Luận án tiến sĩ nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng kháng ung thư của viên nén nổi chứa curcumin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HUỲNH THỊ MỸ DUYÊN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA VIÊN NÉN NỔI CHỨA CURCUMIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh-Năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HUỲNH THỊ MỸ DUYÊN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA VIÊN NÉN NỔI CHỨA CURCUMIN Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm bào chế thuốc Mã số: 62720402 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS HUỲNH VĂN HÓA PGS TS VĨNH ĐỊNH Thành phố Hồ Chí Minh-Năm 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2017 Tác giả Huỳnh Thị Mỹ Duyên ii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan i Mục lục ii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt iv Danh mục bảng vi Danh mục hình ix Danh mục biểu đồ xi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN 1.2 TỔNG QUAN VỀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH-ĐỘ ỔN ĐỊNH VÀ TUỔI THỌ CỦA THUỐC 1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ HỆ PHÂN TÁN RẮN (HPTR) ĐỂ CẢI THIỆN ĐỘ HÒA TAN CỦA CURCUMIN .9 1.4 TỔNG QUAN VỀ DẠNG THUỐC NỔI TRONG DẠ DÀY .15 1.5 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ DẠ DÀY-CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH TẾ BÀO VÀ MƠ HÌNH GÂY UNG THƯ DẠ DÀY TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG .20 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .31 2.1 VẬT LIỆU 31 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 59 3.1 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CURCUMIN TRONG HPTR BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV-Vis VÀ TRONG VIÊN NÉN NỔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC 59 3.2 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HPTR CHỨA CURCUMIN CĨ ĐỘ HỊA TAN CAO BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP VÀ CHẤT MANG KHÁC NHAU 69 iii 3.3 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VIÊN NÉN NỔI CHỨA HỆ PHÂN TÁN RẮN CURCUMIN 100 MG 78 3.4 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ DẠ DÀY CỦA THÀNH PHẦN CÔNG THỨC VIÊN NÉN NỔI CHỨA HPTR CURCUMIN 100 MG TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ Ở NGƯỜI (IN VITRO) VÀ TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (IN VIVO) 92 CHƯƠNG BÀN LUẬN .100 4.1 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CURCUMIN TRONG HPTR BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV-Vis VÀ TRONG VIÊN NÉN NỔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC 100 4.2 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ PHÂN TÁN RẮN CHỨA CURCUMIN CĨ ĐỘ HỊA TAN CAO BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP VÀ CHẤT MANG KHÁC NHAU 105 4.3 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VIÊN