất toàn phần của quá trình tổng hợp các dẫn chất 7a-f được trình bày dưới bảng 3.1

Bảng 3.1 Hiệu suất toàn phần quá trình tổng hợp các dẫn chất 7a-f

Dẫn chất R Hiệu suất toàn phần (%)

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Các dẫn chất 7a-f sau khi được tổng hợp, xử lý, tinh chế được kiểm tra độ tinh khiết bằng hai phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và đo nhiệt độ nóng chảy Các kết quả về giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy được trình bày cụ thể ở bảng 3.2

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254 với hệ dung môi pha động DCM:MeOH ở 3 tỷ lệ khác nhau là 90:1, 15:1 và 9:1 để kiểm tra độ tinh khiết Kết quả sắc ký đồ quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm cho thấy vết sản phẩm thu được tròn, gọn, rõ, không thấy xuất hiện vết phụ Kết quả giá trị

Rf của các dẫn chất 7a-f trong hệ dung môi DCM:MeOH = 9:1 được trình bày trong bảng 3.2

Các chất 7a-f thu được sau tinh chế đều ở thể rắn vì vậy có thể kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy sử dụng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Kết quả đo được cho thấy 6 dẫn chất 7a-f đều có nhiệt độ nóng chảy xác định với khoảng dao động hẹp (1-2°C) Kết quả được trình bày dưới bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất 7a-f

Các phương pháp dùng để khẳng định cấu trúc của 6 dẫn chất tổng hợp được bao gồm phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân giải cao (HRMS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon ( 13 C-NMR) Kết quả cụ thể được trình bày trong phần phân tích phổ dưới đây và phần phụ lục

Kết quả phổ hồng ngoại (IR) của các chất 7a-f được trình bày trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất 7a-f

Chất R Dao động hóa trị của các liên kết (cm -1 ) ν NH ν OH ν CH (aren) ν CH (CH2) ν C=O ν C=C

Nhận xét: Dựa trên phổ đồ (Phụ lục 1-6), thông qua vị trí, cường độ, hình dạng pic, có thể nhận ra sự có mặt của các dao động đặc trưng của một số liên kết như N-H, O-H, C=O, C=C, C-H

3.1.3.2 Phổ khối lượng phân giải cao (HRMS)

Kết quả phổ khối lượng phân giải cao (HRMS) của các chất 7a-f được trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ HRMS của các dẫn chất 7a-f

HOẠT TÍNH SINH HỌC

3.2.1 Hoạt tính ức chế enzym histon deacetylase

Các dẫn chất 7a-f được đánh giá hoạt tính ức chế enzym HDAC tổng chiết từ tế bào Hela bằng phương pháp huỳnh quang tại khoa Dược, Đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc) Thử nghiệm được đánh giá thông qua giá trị IC50, kết quả cụ thể được trình bày trong bảng 3.7

3.2.2 Tác dụng gây độc tế bào in vitro

Các dẫn chất 7a-f được thử tác dụng gây độc tế bào trên 3 dòng tế bào, bao gồm 1 dòng tế bào thường: dòng tế bào nguyên bào sợi phổi ở thai nhi (MRC-5) và hai dòng tế bào ung thư người: ung thư đại tràng (SW620), ung thư vú (MDA-MB-231) Kết quả giá trị IC50 được trình bày chi tiết trong bảng 3.7

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế HDAC và tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất 7a-f

Chất R LogP 1 Ức chế HDAC tổng (IC 50 2 , àM) Độc tớnh tế bào (IC 50 2 , àM) trờn từng dòng tế bào 3

Chỳ thớch: 1 Tớnh toỏn bằng phần mềm ChemDraw 16.0; 2 Nồng độ (àM) của cỏc dẫn chất tại đú ức chế 50% hoạt tính enzym HDAC hoặc ức chế 50% tế bào thử nghiệm; 3 Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (ung thư đại tràng), MDA-MB-231 (ung thư vú), MRC-5 (dòng tế bào nguyên bào sợi phổi ở thai nhi); 4 SAHA (acid suberoylanilid hydroxamic): chất đối chiếu dương tính; 5 ADR: chất đối chiếu dương tính

