Đánh giá tác dụng kháng ung thư của một số loài dược liệu phía nam

BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ THƯỜNG XUYÊN ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA MỘT SỐ LỒI DƯỢC LIỆU PHÍA NAM Chủ nhiệm nhiệm vụ TS Lê Văn Minh Đơn vị Trung tâm Sâm Dược liệu Tp Hồ Chí Minh Thời gian thực 12/2016 đến 11/2017 Tp Hồ Chí Minh – 01/2018 BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ THƯỜNG XUYÊN ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA MỘT SỐ LỒI DƯỢC LIỆU PHÍA NAM CHỦ NHIỆM NHIỆM VỤ TRƯỞNG ĐƠN VỊ VIỆN DƯỢC LIỆU Tp Hồ Chí Minh – 01/2018 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CỤM TỪ - KÝ HIỆU VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG .ii DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ iii PHẦN A CÁC THÔNG TIN CHUNG iv I TĨM TẮT NỘI DUNG, CƠNG VIỆC CHỦ YẾU ĐÃ ĐẠT ĐƯỢC iv II CÁC SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI v 2.1 Kết nghiên cứu v 2.2 Hình thức, cấp độ công bố kết v III TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ .vi PHẦN B NỘI DUNG BÁO CÁO TỔNG KẾT vii MỞ ĐẦU vii CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kuz.) 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Một số nghiên cứu giới 1.2 Tổng quan Trâm mốc (Syzygium cumini (L.) Skeels) 1.2.1 Giới thiệu chung 1.2.2 Một số nghiên cứu giới 1.3 Tổng quan Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme (L.) Gaertn.) 1.3.1 Giới thiệu chung 1.3.2 Một số nghiên cứu giới 1.4 Tổng quan ung thư 1.4.1 Giới thiệu chung 1.4.2 Tình hình ung thư giới nước 10 1.4.3 Các liệu pháp điều trị ung thư 11 CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Nguyên vật liệu 12 2.1.1 Nguyên liệu 12 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 12 2.2 Phương pháp nghiên cứu 14 2.2.1 Chiết xuất dược liệu [2, 3] 14 2.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng ung thư in vitro thực nghiệm MTT [14] 17 2.2.3 Đánh giá kết 18 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 3.1 Hiệu suất chiết xuất dược liệu 19 3.2 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 22 3.3 Khảo sát hoạt tính ức chế dịng tế bào ung thư gan Hep-G2 ung thư vú MCF-7 loại cao chiết 28 3.3.1 Khảo sát hoạt tính 18 cao chiết dòng tế bào ung thư gan người Hep-G2 28 3.3.2 Khảo sát hoạt tính 18 cao chiết dịng tế bào ung thư vú người MCF-7 29 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 4.1 Kết luận 33 4.2 Kiến nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC 39 DANH MỤC CÁC CỤM TỪ - KÝ HIỆU VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ED50 Half maximal effective dose Liều hiệu trung bình BuOH Butanol Butanol Hep-G2 Liver hepatocellular carcinoma Dòng tế bào ung thư gan cell line MCF-7 Human breast adenocarcinoma Dòng tế bào ung thư vú cell line EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetat IC50 Half maximal inhibitory Nồng độ ức chế trung bình concentration MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide diphenyltetrazolium bromid MIC Minimal Inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu FBS Fetal bovine serum Huyết thai bò PBS Phosphate buffered saline Dung dịch đệm phosphat DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Acid ethylenediaminetetraacetic i DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách thiết bị, dụng cụ hóa chất, thuốc thử sử dụng nghiên cứu 12 Bảng 3.1 Hiệu suất chiết cao toàn phần 19 Bảng 3.2 Kết thử độc tính tế bào phương pháp MTT với mẫu chứng dương Camptothecin (CPT 0.01) 27 Bảng 3.3 Tỷ lệ ức chế (%) tăng trưởng hai dòng tế bào ung thư MCF-7 Hep-G2 sau 48 xử lý với cao chiết nồng độ 100 µg/ml 300 µg/ml 28 ii DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1.1 Cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare) Hình 1.2 Cây Trâm mốc (Syzygium cumini) Hình 1.3 Cây Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme) Hình 2.1 Bột khơ Trâm bầu (trái); hạt Trâm mốc (giữa); Ngọc nữ biển (phải) 12 Sơ đồ 2.1 Sơ đồ chiết xuất cao toàn phần từ dược liệu 15 Sơ đồ 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao phân đoạn từ dược liệu 16 Hình 3.1 Hiệu suất trích ly cao tồn phần cao phân đoạn Trâm bầu 20 Hình 3.2 Hiệu suất trích ly cao toàn phần cao