NÉN NỔI CHỨA HỆ PHÂN TÁN RẮN CURCUMIN 100 MG 110 4.4 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ DẠ DÀY CỦA THÀNH PHẦN CÔNG THỨC VIÊN NÉN NỔI CHỨA HPTR CURCUMIN 100 MG TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ Ở NGƯỜI (IN VITRO) VÀ TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (IN VIVO) 117 KẾT LUẬN 125 KIẾN NGHỊ 127 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Stt Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt 5-FU 5-fluorouracil ACN Acetonitril ASEAN Association of Southeast Asian Nations B(a)P Benzo(a)pyren CD Cyclodextrin Cur Curcumin DAD Diode array detector DM DMBA 7,12 dimethyl benzanthracene 10 DMSO Dimethyl sulfoxide 11 DSC Differential Thermal Analysis Phân tích nhiệt vi sai 12 HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao 13 HPMC Hydropropyl methylcellulose 14 HPTR 15 IC50 The half maximal inhibitory concentration Nồng độ tối thiểu ức chế 50% sinh vật thử nghiệm 16 ICH International Conference on Harmonization Hội nghị quốc tế hài hòa 17 IR Infrared Hồng ngoại 18 MeOH Methanol 19 mtb 20 MTT 21 N Hiệp hội quốc gia Đơng Nam Á Đầu dị dãy diod quang Phương pháp dung môi Hệ phân tán rắn Khối lượng trung bình 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromid) Phương pháp nghiền v Stt Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt 22 PEG Polyethylenglycol 23 PVP Polyvinylpyrrolidon 24 RH Relative humidity Độ ẩm tương đối 25 RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối 26 SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn 27 SEM Scanning Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử quét 28 UTDD 29 UV-Vis 30 VL Phương pháp vật lý 31 VNN Viên nén Ung thư dày Ultraviolet-Visible Tử ngoại khả kiến vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1 Một số chế phẩm thuôc thị trường .20 Bảng Phân loại mô bệnh học ung thư dày theo Tổ chức Y tế Thế giới năm 2010 21 Bảng Một số nghiên cứu tác dụng curcumin mơ hình gây ung thư khác chuột 30 Bảng Các nguyên liệu sử dụng bào chế 31 Bảng 2 Các nguyên liệu sử dụng phân tích 32 Bảng Các nguyên liệu động vật sử dụng thử in vitro in vivo 32 Bảng Các trang thiết bị sử dụng đề tài 33 Bảng Các điều kiện thăm dò .37 Bảng Các công thức bào chế HPTR hỗn hợp trộn vật lý .41 Bảng Thành phần công thức viên placebo .45 Bảng Thành phần cơng thức thăm dị tá dược tạo khung 46 Bảng Điều kiện tần số thử nghiệm nghiên cứu độ ổn định 50 Bảng 10 Các tiêu đánh giá, mức chất lượng số lượng viên nén curcumin 100 mg dùng nghiên cứu độ ổn định .51 Bảng 11 Nồng độ thử nghiệm 54 Bảng Sai lệch độ hấp thu hệ tá dược so với mẫu giả định 59 Bảng Sự tuyến tính độ hấp thu theo nồng định lượng 61 Bảng 3 Kết khảo sát độ xác phương pháp định lượng HPTR curcumin với hệ chất mang PVP K30+Tween 80 62 Bảng Kết thử độ phương pháp định lượng HPTR curcumin 62 Bảng Giá trị trung bình thông số