Nhận xét: Kết quả thu được cho thấy 6 dẫn chất tổng hợp được đều có khả năng ức chế

HDAC với giỏ trị IC50 nằm trong khoảng từ 0,142-0,425 àM Đồng thời, cả 6 dẫn chất đều thể hiện hoạt tính gây độc trên 2 dòng tế bào ung thư SW620 và MDA-MB-231 (IC50 = 3,64-46,54 àM) Khi thử tỏc dụng trờn dũng tế bào MRC-5, 6 dẫn chất đều ức chế tế bào thường yếu hơn so với khi thử trên các dòng tế bào ung thư

3.2.3 Đánh giá ảnh hưởng lên chu kỳ tế bào

Do dẫn chất 7d có tác dụng ức chế mạnh trên hai dòng tế bào ung thư thử nghiệm nên được lựa chọn đại diện để đánh giá ảnh hưởng lên chu kỳ tế bào Kết quả được trình bày trong bảng 3.8

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá ảnh hưởng lên chu kỳ tế bào của dẫn chất 7d

Tỉ lệ tế bào ở các giai đoạn (%)

Chú thích: UN: Tế bào không được ủ chất ức chế, VH: Tế bào được ủ với dung môi DMSO 0,05%

Nhận xột: Kết quả đỏnh giỏ ảnh hưởng lờn chu kỳ tế bào cho thấy ở nồng độ 5 àM sau

24 giờ ủ trên dòng tế bào SW620, 7d gây chết tế bào với số lượng lớn tương tự SAHA Tuy nhiên 7d hầu như không gây bắt giữ chu kỳ tế bào

3.2.4 Đánh giá ảnh hưởng lên quá trình apoptosis của tế bào

Dẫn chất 7d tiếp tục được đánh giá ảnh hưởng lên quá trình apoptosis của tế bào Kết quả được trình bày trong bảng 3.9

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá ảnh hưởng lên quá trình apoptosis của 7d

Mẫu Tỉ lệ tế bào ở các loại (%)

Chú thích: UN: Tế bào không được ủ chất ức chế, VH: Tế bào được ủ với dung môi DMSO 0,05%

Nhận xét: Kết quả đánh giá ảnh hưởng lên quá trình apoptosis cho thấy khi thử trên dũng tế bào SW620, dẫn chất 7d ở nồng độ 5 àM và ủ trong 24 giờ gõy ra cả quỏ trỡnh apoptosis sớm và apoptosis muộn.

BÀN LUẬN

Các dẫn chất 7a-f trong khóa luận được tổng hợp thông qua quy trình gồm 5 bước, sử dụng các phản ứng hóa học như phản ứng thế nucleophin, phản ứng ngưng tụ tạo vòng quinazolin-4-(3H)-on, phản ứng N-alkyl hóa, phản ứng CuAAC và phản ứng tạo acid hydroxamic sử dụng hydrolamin hydroclorid trong môi trường kiềm Nhìn chung, các chất trung gian và sản phẩm đều có cấu trúc tương đối phức tạp, quy trình gồm nhiều bước nên cần tối ưu hóa các điều kiện phản ứng để nâng cao hiệu suất cũng như đảm bảo độ tinh khiết cho sản phẩm cuối cùng

3.3.1.1 Phản ứng thế nucleophin để tổng hợp các dẫn chất azid

Chú thích: : trạng thái chuyển tiếp

Sơ đồ 3.12 Cơ chế đề xuất của phản ứng thế tạo azid

Methyl 4-(bromomethyl)benzoat được phản ứng với natri azid trong dung môi methanol để tạo sản phẩm thế azid Do dẫn chất bromid có chứa brom liên kết với carbon bậc 1, phản ứng được đề xuất diễn ra thông qua cơ chế SN2 (sơ đồ 3.12) trong đó sự tấn công của nhóm ái nhân là ion azid diễn ra đồng thời với sự rời đi của brom NaN3 được sử dụng với lượng dư (5 đương lượng) để giúp tăng tốc độ phản ứng, phản ứng dễ diễn ra hoàn toàn và không còn dư bromid ban đầu Đồng thời NaN3 dễ tan trong nước nên có thể được loại bỏ dễ dàng sau phản ứng bằng phương pháp chiết với nước

3.3.1.2 Phản ứng đóng vòng quinazolin-4(3H)-on

Các dẫn chất của quinazolin-4(3H)-on được tổng hợp thông qua phản ứng đóng vòng Niementowski [34] sử dụng nguyên liệu là các acid 2-aminobenzoic với các nhóm thế khác nhau và formamid Ban đầu, cặp điện tử tự do của N trên nhóm amino trong các acid 2-amino benzoic tấn công ái nhân vào carbon trong nhóm carbonyl của formamid Tiếp theo là quá trình tách nước để tạo hợp chất imin trung gian Sau đó cặp electron tự do của N từ formamid ban đầu trong imin tấn công nội phân tử vào nhóm carboxylic, quá trình trao đổi điện tử diễn ra và cuối cùng là quá trình loại một phân tử nước để hình thành sản phẩm quinazolin-4(3H)-on

Sơ đồ 3.13 Cơ chế đề xuất của phản ứng đóng vòng tạo quinazolin-4-(3H)-on Đề tài lựa chọn phương pháp này do hiệu suất thu sản phẩm rất cao (90 – 95%) đồng thời điều kiện tiến hành khá đơn giản Trong phản ứng này, formamid vừa đóng vai trò là chất tham gia, vừa làm dung môi phản ứng nên được sử dụng với lượng dư (5 đương lượng) Phản ứng được tiến hành ở nhiệt độ cao, khoảng 120 °C, giúp cho các acid 2-aminobenzoic tan trong formamid để phản ứng xảy ra dễ dàng hơn đồng thời nhiệt độ cao còn có vai trò loại nước trong quá trình phản ứng Bước loại nước thứ hai đóng vai trò quan trọng để chuyển imin thành sản phẩm, nếu nhiệt độ không đủ cao, lượng sản phẩm trung gian imin sẽ còn dư nhiều, hiệu suất phản ứng giảm

Phản ứng được xử lý với dung dịch NaHCO3 do dung dịch có tính kiềm có thể hòa tan các acid 2-aminobenzoic còn dư cũng như imin còn lại (mang nhóm chức carboxylic) chưa chuyển hóa hết thành sản phẩm Formamid tan nhiều trong nước nên cũng được loại bỏ dễ dàng, các quinazolin-4(3H)-on sẽ kết tủa nên có thể lọc để thu sản phẩm với độ tinh khiết cao Khi xử lý cần chú ý xử lý ngay khi hỗn hợp sản phẩm còn ở nhiệt độ cao do khi để nguội, chất đầu và sản phẩm sẽ kết tủa đồng thời tạo thành chất rắn bao bọc các phân tử acid Vì vậy, các acid 2-aminobenzoic sẽ khó tiếp xúc với dung dịch NaHCO3 khi xử lý và bị lẫn trong tủa sản phẩm

Phản ứng N-alkyl tạo thành các dẫn chất 5a-f sử dụng xúc tác là muối KI có vai trò làm tăng hiệu suất theo cơ chế Finkelstein Khả năng tham gia phản ứng thế của các

46 dẫn chất halogenid giảm dần theo thứ tự từ I, Br, Cl và F theo chiều giảm dần của độ dài liên kết C-halogen Kali iodid có vai trò phản ứng với propargyl bromid để tạo propargyl iodid, chất này sẽ phản ứng với quinazolin-4(3H)-on từ đó giúp tăng khả năng phản ứng so với dẫn chất bromid Mặc dù iodo là nhóm đi ra dễ hơn so với bromo nhưng do muối KBr tạo thành ít tan trong dung môi aceton hơn so với KI nên cân bằng tạo thành dẫn chất iodid chuyển dịch theo chiều thuận (nguyên lý Le Chatelier)