phân đoạn hạt Trâm mốc 21 Hình 3.3 Hiệu suất trích ly cao toàn phần cao phân đoạn Ngọc nữ biển 22 Hình 3.4 Hình thái tế bào Hep-G2 sau ủ phút với 0,025% Trypsin/EDTA 37 oC tủ ấm 5% CO2 quan sát kính hiển vi soi ngược (100X) 23 Hình 3.5 Hình thái tế bào Hep-G2 sau 24 nuôi cấy tủ ủ 5% CO2 37 oC quan sát kính hiển vi soi ngược (100X) 24 Hình 3.6 Tỷ lệ ức chế (%) tăng trưởng tế bào ung thư Hep-G2 sau 48 xử lý với cao chiết từ hạt Trâm mốc, Trâm bầu Ngọc nữ biển nồng độ (A) 100 µg/ml (B) 300 µg/ml TM - Trâm mốc, NNB - Ngọc nữ biển, TB - Trâm bầu 29 Hình 3.7 Tỷ lệ ức chế (%) tăng trưởng tế bào ung thư MCF-7 sau 48 xử lý với cao chiết từ Trâm bầu, hạt Trâm mốc Ngọc nữ biển nồng độ (A) 100 µg/ml (B) 300 µg/ml TM - Trâm mốc, NNB - Ngọc nữ biển, TB - Trâm bầu 30 iii PHẦN A CÁC THƠNG TIN CHUNG I TĨM TẮT NỘI DUNG, CƠNG VIỆC CHỦ YẾU ĐÃ ĐẠT ĐƯỢC STT Nội dung Sản phẩm phải đạt Sản phẩm Đánh theo kế hoạch đạt giá Đủ số lượng nguyên Đủ số lượng nguyên Thu thập sơ chế liệu nghiên cứu đạt liệu nghiên cứu đạt yêu cầu “mất khối yêu cầu “mất khối nguyên liệu lượng làm khô” Chiết cao tổng 03 loại cao tổng 15 cao phân đoạn Hoàn thiện quy trình phương cao phân đoạn Đạt lượng làm khô” 03 loại cao tổng 15 cao phân đoạn đủ số Đạt lượng nghiên cứu Quy trình phương pháp pháp phù hợp với điều đánh giá kháng ung kiện phịng thí nghiệm thư in vitro để ni lưu giữ dịng tế bào ung thư dịng tế bào Quy trình phương pháp phù hợp Đạt Phòng sinh học phân tử - TT Sâm Dược liệu Tp HCM Khảo sát hoạt tính ức chế dịng tế bào ung thư gan Hep-G2 ung thư vú MCF7 loại cao Chỉ số ức chế Chỉ số ức chế cao chiết từ 03 loài cao chiết từ 03 loài dược liệu Đạt dược liệu chiết iv II CÁC SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI 2.1 Kết nghiên cứu Yêu cầu khoa học hoặc/và tiêu kinh tế - STT kỹ thuật Tên sản phẩm Đăng ký Quy trình nhân ni tế bào ung thư Quy trình phương Quy trình phương pháp phù hợp với pháp phù hợp với điều điều kiện Bảng số IC50 cao tổng Đạt cao phân đoạn hai dòng tế bào ung thư kiện Các số liệu đạt độ tin cậy khoa học Bảng số ức chế cao chiết từ 03 lồi dược liệu Đạt u cầu cơng bố 01 báo khoa học tạp chí Đã gửi đăng tải chuyên ngành Cao chiết loài dược liệu gram/loại 05 cao chiết có số 03 cao chiết tiềm (cao tổng IC50 < 100 µg/ml, cao gram/loại phân đoạn IC50 < 50 µg/ml 2.2 TT ≥ gram/loại ức chế nồng độ 100 µg/ml lớn 50% Hình thức, cấp độ cơng bố kết Tên cơng trình Nơi cơng bố Khảo sát thành phần hóa học hoạt Tạp chí Y học tính sinh học cao chiết hạt trâm (ISSN 1859(Syzygium cumini (L.) Skeels) 1779) Năm Đánh giá công bố chung 2018 Đã gửi đăng tải v III TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ Đơn vị: VND TT I 1.1 Mục Năm Tiền nguyên vật liệu, hóa chất, chi khác 1.2 Tiền cơng th khốn II Năm 2.1 Th khốn cơng lao động Cộng Số tiền duyệt Số tiền Số tiền xin theo dự toán chi toán 2017 2017 2017 40.000.000 40.000.000 40.000.000 40.000.000 40.000.000 40.000.000 vi Sau ly tâm, loại dịch phía để thu nhận phần cặn tế bào đáy ống ly tâm Huyền phù cặn tế bào vào mL môi trường làm ấm không chứa FBS Đếm tế bào: 10 µL huyền phù tế bào chuyển vào 1,5 mL eppendorf tube để chuẩn bị cho việc đếm tế bào 10 µL Trypan Blue thêm vào tube Pipette vài lần đề huyền phù hỗn hợp 10 µL dung dịch chứa tế bào sau sử dụng để đếm tế bào Buồng đếm hồng cầu sử dụng để hỗ trợ việc đếm số lượng tế bào Sau xác định số lượng tế bào, tính tốn thể tích môi trường chứa 10% FBS cần thêm vào để pha lỗng để đạt mật độ tế bào thích hợp, sau chuyển tế bào vào flask để ni cấy 10 Đặt flask có chứa tế bào vào tủ ủ 5% CO2 37 oC Sau 24 giờ, kiểm tra trạng thái tế bào Môi trường thay ngày lần C Lưu trữ tế bào phương pháp đông lạnh Môi trường dùng để lưu trữ tế bào đông lạnh chuẩn bị bảo quản 2-8 oC sử dụng Môi trường lưu trữ gồm Môi trường nuôi cấy: FBS: DMSO = 5: 4: Khi mật độ tế bào flask đạt khoảng 80% có nhu cầu lưu trữ, tế bào tách khỏi flask ni cấy theo quy trình mơ tả sau: - Trước cấy chuyền, cần quan sát kiểm tra hình thái tế bào tình trạng nhiễm kính hiển vi - Mơi trường flask loại bỏ, sau tế bào rửa lần PBS pH 7.4 (khoảng mL cho T25-flask) - Sau rửa tế bào loại bỏ PBS, mL Trypsin đươc thêm vào T25-flask, ủ vòng phút 37 oC tủ ấm 5% CO2 - Thêm khoảng mL môi