sắc ký mẫu chuẩn curcumin pha động khảo sát (n=6) 63 vii Bảng Tính tương thích hệ thống mẫu chuẩn curcumin .64 Bảng Tính tương thích hệ thống mẫu thử viên nén chứa HPTR curcumin 64 Bảng Kết khảo sát tính tuyến tính 66 Bảng Kết khảo sát độ 67 Bảng 10 Khảo sát độ lặp lại phương pháp 68 Bảng 11 Kết khảo sát độ xác trung gian .68 Bảng 12 Độ hoà tan curcumin nguyên liệu 69 Bảng 13 Độ hoà tan HPTR curcumin với hệ β-CD Tween 80 70 Bảng 14 Độ hoà tan HPTR curcumin với hệ β-CD PVP K30 70 Bảng 15 Độ hoà tan HPTR curcumin với hệ PEG 6000/PVP K30 (10:90) 71 Bảng 16 Độ hoà tan HPTR curcumin với hệ PEG 6000/PVP K30 (25:75) 71 Bảng 17 Độ hoà tan HPTR curcumin với hệ PEG 6000/HPMC 606 (15:85) 72 Bảng 18 Độ hoà tan HPTR curcumin với hệ PVP K30 Tween 80 72 Bảng 19 Độ hoà tan curcumin từ HPTR với hệ chất mang 73 Bảng 20 So sánh độ hoà tan cặp 74 Bảng 21 Độ lặp lại q trình hồ tan HPTR curcumin với hệ chất mang PVP K30 Tween 80 bào chế phương pháp nghiền ướt-công thức 74 Bảng 22 Kết khảo sát hàm lượng tá dược dính 79 Bảng 23 Kết khảo sát tỉ lệ dung môi xát hạt 79 Bảng 24 Kết ảnh hưởng loại tá dược tạo khí đến khả viên 80 Bảng 25 Kết đánh giá khả viên thay đổi tỉ lệ NaHCO3 acid citric 80 Bảng 26 Kết đánh giá sử dụng gôm xanthan đến khả viên 81 Bảng 27 Kết đánh giá sử dụng HPMC K4M đến khả viên 81 Bảng 28 Kết đánh giá sử dụng HPMC K15M đến khả viên 82 viii Bảng 29 Kết đánh giá sử dụng HPMC 615 đến khả viên 82 Bảng 30 Kết đánh giá khả viên phối hợp polyme .83 Bảng 31 Kết ảnh hưởng độ cứng đến khả viên 84 Bảng 32 Mơ hình công thức xây dựng phần mềm Design-Expert .85 Bảng 33 Kết thực nghiệm .85 Bảng 34 Thành phần công thức tối ưu .86 Bảng 35 Kết thực nghiệm lơ kiểm chứng kết dự đốn 86 Bảng 36 Độ hòa tan từ viên nén chứa HPTR curcumin:PVP:Tween (1:4: 0,22) viên nén chứa curcumin nguyên liệu 87 Bảng 37 Kết kiểm nghiệm 03 lô 88 Bảng 38 Kết thử nghiệm độ ổn định lơ điều kiện lão hóa cấp tốc thời điểm tháng .90 Bảng 39 Kết thử nghiệm độ ổn định lô điều kiện thử nghiệm dài hạn thời điểm 24 tháng 91 Bảng 40 Tác dụng mẫu thử lên tỷ lệ sống tế bào ung thư dày N87 92 Bảng 41 Tỷ lệ % ức chế phát triển tế bào ung thư mẫu thử 93 Bảng 42 Phương trình hồi quy giá trị IC50 mẫu thử 93 Bảng 43 Số chuột chết lô thử nghiệm 95 Bảng 44 Tỷ lệ chuột mang u ngồi da lơ từ tuần đến tuần 24 96 Bảng 45 Chỉ số mỡ chuột lô từ tuần đến tuần 24 .97 Bảng 46 So sánh kết đại thể lô từ tuần đến tuần 24 .97 Bảng 47 So sánh kết vi thể lô tuần đến tuần 24 99 PL-36 PL-6 Khối lượng chuột trung bình lô từ tuần đến tuần 24 Lô 3a 3b 5a 5b 6a 6b 33,4±3 34,4±1,1 35,9±1 32,3±1,8 35±1,1 32,3±1,3 32,8±2 33,3±0,8 31,8±2 34,1±3,4 35,3±1 35,8±0,9 32,4±1,4 34,8±1 30,9±1,1 32,6±2,2 33,1±0,8 31,1±1,8 35,3±3,1 34,9±1,1 35±1,4 35±1,7 32,3±1,2 32,7±2,3 34,6±1,1 30,9±1,5 36,1±3,4 34,7±1,3 34,4±1,8 33,9±1,2 34,8±1,9 32,9±1,1 32,8±2,8 35,0±1,3 33,2±1,6 39,4±2,9 36,8±2,3 36,2±2,2 35,9±1,9 35,9±1,4 