Do nhóm NH trong quinazolin-4(3H)-on có tính ái nhân yếu nên cần sử dụng một base là K2CO3 đóng vai trò lấy proton để tạo thành một anion có tính ái nhân cao hơn, dễ dàng tấn công vào propargyl iodid Ngoài ra, tùy theo điều kiện phản ứng mà sản phẩm tạo thành có thể là sản phẩm N-alkyl hóa hoặc O-alkyl hóa Nghiên cứu của Špulák và cộng sự đã chỉ ra rằng trong phản ứng trong điều kiện dung môi aceton, xúc tác

K2CO3 và KI thì chỉ tạo ra sản phẩm N-alkyl hóa [74] Đồng thời, trong phổ 1 H-NMR của các dẫn chất 7a-f, pic đơn tương ứng với 2 proton methylen nằm trong vùng 5,25- 5,27 ppm; trong phổ 13 C-NMR, pic tương với với carbon của nhóm methylen nằm trong vùng 41-42 ppm Hai dữ kiện phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR này cũng khẳng định sản phẩm tạo thành là N-alkyl hóa do nếu tạo thành sản phẩm O-alkyl hóa, các giá trị độ chuyển dịch của 2 hydro và carbon nhóm methylen phải lần lượt trong khoảng là 5,6-5,7 ppm và 72-77 ppm [74]

Sơ đồ 3.14 Cơ chế đề xuất phản ứng N-alkyl hóa tổng hợp dẫn chất 5a-f Đương lượng giữa quinazolin-4(3H)-on và propargyl bromid được sử dụng là 1:1 do propargyl bromid dư khó loại được bằng phương pháp chiết DCM – nước khi xử lý và sẽ tham gia phản ứng CuAAC tiếp theo sẽ gây ảnh hưởng đến tính toán đương lượng gây thiếu lượng azid cần dùng đồng thời tạo ra sản phẩm phụ

3.3.1.4 Phản ứng cộng đóng vòng alkyn-azid xúc tác đồng(I)

Khóa luận lựa chọn phản ứng CuAAC [78] để tổng hợp vòng 1,2,3-triazol sử dụng xúc tác đồng(I) với mục đích tạo thành chọn lọc đồng phân thế ở vị trí 1,4 Cơ chế chi tiết của phản ứng được trình bày trong phần tổng quan ( Hình 1.8 , mục 1.4.2) Phản ứng diễn ra trong thời gian ngắn, hoàn toàn với hiệu suất khá cao 84,7-89,6%

Trong các loại xúc tác đồng(I), CuI được lựa chọn sử dụng do việc sử dụng trực tiếp dạng Cu(I) giúp tăng tốc độ phản ứng so với việc tạo Cu(I) từ khử Cu(II) hoặc oxy

47 hóa Cu(0) in situ Đồng thời, CuI có khả năng tan một phần trong dung môi phân cực trung bình như MeCN nên có thể giúp tăng khả năng phản ứng [54]

Lượng đồng dư sau phản ứng có thể lẫn trong sản phẩm cuối cùng gây ảnh hưởng đến hoạt tính khi đánh giá tác dụng sinh học Vì vậy cần có biện pháp xử lý để loại CuI dư cũng như Cu 2+ bị oxy hóa một phần từ Cu(I) Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp được cất quay dưới áp suất giảm để loại bỏ hoàn toàn MeCN do nếu dư MeCN có thể hòa tan một phần CuI Tiếp theo, hỗn hợp rắn được phân tán trong hệ EA – dung dịch

Na2CO3 để kết tủa các muối đồng còn lại sau phản ứng và cuối cùng các kết tủa này được loại bỏ hoàn toàn bằng cách lọc qua phễu Buchner với chất trợ lọc Celite

3.3.1.5 Phản ứng tạo acid hydroxamic từ ester

Định dạng
Số trang	102
Dung lượng	7,57 MB