trường không chứa FBS vào flask trên, huyền phù thu tế bào vào ống ly tâm tích 15 mL - Sau ly tâm, loại bỏ dịch thu nhận cặn tế bào Huyền phù cặn tế bào vào mL môi trường làm ấm khơng chứa FBS Đếm tế bào: 10 µL huyền phù tế bào chuyển vào 1,5 mL eppendorf tube để chuẩn bị cho việc đếm tế bào 10 µL Trypan Blue thêm vào tube Pipette vài lần đề huyền phù hỗn hợp 10 µL dung dịch chứa tế bào sau sử dụng để đếm tế bào Buồng đếm hồng cầu sử dụng để hỗ trợ việc đếm số lượng tế bào Sau xác định số lượng tế bào, tính tốn thể tích mơi trường dùng để đơng lạnh tế bào chứa FBS DMSO cần thêm vào để pha loãng để đạt mật độ tế bào 106 tế bào/ml Chuyển dung dịch chứa tế bào vào ống cryovial để trữ tế bào (1 mL/ống) Các ống làm lạnh từ từ theo quy trình: giữ -20 oC đầu, sau chuyển vào tủ -80 oC giữ ngày Ngày tiếp theo, tế bào chuyển vào lưu trữ bình nitơ lỏng D Phương pháp thử độc tính tế bào a Nguyên lý - Tetrazolium MTT màu vàng: 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5 diphenyltetrazolium bromid - Nguyên lý phương pháp tế bào cịn sống, MTT, tetrazolium có màu vàng, tác dụng enzym oxidoreductase bị khử tạo thành formazan màu tím khơng tan DMSO sử dụng dung mơi hịa tan formazan để tạo thành dung dịch màu tím Độ hấp thu dung dịch màu tím đọc máy quang phổ bước sóng định Phương pháp MTT sử dụng để đánh giá độ độc chất hay mẫu nghiên cứu ảnh hưởng lên hoạt động phát triển tế bào b Phương pháp ❖ Mẫu thử (1) Mẫu trắng chứa môi trường nuôi cấy (2) Mẫu chứng dương chứa camptothecin 0,01 µg/ml (3) Mẫu chứng âm chứa 5% DMSO (4) Mẫu thử ❖ Tiến hành Tế bào cấy vào đĩa 96 giếng với mật độ 104 tế bào/100 µL.giếng ủ 37 oC tủ 5% CO2 24 Sau 24 giờ, loại bỏ môi trường nuôi cấy, 100 µL dung dịch mẫu thử mẫu chứng thêm vào giếng tế bào tương ứng, tiếp tục ủ thêm 24 tủ ủ 37 o C tủ 5% CO2 Ngày tiếp theo, 10 µL dung dịch MTT thêm vào giếng tế bào để thu nồng độ MTT cuối 0,45 mg/mL Tế bào ủ thêm khoảng - 37 oC thấy xuất màu tím Thêm 100 µL DMSO để hịa tan tinh thể formazan màu tím thu dung dịch đồng màu tím Dùng pipette để trộn hỗn hợp, đảm bảo hỗn hợp tan hoàn toàn Độ hấp thu hỗn hợp đo bước sóng 570 nm giải trừ hấp thu bước sóng 630 nm Tính tốn giá trị trung bình từ giá trị ba lần lặp lại trừ giá trị trung bình mẫu trắng BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU NHIỆM VỤ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP VIỆN TÊN NHIỆM VỤ: ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA MỘT SỐ LOÀI DƯỢC LIỆU PHÍA NAM BẢNG PHẦN TRĂM ỨC CHẾ CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ 03 LỒI DƯỢC LIỆU TRÊN DỊNG TẾ BÀO UNG THƯ Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Lê Văn Minh Đơn vị: Trung tâm Sâm Dược liệu TP HCM Thời gian thực hiện: 12/2016-11/2017 Tp Hồ Chí Minh, 2017 Bảng Tỷ lệ ức chế (%) tăng trưởng hai dòng tế bào ung thư MCF-7 Hep-G2 sau 48 xử lý với cao chiết từ lồi dược liệu nồng độ 100 µg/ml 300 µg/ml MCF-7 Hep-G2 100 µg/ml TM NNB TB CPT TM NNB TB CPT M1 -0,8±21,3 3,4±7,1 19,8± 6,7 3,1±15,7 -26,4±4,3 -5,8±10,0 M2 78,7±2,2 14,1±8,1 54,1± 6,1 65,0±5,6 -10,3±9,5 8,1±3,9 M3 26,5±6,9 17,9±9,4 13,7±4,2 -2,7±3,5 -16,7±2,4 -14,5±9,4 24,5±2,2 27,7±2,2 M4 75,8±3,5 63,8±16, 73,1±2,7 45,5±5,1 -2,8±3,0 13,2±13,0 M5 12,6±5,1 10,2±8,7 17,0±12,6 -2,5±18,4 9,5±4,4 -32,3±19,0 M6 4,7±9,5 -16,2±2,8 -2,9±7,6 1,8±8,0 -23,7±19,2 -23,0±26,8 300 µg/ml M1 46,9±0,6 58,8±10,4 10,6±0,7 12,2±3,0 -33,1±12,5 69,9±5,6 M2 63,3±2,2 23,5±3,7 0,5±1,6 85,2±1,1 -9,8±17,1 91,4±1,3 M3 62,9±1,5 40,1±1,5 18,6±2,6 29,1±6,2 21,5±3,2 73,4±2,6 M4 81,7±1,4 68,4±1,1 8,7±2,3 69,1±0,8 53,2±4,8 80,7±2,6 M5 7,8±4,3 10,0±3,6 6,9±1,7 -14,3±23,2 3,8±12,4 57,8±6,7 M6 50,1±1,5 14,8±8,3 42,9±1,6 -14,8±7,2 -1,2±2,5 9,3±17,8 Chú thích: TM - Trâm mốc, NNB - Ngọc nữ biển, TB - Trâm bầu, CPT – Camptothecin, M1-Cao toàn phần, M2-Cao hexan (Cao diethyl ether TM), M3-Cao chloroform, M4-Cao ethyl acetat, M5-Cao n-butanol, M6-Cao nước BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU NHIỆM VỤ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP VIỆN TÊN NHIỆM VỤ: ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA MỘT SỐ LỒI DƯỢC LIỆU PHÍA NAM BÀI BÁO KHOA HỌC Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Lê Văn Minh Đơn vị: Trung tâm Sâm Dược liệu TP HCM Thời gian thực hiện: 12/2016-11/2017 Tp Hồ Chí Minh, 2017 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HỐ HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT HẠT TRÂM MỐC (SYZYGIUM CUMINI (L.) SKEELS) Lý Hải Triều*, Nguyễn Lê Tuyên*, Lâm Bích Thảo*, Nguyễn Hoàng Dũng**,Phùng Thị Thu Hường**, Nguyễn Thái Biềng***, Lê Văn Minh* TĨM TẮT Đặt vấn đề: Tình trạng kháng thuốc kháng sinh gia tăng mức gốc tự thể dẫn đến nhiều bệnh mãn tính thối hóa vấn đề quan tâm chăm sóc sức khoẻ cộng đồng Việc cung cấp chất chống oxy hóa tự nhiên tìm dược liệu có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư, an toàn, hiệu giá phải cần thiết Mục tiêu: Khảo sát thành phần hóa thực vật đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa kháng ung thư chiết xuất từ hạt Trâm mốc, đáp ứng nhu cầu tìm nguồn dược liệu Phương pháp: Bột hạt Trâm mốc chiết xuất phương pháp ngấm kiệt chiết lỏng-lỏng thu cao chiết toàn phần cao phân đoạn Hàm lượng flavonoid toàn phần xác định phương pháp UV-Vis theo chuẩn quercetin Khả kháng khuẩn xác định phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, hoạt tính kháng oxy hóa thực nghiệm đánh bắt gốc tự DPPH kháng ung thư thực nghiệm MTT Kết quả: Hạt Trâm mốc có chứa nhóm alkaloid, flavonoid, tannin, triterpenoid, saponin, coumarin, anthraquinon, chất béo, tinh dầu, acid hữu chất khử Hàm lượng flavonoid trừ ẩm mẫu nguyên liệu đạt 0,084% mẫu cao chiết đạt 0,201% Cao chiết ethanol, cao ethyl acetat, cao n-butanol cao nước có khả kháng hai dịng vi khuẩn Escherichia coli Staphylococcus aureus Các cao chiết từ hạt trâm mốc thể hoạt tính đánh bắt gốc tự DPPH, IC50 cao diethyl ether (3,85 µg/ml) cao ethyl acetat (3,77 µg/ml) thấp chứng dương acid ascorbic (4,37 µg/ml) Ở nồng độ 100 µg/ml 300 µg/ml, cao diethyl ether cao ethyl acetat thể hoạt tính ức chế tăng trưởng tế bào ung thư 50% dòng tế bào MCF-7 Hep-G2 Trong đó, chứng dương Camptothecin (0,01 µg/ml) ức chế 24,5±2,2% MCF-7 27,7±2,2% Hep-G2 Kết luận: Kết nghiên cứu cho thấy, hạt Trâm mốc nguồn nguyên liệu tiềm để nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất có tác dụng sinh học cao, góp phần phịng ngừa hỗ trợ điều trị nhiễm khuẩn bệnh lý liên quan đến gốc tự Từ khóa: trâm mốc, flavonoid, kháng khuẩn, kháng oxy hóa, kháng ung thư ABSTRACT PHYTOCHEMICAL COMPOSITION AND BIOLOGICAL PROPERTIES OF SYZYGIUM CUMINI (L.) SKEELS SEED EXTRACTS Ly Hai Trieu, Nguyen Le Tuyen, Lam Bich Thao, Nguyen Hoang Dung, Phung Thi Thu Huong, Nguyen Thai Bieng, Le Van Minh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No - 2019: 268 – 276 Background: Antibiotic resistance and overgrowth of free radicals in the body causing chronic diseases and degenerative diseases are matters of concern in the public healthcare sector Providing natural antioxidants and Trung t}m S}m v| Dược liệu TP Hồ Chí Minh, Viện Dược liệu – Bộ Y Tế Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT, Đại học Nguyễn Tất Thành ***Viện Đ|o tạo Dược, Học Viện Quân Y Tác giả liên lạc: TS Lê Văn Minh ĐT: 0937326123 Email: lvminh05@gmail.com * ** 268 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học finding new antibiotic and anticancer compounds which are safe, effective and affordable are essential Objectives: To investigate phytochemical compositions and evaluate antimicrobial, antioxidant and anticancer activities of Syzygium cumini seed extracts in order to search for new medicinal materials Method: Syzygium cumini seed powder was extracted through percolation and liquid-liquid extraction methods to obtain total extract and fractions The content of total flavonoids was determined by UV-Vis spectrophotometric method based on quercetin standard Antibacterial, antioxidant and anticancer activities were addressed by agar diffusion; DPPH radical capture methods; and MTT assay, respectively Results: The main phytochemicals found in the seeds include alkaloids, flavonoids, tannins, triterpenoids, saponins, coumarins, anthraquinones, fats, essential oils, organic acids, and reducing agents The contents of flavonoids dry weights were 0.084% and 0.201% in the raw material and in the crude extract, respectively The ethanol extract and