34,2±0,8 34,9±1,6 33,5±1,6 32,5±1,4* 39,7±2,7 31,4±1,7* 32,6±2,3* 32,4±2* 33,3±0,6* 31,9±0,8* 33±1,6* 32,8±1,7* 32,7±1,4* 39,6±2,8 31,9±1,3* 30,4±2,3* 31,6±2* 31,5±1,6* 31,7±1,9* 32,1±1.6* 32,7±1,7* 33,6±1,3* 39,8±2,8 31,7±1,1* 30,5±2,3* 32,6±1.9* 31,6±0,6* 31,3±0,8* 33,9±1,6* 32,3±1,7* 33,9±1,3* 39,9±2,8 31,9±1,1* 30,5±2,2* 33,5±1,9* 31,8±0,8* 31,9±1,6* 34,2±0,8* 32,4±1,6* 34,1±1,4* 10 40,4±2,8 32,5±0,9* 30,4±2,2* 34,4±2* 34,4±0,9* 32,8±1,6* 35±1,4* 11 41,6±2,8 32,8±0,9* 34,2±1,8* 36,1±1,6* 33,9±0,4* 32,8±1,6* 35,6±0,8* 33,8±1,6* 36,1±2,1* 12 43,9±3,2 34,8±1,2* 38,1±1,8* 39,5±1,5 35.9±1,6* 35,2±1,6* 39,2±1,1 38±1,3* 13 44,8±3,6 36,7±1,2* 42,0±1,8 41,3±1,6 36,8±1,8* 38,9±1,1* 40,9±1,6 40,9±1,1 41,2±2,8 14 48,1±4,3 39,9±1,3* 44,4±1,7 41,4±1,8 38,7±1,9* 42,1±1,0* 43,9±1,2 43,9±1,8 44,5±3,0 15 47,8±4,4 37,9±1,2* 45,5±1,7 43,2±2,0 39,6±1,8* 43,9±1,2 44,6±1,3 43,0±1,8 45,6±3,1 16 46,7±4,1 38,7±1,4* 44,9±1,7 42,7±1,8 40,1±0,9* 44,8±1,5 44,2±1,1 44,4±2,2 43,8±4,1 17 46,7±3,9 39,7±1,4* 42,8±1,9 43,4±2,2 41,9±1,0* 43,6±1,5 43,4±1,1 43,9±2,4 42,9±4,1 18 46,6±4,3 39,5±1,3* 41,9±1,8 42,9±1,6 39±1,1* 42,9±0,8 42,8±1,1 44,8±2,2 42,7±1,4 19 47,1±4,7 37,2±1,4* 42,5±1,9 42,8±2,5 34,5±1,4* 43,8±1,1 43,9±1,2 43,9±1,8 43,9±2,7 42,9±0,9 42,4±1,3 43,6±1,7 45,6±3,2 32,9±1,4* 43,1±0,9 43,9±1,1 44,8±1,7 44,8±1,8 Tuần * 33,5±1,3 42,4±1,9 42,8±3,3 32,1±0,5* 31,9±1,6* 20 46,3±3,7 35,2±1,5 21 47,1±4,6 34,6±1,6* 43±1,3 22 45,5±3,8 34,5±0,8* 39,8±1,4 42,5±3,2 32,4±1,3* 42,7±1 41,9±1,2 43,6±1,4 43,2±1,6 23 45,7±3,9 34,8±0,7* 39,9±1,4 41,7±3,2 34,3±1,6* 41,5±1,1 42,7±2,0 39.5±1,4 42,9±2,0 24 43,5±2,6 37,9±0,9* 37,8±1,5 39,8±3,2 37,6±1,8* 40,6±1 39,5±2,6 40,5±1,5 41,7±1,7 42,4±3,2 32,1±1,4 * 40,8±2,8 * p < 0,05 so sánh lô thử lô sinh lý PL-37 PL-6 Kết số khối u dày kích thước khối u dày lô từ tuần đến tuần 24 Số khối u Kích thước khối u phổi (mm3) Lơ khơng có khối u Kích thước trung bình (mm3) Lơ Con 2,5 2,5 Con 11,7 10,8 7,8 5,97 Con 6,63 5,91 6,83 7,67 Con 6,73 7,79 7,29 Con 5,79 8,62 Con 9,87 8,61 5,43 7,82 7,92 7,93 Con 2,23 6,89 3,34 4,47 4,22 4,23 Con 10 Lô 3a Con Con Con Con Con Con Con Con Lô 3b Con Con Con Con Con Con Con Con Con 10 2,14 8,72 5,43 1,29 1,43 1,29 1,15 2,21 2,35 Khơng có khối u 1,46 1,09 1,12 1,01 1,02 1,78 1,36 1,22 2,21 2,35 1,28 1,12 1,27 1,07 1,05 Khơng có khối u 1,23 0,95 Khơng có khối u 1,8 1,23 1,31 1,69 1,16 1,03 0,83 1,06 1,09 1,8 1,23 1,31 1,69 1,01 3,63 1,25 6,86 6,76 7,27 7,21 PL-38 Lô Con Con Con Con Con Con Con Con Con 10 Lô 5a Con Con Con Con Con Con Con Con Con Con 10 Lô 5b Con Con Con Con Con Con Con Con 10 Lô 6a Con Con Con Con Con Con 7,79 8,93 7,31 4,01 3,19 5,31 7,26 5,57 7,64 6,87 Khơng có khối u 4,98 7,73 6,31 3,79 3,91 4,27 4,56 7,53 8,63 8,38 5,97 3,27 6,13 6,86 7,07 5,78 6,5 6,17 6,28 5,71 6,84 7,26 6,36 5,74 4,09 1,65 1,17 1,79 Khơng có khối u Khơng có khối u 0,96 1,17 1,19 1,22 0,16 Khơng có khối u 1,27 1,19 1,41 1,79 0 0,96 1,18 1,22 0,16 1,23 1,25 0,89 0,97 1,15 1,16 Khơng có khối u 1,15 0,87 Khơng có khối u Khơng có khối u 1,07 0,97 1,15 1,16 1,01 0 1,02 1,28 1,27 1,21 Khơng có khối u Khơng có khối u 1,13 1,31 1,15 1,24 0 1,13 1,31 PL-39 Con Con Con Con 10 Lô 6b Con Con Con Con Con Con Con 10 1,22 1,10 0,56 0,74 1,22 1,07 0,56 0,74 1,04 Khơng có khối u Khơng có khối u Khơng có khối u 0,67 1,03 0,84 1,39 0,99 0 0,67 1,03 0,84 1,19 PL-6 Kết phân tích vi thể từ tuần đến tuần 24 Tổn thường Lơ Con Ung thư Bình thường khơng ung thư 3a Bình thường 5 10 Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Ung thư Ung thư Ung thư Viêm mạn Ung thư Ung thư Ung thư Viêm mạn Bình thường Viêm mạn Bình thường Ung thư Bình thường Ung thư Ung thư Bình thường PL-40 3b 5a 5b 6a 10 10 10 10 Bình thường Bình thường Viêm mạn Bình thường Ung thư Ung thư Bình thường Bình thường Ung thư Ung thư Ung thư Ung thư Ung thư Ung thư Bình thường Viêm mạn Ung thư Ung thư Ung thư Bình thường Bình thường Bình thường Viêm mạn Viêm mạn Ung thư Ung thư Bình thường Viêm mạn Ung thư Bình thường Viêm mạn Bình thường Bình thường Viêm mạn Viêm mạn Bình thường Ung thư Ung thư Bình thường PL-41 6b 10 10 Bình thường Viêm mạn Bình thường Ung thư Viêm mạn Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Viêm mạn Bình thường Bình thường Ung thư PL-6 Hình ảnh đại thể đại diện lô Lô Lô Lô 3a Lô Lơ 5a Lơ 6a PL-42 PL-6 Hình ảnh vi thể chuột Lô Con (ung thư) Con (ung thư) Con (ung thư) Con (ung thư) Con (ung thư) Con 10 (viêm mạn) Con (ung thư) Con (viêm mạn) CHẾT CHẾT Con (chết) Con (chết) PL-43 Lô 3a CHẾT Con (chết) Con (bình thường) Con (viêm mạn) Con (bình thường) Con (ung thư) Con (bình thường) Con (ung thư) Con (ung thư) CHẾT Con (bình thường) Con 10 (chết) PL-44 Lơ 3b CHẾT Con (bình thường) Con (chết) Con (bình thường) Con (viêm mạn) Con (bình thường) Con (ung thư) Con (ung thư) Con (bình thường) Con (bình thường) Con 10 (ung thư) PL-45 Lô CHẾT Con (ung thư) Con (ung thư) Con (chết) Con (ung thư) Con (ung thư) Con (ung thư) Con (bình thường) Con (viêm mạn) Con (ung thư) Con 10 (ung thư) PL-46 Lô 5a Con (ung thư) Con (bình thường) Con (bình thường) Con (bình thường) Con (viêm mạn) Con (viêm mạn) Con (ung thư) Con (ung thư) Con (bình thường) Con 10 (viêm mạn) PL-47 Lơ 5b CHẾT CHẾT Con (ung thư) Con (chết) Con (bình thường) Con (chết) Con (viêm mạn) Con (bình thường) Con (bình thường) Con (viêm mạn) Con (viêm mạn) Con 10 (bình thường) PL-48 Lô 6a Con (ung thư) Con (ung thư) Con (bình thường) Con (bình thường) Con (viêm mạn) Con (bình thường) Con (ung thư) Con (viêm mạn) Con (bình thường) Con 10 (bình thường) PL-49 Lơ 6b CHẾT Con (bình thường) Con (bình thường) CHẾT CHẾT Con (chết) Con (chết) Con (bình thường) Con 10 (ung thư) Con (chết) Con (bình thường) Con (viêm mạn) Con (bình thường) PL-50 PL-6 Phiếu trả kết phân tích vi phẫu chuột