fractions of ethyl acetate, n-buthanol and water significantly revealed resistance to Escherichia coli and Staphylococcus aureus All Syzygium cumini seed extracts presented DPPH free radical scavenging activity, therein, the IC50 values of diethyl ether (3.85 µg/mL) and ethyl acetate (3.77 µg/mL) fractions were lower than that of ascorbic acid (4.37 µg/mL) At 100 µg/ml and 300 µg/ml, diethyl ether and ethyl acetate fractions caused more than 50% growth inhibition of two cancer cell lines (MCF-7 and Hep-G2) in days While, Camptothecin as a positive control at 0.01 µg/mL expressed inhibitory activities of 24.5±2.2% for MCF-7 and 27.7±2.2% for Hep-G2 Conclusion: The results showed that the Syzygium cumini seeds are the promising medicinal material contributing to studies on antibiotics, natural antioxidant and anticancer compounds That plays a pivotal role in the prevention and treatment of diseases associated with pathogen infections and free radicals Keywords: syzygium cumini (L.) skeels, flavonoids, antibacterial, antioxidant, anticancer thường điều trị liệu ph{p miễn dịch, ĐẶT VẤN ĐỀ hóa trị, xạ trị, phẫu thuật v| nhắm mục tiêu Thuốc kháng sinh giải ph}n tử kết hợp yếu tố n|y Tuy pháp quan trọng việc loại bỏ bệnh nhiên, c{c thuốc hóa trị liệu g}y nhiều t{c nhiễm trùng vi khuẩn Tuy nhiên, tình trạng dụng phụ mệt mỏi, rụng tóc, suy giảm sức kháng kháng sinh ngày trầm trọng nhiều khỏe Nắm bắt c{c tình trạng trên, c{c nh| quốc gia sử dụng kháng sinh không kiểm khoa học giới quay tìm kiếm, sốt, sử dụng kháng sinh khơng phù hợp Thách s|ng lọc c{c hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh thức lớn chăm sóc sức khoẻ cộng đồng học an to|n, hiệu v| kinh tế nhu cầu loại thuốc mới, an toàn, hiệu để điều trị bệnh nhiễm khuẩn, đặc biệt c{c nước ph{t triển, nơi có tới nửa số người tử vong bệnh truyền nhiễm(12) Song song đó, tình trạng qu{ tải c{c gốc tự thể sinh vật l| nguyên nh}n g}y số bệnh mãn tính v| tho{i hóa ung thư, rối loạn miễn dịch, lão hóa, viêm khớp dạng thấp, đ{i th{o đường, bệnh tim mạch, suy giảm hệ thần kinh Hiện nay, có nhiều chất chống oxy hóa tổng hợp sử dụng, nhiên, chúng g}y số t{c dụng phụ ảnh hưởng đến chức gan, thận, chức tim mạch, hệ thần kinh v| tạo chất g}y ung thư(8) Ung thư Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Cây Trâm mốc (Syzygium cumini L skeels), c}y thường xanh nhiệt đới thuộc họ Đ|o Kim Nương (Myrtaceae), xuất nhiều miền Nam, Việt Nam Theo kinh nghiệm dân gian, trái Trâm mốc có vị chát, giàu anthocyanin, giàu vitamin A, C, giúp tiêu hóa tốt, hạ đường huyết, viêm dày Lá Trâm mốc chứa nhiều tannin dễ tiêu v| dùng nấu nước tr|, có lợi cho người bệnh tiểu đường Nhiều nghiên cứu giới cho thấy phận Trâm mốc chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học, tiềm điều trị bệnh, hạt Trâm mốc có chứa alkaloid, glycosid, triterpenoid, steroid, 269 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 saponin, flavonoid, tannin thể nhiều hoạt tính sinh học kh{ng ung thư, kh{ng oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm, trị tiểu đường, bảo vệ gan(2,6) chất béo, tinh dầu, carotenoid, c{c acid hữu cơ, chất khử theo phương ph{p Cuilei (Trường Đại học Ruman) có sửa đổi phù hợp(13) Nghiên cứu n|y tiến h|nh x{c định sơ th|nh phần hóa thực vật, đ{nh gi{ hoạt tính kh{ng khuẩn, kh{ng oxy hóa v| kh{ng ung thư từ hạt tr}m mốc, cung cấp c{c liệu khoa học cho định hướng nghiên cứu sau n|y Bột nguyên liệu chiết ngấm kiệt với ethanol 96%, 70% 45% nhiệt độ phòng nhiệt độ phòng Cho bột nguyên liệu làm ẩm vào bình chiết ngấm kiệt, bổ sung ethanol 96% ngập bề mặt dược liệu từ 5-7 cm Giữ yên nhiệt độ phòng 24 Tiến hành rút dịch chiết với tốc độ ml/phút Bã dược liệu tiếp tục chiết tương tự với dung môi ethanol 70% 45% Tập trung toàn dịch chiết ba nồng độ trên, cô quay ch}n không áp suất giảm thu cao chiết toàn phần (Cao T)(13) VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thí nghiệm Nguyên liệu thực vật Mẫu trái Trâm mốc (Syzygium cumini (L.) Skeels) chín thu hái v|o th{ng 12 năm 2016 thành phố Hồ Chí Minh Tr{i loại bỏ phần thịt, hạt làm sạch, phơi sấy khô xay thành bột để nghiên cứu Mẫu giám định v| lưu giữ Trung t}m S}m v| Dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh Hố chất, thuốc thử, thiết bị dụng cụ Ethanol 96% (Công ty Cổ phần Dược phẩm OPC), diethyl ether, chloroform, ethyl acetat, nbutanol (Trung Quốc), methanol (Merck), quercetin (HPLC ≥ 95%); amoxicillin (Công ty Cổ phần Dược phẩm DOMESCO), môi trường Luria-Bertani (LB), chủng vi khuẩn Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococus aureus; DPPH (Sigma Co Ldt, US), acid ascorbic (Sigma Co Ldt, US), môi trường RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute1640), MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromide), trypsin, penicillin, huyết bò FBS (fetal bovine serum) Bình chiết ngấm kiệt, bình lắng gạn, silica gel F254 tráng sẵn nhôm (Merck, Art 1,05554), đĩa petri, bình Roux, đĩa ni cấy 96 giếng dụng cụ, hóa chất khác Sơ thành phần hóa thực vật Các dịch chiết từ bột hạt Trâm mốc kiểm tra diện alkaloid, flavonoid, tannin, triterpenoid, saponin, coumarin, anthraquinon, anthocyanosid, proanthocyanidin, 270 Phƣơng pháp chiết xuất cao chiết Cao toàn phần hòa tan nước cất chiết lỏng-lỏng với diethyl ether, chloroform, ethyl acetat n-butanol thu phân đoạn cao chiết diethyl ether (Cao E), cao chloroform (Cao C), cao ethyl acetat (Cao A), cao n-butanol (Cao B) v| cao nước (Cao N) Khảo sát độ tinh khiết Khảo s{t độ tinh khiết dược liệu cao chiết dựa tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV (DĐVN V) gồm tiêu khối lượng l|m khơ (độ ẩm), độ tro tồn phần, độ tro không tan HCl Thực lần mẫu, lấy giá trị trung bình mẫu tính tốn(4) Phƣơng pháp định tính nhóm hợp chất Định tính diện nhóm hợp chất flavonoid mẫu nguyên liệu cao chiết toàn phần từ hạt trâm mốc phản ứng hóa học với thuốc thử đặc trưng (NaOH 10%, FeCl3 5%, Cyanidin, Pb(CH3COO)2 10%) v| định tính quercetin phương ph{p sắc ký lớp mỏng Phƣơng pháp định lƣợng flavonoid toàn phần X{c định h|m lượng flavonoid toàn phần bột nguyên liệu cao chiết toàn phần từ hạt trâm mốc phương ph{p UV-Vis theo chuẩn quercetin Hỗn hợp phản ứng gồm ml dịch chiết (từ ph}n đoạn ethyl acetat), ml methanol ml AlCl3 2%, lắc Sau 10 phút, Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 tiến hành đo độ hấp thu bước sóng 454 nm Sử dụng methanol làm mẫu trắng Thực lần mẫu, lấy giá trị trung bình mẫu tính tốn(10) Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết Ba chủng vi khuẩn thử nghiệm (E coli, P aeruginosa, S aureus) cấy lên môi trường Mueller-Hinton Trải vi khuẩn hoạt hóa thạch với mật độ khoảng 1×106 – 2×106 CFU/ml Dùng dụng cụ đục lỗ thạch có đường kính mm Cho vào lỗ 0,1 ml dịch thử nghiệm nồng độ khác Ủ đĩa thạch 37°C 24 Thực lặp lại lần nồng độ, đo đường kính vịng vơ khuẩn (nếu có) nồng độ, lấy giá trị trung bình tính tốn Chứng dương chứng âm sử dụng amoxicillin nước cất vơ trùng Cơng thức tính đường kính vịng vơ khuẩn (ĐKV): ĐKV = (ĐKVmẫu thử – ĐKVgiếng) – (ĐKVchứng âm – ĐKVgiếng) (mm)(7) Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa Khả kh{ng oxy hóa mẫu thử thực theo phương ph{p DPPH (1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl) mơ tả Alhakmani có sửa đổi sau(1): Hỗn hợp phản ứng methanol bao gồm 0,5 ml mẫu thử nồng độ khác phản ứng với đồng lượng dung dịch DPPH 0,6 mM pha methanol Thêm methanol vừa đủ ml Hỗn hợp phản ứng ủ 30 phút nhiệt độ phòng tối Tiến h|nh đo độ hấp thu quang phổ bước sóng 515 nm Sử dụng mẫu trắng methanol Acid ascorbic (vitamin C) sử dụng làm mẫu đối chứng dương Thực lần mẫu, lấy giá trị trung bình mẫu tính tốn Hoạt tính kháng oxy hóa (HTKO%) tính theo cơng thức: Nghiên cứu Y học ODc l| độ hấp thụ mẫu chứng âm (dung dịch DPPH 0,6 mM) ODt l| độ hấp thụ mẫu có chứa chất thử X{c định giá trị IC50 để đ{nh gi{ khả kháng oxy hóa DPPH mẫu thử Ni cấy tế bào Các dịng tế b|o ung thư mua từ ATCC (Mỹ) Tế b|o nuôi môi trường DMEM RPMI 1640 có bổ sung L-glutamin (200 mM), HEPES (1 M), 1% (v/v) penicillin– streptomycin, 10% (v/v) FBS ủ 37oC, 5% CO2 Phƣơng pháp MTT Tế b|o nuôi đĩa 96 giếng mật độ thích hợp Sau ủ 24 giờ, tế b|o xử lý với thuốc hai nồng độ 300 µg/ml 100 µg/ml 48 Trước kết thúc thử nghiệm giờ, hút bỏ môi trường nuôi cũ cho mơi trường có chứa 10% MTT vào giếng Tiếp tục ủ 37°C kết thúc Tinh thể formazan tạo th|nh hòa tan DMSO v| sau đ{nh gi{ phương ph{p đo mật độ quang OD bước sóng 570 nm 630 nm, phản ánh số lượng tế bào sống dịch nuôi cấy Thực lần mẫu, lấy giá trị trung bình mẫu tính tốn(3) Hoạt tính ức chế (I%) mẫu thử tính theo cơng thức: Trong đó: ODc l| độ hấp thụ mẫu không chứa chất thử; ODt l| độ hấp thụ mẫu có chứa chất thử Phƣơng pháp đánh giá kết Các số liệu biểu thị trị số trung bình: Mean ± SEM Mean ± SD v| xử lý phần mềm MS Excel 2013, xử lý thống kê dựa vào phép kiểm t – test KẾT QUẢ Sơ thành phần hóa thực vật Trong đó: Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Kết phân tích thành phần hóa thực vật hạt Trâm mốc thể Bảng Trong 271 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học hạt Trâm mốc có diện alkaloid, flavonoid, tannin, triterpenoid, saponin, coumarin, anthraquinon, chất béo, tinh dầu, acid hữu chất khử Bảng Thành phần hóa thực vật hạt trâm mốc Nhóm hợp chất Alkaloid Flavonoid Tannin Triterpenoid Saponin Coumarin Anthraquinon Hạt trâm mốc ++++ +++ +++ + + ++ + Nhóm hợp chất Proanthocyanidin Anthocyanosid Chất béo Tinh dầu Carotenoids Các acid hữu Chất khử Hạt trâm mốc +++ +++ ++ ++ (-): khơng có, (±): nghi ngờ, (+): có ít, (++): có, (+++): có nhiều, (++++): có nhiều Kiểm nghiệm nguyên liệu hiệu suất thu cao ethanol toàn phần Hiệu suất thu cao chiết toàn phần trừ độ ẩm đạt 28,62% Trong đó, độ ẩm bột dược liệu (11,04±0,18%) cao chiết (15,23±0,18%) đạt tiêu chuẩn DĐVN V (độ ẩm dược liệu Cao B > Cao T > Cao N > Cao C Nhìn chung, c{c cao chiết từ hạt tr}m mốc có gi{ trị IC50 thấp, thể tác dụng kháng oxy hóa cao theo chế dập tắt gốc tự DPPH Hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thƣ cao chiết Hoạt tính ức chế tăng trưởng dịng tế bào ung thư gan người Hep-G2 Kết thu nhận sau 48 xử lý tế b|o ung thư Hep-G2 với cao chiết từ hạt trâm mốc thể Hình Ở nồng độ 100 µg/ml (Hình 2A), cao E cao 273 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 A thể hiệu ức chế khoảng 65% 50% tăng trưởng tế bào Hep-G2 so với chứng dương camptothecin l| 27,7±2,2%, c{c cao TP, cao C, cao B cao N khơng thể hoạt tính ức chế thể ức chế không đ{ng kể Ở nồng độ 300 µg/ml (Hình 2B), hầu hết cao chiết từ hạt Trâm mốc thể hiệu ức chế tăng trưởng cao so với xử lý nồng độ 100 µg/ml (trừ cao B cao N), với phần trăm ức chế cao E đạt 85,2 ± 1,1% cao A đạt 69,1 ± 0,8% Hình Phần trăm ức chế tăng trưởng tế bào ung thư Hep-G2 sau 48 xử lý với cao chiết từ hạt trâm mốc nồng độ (A) 100 µg/ml (B) 300 µg/ml N thể ức chế không đ{ng kể (lần lượt Hoạt tính ức chế tăng trưởng dịng tế bào ung 26,5%, 12,6% 4,7%) thư vú người MCF-7 Kết thu nhận sau 48 xử lý tế b|o ung thư MCF-7 với cao chiết từ hạt Trâm mốc thể Hình Tương tự dòng tế bào Hep-G2, nồng độ 100 µg/ml (Hình 3A), cao E cao A thể hiệu ức chế cao, với phần trăm ức chế 78,7 ± 2,2% 75,8 ± 3,5%, tỷ lệ ức chế chứng dương camptothecin l| 24,5 ± 2,2%, cao TP ức chế cao C, cao B cao 274 Khi tế bào MCF-7 xử lý cao chiết từ hạt Trâm mốc nồng độ 300 µg/ml (Hình 3B), ngoại trừ cao E có tỷ lệ ức chế tăng trưởng giảm từ 78,7% xuống 63,3% cao B giảm từ 12,6% xuống 7,8%, cao chiết cịn lại thể hoạt tính ức chế tăng mạnh, cụ thể phần trăm ức chế cao TP tăng đến 46,9%; cao C tăng từ 26,5% tới 62,9%; cao A từ 75,8% tới 81,7% cao N tăng từ 4,7% đến 50,1% Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Hình Phần trăm ức chế tăng trưởng tế bào ung thư MCF-7 sau 48 xử lý với cao chiết từ hạt trâm mốc nồng độ (A) 100 µg/ml (B) 300 µg/ml aureus tạo vịng vơ khuẩn rõ cao ethyl BÀN LUẬN acetat tạo vòng kháng khuẩn lớn c{c cao Nghiên cứu cho thấy hạt Trâm mốc có chứa chiết khác, nồng độ 20 mg/ml l| 25,33 mm đối nhóm hợp chất alkaloid, flavonoid, với E coli v| 21,33 mm S aureus, tannin, triterpenoid, saponin, coumarin, kh{ng sinh amoxicillin tạo vòng kh{ng anthraquinon, chất béo, tinh dầu, acid hữu khuẩn rõ rệt ba chủng khảo s{t nồng v| chất khử Các chứng thực nghiệm độ mg/ml Trong thực nghiệm khảo s{t hoạt cho thấy flavonoid (bioflavonoid) thuộc nhóm tính kh{ng oxy hóa theo chế dập tắt gốc tự polyphenol có c{c t{c động sinh học đa hướng DPPH, gi{ trị IC50 cao toàn phần, cao diethyl kh{ng khuẩn, kháng viêm, kháng dị ứng, ether, cao chloroform, cao ethyl acetat, cao nkh{ng ung thư, kh{ng oxy hóa v| chống đ{i butanol v| cao nước từ hạt Trâm mốc th{o đường(9) C{c t{c động nhìn chung liên 9,28 µg/ml, 3,85 µg/ml, 35,54 µg/ml, 3,77 µg/ml, quan đến hoạt động thu hẹp gốc tự 5,93 µg/ml 13,51 µg/ml Trong đó, IC50 flavonoid Bên cạnh đó, cấu trúc catechol acid ascorbic 4,37 µg/ml Cao ethyl acetat có mặt nhóm chức khơng bão hịa cao diethyl ether có hoạt tính kh{ng oxy hóa cao vịng góp phần vào hoạt động so với acid ascorbic, sản phẩm thương chúng Flavonoid có khả liên kết với mại chứng minh có hoạt tính kh{ng oxy ion kim loại chuyển tiếp, ngăn ngừa hình hóa Bên cạnh đó, kết thực nghiệm ức chế thành gốc hydroxyl gốc tự tăng trưởng tế b|o ung thư cho thấy cao liên quan đến kim loại xúc tác từ H2O2(9,11) ethyl acetat v| cao diethyl ether thể tỷ lệ ức Quercetin flavonol, chế 50% hai nồng độ khảo s{t Cao to|n flavonoid phổ biến, l|m khung sườn cho nhiều phần, cao chloroform, cao n-butanol v| cao nước loại flavonoid kh{c rutin, quercitrin, thể hoạt tính kháng oxy hóa, ức chế tế troxerutin, isoquercitrin số flavonoid b|o ung thư kh{c, sử dụng l| chất chuẩn dùng KẾT LUẬN để định tính, định lượng flavonoid tồn phần nhiều nghiên cứu(5) Kết nghiên cứu cho thấy cao chiết từ hạt Trâm mốc có hoạt tính kháng khuẩn Kết nghiên cứu cho thấy cao ethanol Escherichia coli, Staphylococcus aureus Các cao to|n phần, cao ethyl acetat, cao n-butanol cao chiết thể hoạt tính kháng oxy hóa theo nước có hoạt tính kh{ng chủng E coli S Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 275 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 chế đ{nh bắt gốc tự DPPH, ức chế tăng sinh tế bào ung thư Hep-G2 MCF-7 Trong đó, cao ph}n đoạn diethyl ether ethyl acetat thể hoạt tính tốt Vì vậy, cần có thêm nghiên cứu s}u thành phần hóa học hoạt tính sinh học hạt Trâm mốc để cung cấp sở khoa học nhằm khai thác ứng dụng dược liệu công t{c chăm sóc sức khỏe cộng đồng 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO Alhakmani F, Kumar S & Khan SA (2013) “Estimation of total phenolic content, in-vitro antioxidant and anti-inflammatory activity of flowers of Moringa oleifera Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 3(8):623-627 Ayyanar M & Subash-Babu P (2012) “Syzygium cumini (L.) Skeels: A review of its phytochemical constituents and traditional uses” Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2(3):240-246 Barh D & Viswanathan G (2008) “Syzygium cumini inhibits growth and induces apoptosis in cervical cancer cell lines: a primary study” Ecancermedicalscience, 2:83 Bộ Y tế (2009) Dược điển Việt Nam Nhà xuất Y học Hà Nội, lần xuất thứ tư Da Silva LAL, Pezzini BR & Soares L (2015) “Spectrophotometric determination of the total flavonoid content in Ocimum basilicum L (Lamiaceae) leaves” Pharmacognosy Magazine, 11(41):96-101 276 11 12 13 Kamal A (2014) “Phytochemical screening of Syzygium cumini seeds” Indian Journal of Plant Sciences, 3(4):1-4 Nguyễn Ho|ng Minh, Nguyễn Thị Thu Hương, Dương Thị Mộng Ngọc, Trần Công Luận, La Văn Kính (2013) “Khảo s{t hoạt tính kh{ng khuẩn v| kh{ng viêm cấp công thức phối hợp dược liệu xạ can, bọ mắm v| d}u tằm” Y Học TP Hồ Chí Minh, 17:150-155 Pham-Huy LA, He H & Pham-Huy C (2008) “Free Radicals, Antioxidants in Disease and Health” International Journal of Biomedical Science, 4(2):89-96 Oguntibeju O (2014) “Antioxidant-Antidiabetic Agents and Human Health” InTech, pp.423-430 Shanmugapriya S, Muthusamy P, et al (2017) “Determination of total flavonoid content in ethanolic leaf extract of Moringa Oleifera” World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 6(5):849-852 Shiksharthi AR, Mittal S (2014) “Ficus racemosa: Phytochemistry, traditional uses, and pharmacological properties: A review” International Journal of Recent Advances in Pharmaceutical Research, 4:6-15 Srivastava J, Chandra H, Nautiyal AR, Kalra SJS (2013) “Antimicrobial resistance (AMR) and plant-derived antimicrobials (PDAms) as an alternative drug line to control infections” Biotech, 4:451-460 Trần Hùng cộng sự(2014) “Phương ph{p nghiên cứu dược liệu, Bộ môn Dược liệu” Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Ngày nhận báo: 28/07/2019 Ngày phản biện nhận xét báo: 20/08/2019 Ngày báo đăng: 14/09/2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền