Sản xuất thử nghiệm một số cao dược liệu phục vụ công nghiệp dược

UBND TP HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ UBND TP HỒ CHÍ MINH TT NC & SX DƯỢC LIỆU MIỀN TRUNG BÁO CÁO NGHIỆM THU DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM MỘT SỐ CAO DƯỢC LIỆU PHỤC VỤ CƠNG NGHIỆP DƯỢC PHẦN II BÁO CÁO TỒN VĂN TP HỒ CHÍ MINH, 2011 UBND TP HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ UBND TP HỒ CHÍ MINH TT NC & SX DƯỢC LIỆU MIỀN TRUNG BÁO CÁO NGHIỆM THU (ðã chỉnh sửa theo góp ý Hội ñồng nghiệm thu) DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM MỘT SỐ CAO DƯỢC LIỆU PHỤC VỤ CÔNG NGHIỆP DƯỢC PHẦN II BÁO CÁO TOÀN VĂN CHỦ NHIỆM ðỀ TÀI PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẠNH CƠ QUAN QUẢN LÝ KS LÊ THỊ TUYẾT ANH CƠ QUAN CHỦ TRÌ TP HỒ CHÍ MINH, 2011 TÓM TẮT KẾT QUẢ THỰC HIỆN DỰ ÁN Hiện nay, thuốc Diệp hạ châu (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.), Giá ñậu nành (Glycin max.), Bạch tật lê (Tribulus terrestris L.), Khổ qua (Momordica charantia L.), Xuyên tâm liên (Andrographolis paniculata Burm F Nees) Gừng (Zingiber officinal Rosc.) cơng ty dược phẩm nước thu mua chế biến thành loại cao sản xuất nhiều dạng chế phẩm khác ORTENZIO, BRONZONI (Công ty Cổ phần Sản xuất Thương mại dược phẩm ðông Nam), TÂY SA, SAVIGOLD (Công ty SAVIPHARM), Thanh huyết kháng viêm (Công ty Khang Minh), BẢO XUÂN, HAMEGA (Công ty TNHH Nam Dược), Diệp hạ Châu, VG-5 (Công ty Cổ phần Dược DANAPHA)… Các dược liệu ñã ñược Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Dược liệu miền Trung phối hợp với Viện Công nghệ Hóa học nghiên cứu cơng bố số cơng trình chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc phịng thí nghiệm đầu tư cơng nghệ để chiết xuất pilot cung cấp với số lượng nhỏ cho Công ty Trong nhu cầu sản xuất dược liệu nói lớn nên địi hỏi phải có nghiên cứu hồn thiện cơng nghệ chiết xuất phương pháp kiểm nghiệm, ñánh giá chất lượng ñể ñưa thị trường sản phẩm ñạt chất lượng theo yêu cầu Bộ Y tế Mục tiêu Dự án hồn thiện cơng nghệ sản xuất loại cao sấy phun: Bạch tật lê, Diệp hạ châu, Giá ñậu nành, Khổ qua, Xuyên tâm liên Gừng (Nhật bản); phân lập chất ñánh dấu (marker); xây dựng tiêu chuẩn sở cho loại bột sấy phun chất ñánh dấu dược liệu Xuất xứ Dự án kế thừa kết ñề tài nghiên cứu cấp Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam Bộ Y tế từ năm 2000 – 2008 Dự án ñã ñạt ñược kết sau: ðã xác ñịnh nguồn nguyên liệu ñang trồng ñại trà (theo tiêu chuẩn ViệtGAP) Trung tâm nghiên cứu Sản xuất dược liệu miền Trung vi phẫu soi bột Bạch tật lê, Diệp hạ châu, Giá ñậu nành, Khổ qua, Xuyên tâm liên Gừng ðã khảo sát điều kiện chiết xuất quy mơ phịng thí nghiệm Riêng với Gừng, khảo sát thêm ñiều ñể chiết xuất tinh dầu theo phương pháp lôi nước ðã phân lập chất ñánh dấu (marker) dạng tinh khiết phương pháp chiết lỏng – lỏng, chiết pha rắn, sắc ký cột pha thường, sắc ký cột pha ñão, phương pháp kết tinh Bạch tật lê, Diệp hạ châu, Giá ðậu nành, Khổ qua, Xuyên tâm liên sau: Tribulosin (100 mg), Phyllanthin (100 mg), Hypophyllanthin (100 mg), Niranthin (100 mg), Genistein (100 mg), Charantin (100 mg) Andrographolid (100 mg) Tất chất tinh khiết phân lập ñược ñều ñược xác ñịnh phương pháp phổ ñại NMR, IR, MS xác ñịnh ñộ tinh khiết chất ñánh dấu HPLC Khảo sát ñiều kiện chiết xuất tối ưu quy mô 100 - 200 kg/mẻ thiết bị có Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Dược liệu miền Trung, huyện ðơng Hịa, tỉnh Phú n ðã khảo sát ñiều kiện sấy phun với ñiều kiện 10 lít nước/giờ như: nhiệt độ, tỷ lệ phụ gia, lưu lượng, hàm lượng dịch rắn dịch sấy phun… ðã xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm bột sấy phun, xác ñịnh tiêu chuẩn: hàm ẩm, độ tan, kích cỡ hạt, hàm lượng kim loại nặng, vi sinh, hàm lượng chất bảo vệ thực vật, hàm lượng chất ñánh dấu… ðã xây dựng tiêu chuẩn chất ñánh dấu (marker) Tribulosin, Phyllanthin, Hypophyllanthin, Niranthin, Genistein, Charantin Andrographolid như: cảm quan, ñộ tinh sạch, độ tan, điểm nóng chảy, đặc điểm phổ NMR, MS ðã sản xuất loại cao sấy phun với số lượng sau: Bạch tật lê (50 kg), Diệp hạ châu (3.490 kg), Giá ñậu nành (2.600 kg), Khổ qua (35 kg), Xuyên tâm liên (200 kg), Gừng Nhật (300 kg), Tinh dầu Gừng (100 kg), Bột sấy phun Gừng (150 kg) Ngồi cịn sản xuất cao ñặc Diệp hạ châu (550 kg) ðã sản xuất chất ñánh dấu dạng tinh kiết > 97 % (HPLC) , loại 200 mg là: Tribulosin, Phyllanthin, Hypophyllathin, Niranthin, Genistein, Charantin Andrographolid Tổng doanh số ñã bán 4.240.925 ñồng (Bốn tỉ hai trăm bốn mươi triệu chín trăm hai mươi lăm ngàn đồng) so với kế hoạch ñã ñăng ký 3.030.000 ñồng (Ba tỉ ba mươi triệu đồng), cho cơng ty dược Công ty cổ phần Dược DANAPHA (ðà Nẵng), Công ty TNHH Nam Dược (Nam ðịnh), Công ty Khang Minh (TP Hồ Chí Minh), Cơng ty ðơng Nam ( TP Hồ Chí Minh) - Dự án góp phần chuyển đổi cấu trồng cho nơng dân sống vùng đất cát ven biển, ven sơng miền Trung Các nông dân trồng Diệp hạ châu, Gừng Nhật Bản, Khổ qua, Xuyên tâm liên… có thu nhập cao ổn định Bình qn thu nhập từ 200 - 250 triệu - ðơn vị thực dự án – Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất dược liệu miền Trung có điều kiện đổi thiết bị sản xuất ñại hơn, suất cao chất lượng ổn ñịnh so với thiết bị cũ, cho phép Trung tâm ñáp ứng ñầy ñủ yêu cầu số lượng chất lượng xí nghiệp dược - Các sản phẩm chất chuẩn Dự án góp phần tiêu chuẩn hố, định lượng ñuợc hoạt chất sản phẩm, nâng cao giá trị sản phẩm, chất lượng dược liệu thuốc sản xuất từ dược liệu Việt Nam Dự án góp phần đào tạo 03 Luận văn Thạc sĩ Hoá học 03 luận văn Thạc sĩ Dược học cơng bố 02 báo đăng Tạp chí Hố học (2009), 01 báo ñăng Tạp chí Y học Thực hành TP HCM (2010) THÔNG TIN CHUNG Tên dự án: SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM MỘT SỐ CAO DƯỢC LIỆU PHỤC VỤ CƠNG NGHIỆP DƯỢC Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Nguyễn Ngọc Hạnh CN Lê Thị Tuyết Anh Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM NC & SX DƯỢC LIỆU MIỀN TRUNG Thời gian thực ñề tài: 24 tháng 10/2008 đến 10/2010 Kinh phí duyệt: 2.500.000.000 ñồng (Hai tỷ năm trăm triệu ñồng) Kinh phí ñã cấp: - ðợt 1: 1.600.000.000 ñồng - ðợt 2: 650.000.000 đồng Mục tiêu: - Hồn thiện cơng nghệ sản xuất loại cao sấy phun Diệp hạ châu, Giá ñậu nành, Bạch tật lê, Khổ qua, Xuyên tâm liên Gừng - Phân lập chất ñánh dấu cho loại dược liệu - Xây dựng tiêu chuẩn sở lọai cao sấy phun - Xây dựng tiêu chuẩn chất ñánh dấu (marker) lọai cao Nội dung thực hiện: - Khảo sát nguyên liệu, xác ñịnh nguồn nguyên liệu thực vật vi phẫu soi bột dược liệu - Khảo sát điều kiện chiết xuất quy mơ phịng thí nghiệm nhiệt độ, thời gian, dung mơi, tỉ lệ dung môi / nguyên liệu … - Cô lập chất ñánh dấu (marker) Phyllanthin, Hypophyllanthin, Niranthin (Diệp hạ châu), Genistein (Giá ñậu nành), Tribulosin (Bạch tật lê), Charanthin (Khổ qua), Andrographolid (Xuyên tâm liên) dạng tinh khiết phương pháp chiết lỏng – lỏng, chiết pha rắn, sắc ký cột pha thường, sắc ký cột pha ñão, phương pháp kết tinh… - Xác ñịnh cấu trúc chất tinh khiết phương pháp phổ ñại UV, IR, Mass, cộng hưởng từ hạt nhân chiều, chiều - Khảo sát ñiều kiện chiết xuất tối ưu quy mô 100-200 kg/mẻ nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ dung mơi / ngun liệu … - Khảo sát ñiều kiện sấy phun với ñiều kiện 10 lít nước/giờ nhiệt ñộ, tỉ lệ phụ gia, lưu lượng, hàm lượng rắn dịch phun … I - Xác ñịnh ñộ tinh khiết chất ñánh dấu (marker) HPLC - Xây dựng tiêu chuẩn sở bột sấy phun (hàm ẩm, ñộ tan, cỡ hạt, hàm lượng kim loại nặng, vi sinh, hàm lượng chất ñánh dấu,…) - Thẩm ñịnh phương pháp kiểm nghiệm ñịnh lượng II KẾT QUẢ THỰC HIỆN (Giai ñoạn 1) Tóm tắt nội dung thực giai ñoạn (ñối chiếu với hợp ñồng ñã ký): TT Nội dung dự kiến Nội dung ñã thực Khảo sát nguyên liệu, xác ñịnh nguồn nguyên liệu thực vật vi phẫu soi bột dược liệu ðã xác ñịnh nguồn nguyên liệu thực vật vi phẫu soi bột dược liệu ñối tượng nghiên cứu Bạch tật lê, Diệp hạ châu, Giá ðậu nành, Khổ qua, Xuyên tâm liên Gừng Khảo sát ñiều kiện chiết Khảo sát điều kiện chiết xuất quy mơ xuất quy mơ phịng thí nghiệm phịng thí nghiệm đối tượng nghiên cứu Bạch tật lê, Diệp hạ châu, Giá ðậu nành, Khổ qua Xuyên tâm liên Riêng với Gừng, ñã khảo sát ñiều ñể chiết xuất tinh dầu theo phương pháp lôi nước Cô lập chất ñánh dấu (marker) dạng tinh khiết phương pháp chiết lỏng – lỏng, chiết pha rắn, sắc ký cột pha thường, sắc ký cột pha ñão, phương pháp kết tinh Xác ñịnh cấu trúc chất tinh Tất chất tinh khiết phân lập ñược ñều khiết phương pháp ñược xác ñịnh phương pháp phổ phổ ñại NMR, IR, MS Khảo sát ñiều kiện chiết Khảo sát điều kiện chiết xuất quy mơ xuất tối ưu quy mơ 100-200 phịng thí nghiệm ñối tượng nghiên kg/mẻ cứu Bạch tật lê, Diệp hạ châu, Giá ðậu nành, Khổ qua Xuyên tâm liên Báo cáo sơ kết giai ñoạn I ðã phân lập ñược chất ñánh dấu từ Bạch tật lê, Diệp hạ châu, Giá ðậu nành, Khổ qua, Xuyên tâm liên sau: Tribulosin (100 mg), Phyllanthin (100 mg), Hypophyllanthin (100 mg), Niranthin (100 mg), Genistein (100 mg), Charantin (100 mg), Andrographolid (100 mg) 10/2009 II Tóm tắt nội dung thực giai ñoạn (ñối chiếu với hợp ñồng ñã ký): Nội dung dự kiến Nội dung ñã thực Khảo sát ñiều kiện sấy phun với điều kiện 10 lít nước/giờ Các ñiều kiện: nhiệt ñộ, tỷ lệ phụ gia, lưu lượng, hàm lượng dịch rắn dịch sấy phun… Xác ñịnh ñộ tinh khiết chất Kết ñộ tinh khiết chất ñánh dấu ñánh dấu (marker) HPLC Xây dựng tiêu chuẩn sở cho Xác ñịnh tiêu chuẩn: hàm ẩm, ñộ tan, kích sản phẩm bột sấy phun cỡ hạt, hàm lượng kim loại nặng, vi sinh, hàm lượng chất bảo vệ thực vật, hàm lượng chất ñánh dấu… Thẩm ñịnh phương pháp quy trình kiểm nghiệm (định tính, ñịnh kiểm nghiệm ñịnh tính ñịnh lượng) cho loại cao dược liệu lượng Xây dựng tiêu chuẩn chất ñánh Xác ñịnh tiêu chuẩn: cảm quan, ñộ tinh dấu (marker) sạch, độ tan, điểm nóng chảy Báo cáo nghiệm thu TT Báo cáo nghiệm thu III MỤC LỤC Thông tin chung Mục lục Danh sách chữ viết tắt Danh sách hình Danh sách bảng Danh sách sơ ñồ ðẶT VẤN ðỀ XUẤT XỨ DỰ ÁN CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU Bạch tật lê Diệp hạ châu Giá ñậu nành Khổ qua Xuyên tâm liên Gừng Nhật CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Dung mơi, hóa chất Thiết bị Khảo sát điều kiện chiết xuất cao chiết quy mơ phịng thí nghiệm Khảo sát điều kiện sấy phun CHƯƠNG III: KẾT QUẢ & THẢO LUẬN Bạch tật lê 1.1 Xác ñịnh nguồn nguyên liệu thực vật vi phẫu soi bột dược liệu 1.2 Khảo sát điều kiện chiết xuất Bạch tật lê quy mơ phịng thí nghiệm 1.3 Phân lập Tribulosin tinh khiết từ Bạch tật lê 1.4 Xác ñịnh cấu trúc Tribulosin 1.5 Khảo sát ñiều kiện chiết xuất Bạch tật lê tối ưu quy mơ 100 kg/mẻ 1.6 Khảo sát điều kiện sấy phun Bạch tật lê 1.7 Khảo sát ñộ tinh khiết chất ñánh dấu Tribulosin HPLC Diệp hạ châu 2.1 Xác ñịnh nguồn nguyên liệu thực vật vi phẫu soi bột dược liệu 2.2 Khảo sát điều kiện chiết xuất Diệp hạ châu quy mơ phịng thí nghiệm 2.3 Phân lập Phyllanthin, Hypophyllathin Niranthin tinh khiết từ Diệp hạ châu 2.4 Xác ñịnh cấu trúc Phyllathin IV TRANG I IV VII VIII XII XIV 4 10 12 13 13 13 14 14 15 17 17 17 18 22 24 29 29 31 32 32 35 38 39 2.5 2.6 2.7 Xác ñịnh cấu trúc Hypophyllathin Xác ñịnh cấu trúc Niranthin Khảo sát ñiều kiện chiết xuất Diệp hạ châu tối ưu quy mô 100 kg/mẻ Khảo sát ñiều kiện sấy phun Diệp hạ châu Khảo sát ñộ tinh khiết chất ñánh dấu Phyllanthin HPLC 2.8 2.9 Giá ñậu nành 3.1 Xác ñịnh nguồn nguyên liệu thực vật vi phẫu soi bột dược liệu 3.2 Khảo sát ñiều kiện chiết xuất Giá ñậu nành quy mơ phịng thí nghiệm 3.3 Phân lập Genistein tinh khiết từ Giá ñậu nành 3.4 Xác ñịnh cấu trúc Genistein 3.5 Khảo sát ñiều kiện chiết xuất Giá đậu nành tối ưu quy mơ 100 kg/mẻ 3.6 Khảo sát ñiều kiện sấy phun Giá ñậu nành 3.7 Khảo sát ñộ tinh khiết chất ñánh dấu Genistein HPLC Khổ qua 4.1 Xác ñịnh nguồn nguyên liệu thực vật vi phẫu soi bột dược liệu 4.2 Khảo sát ñiều kiện chiết xuất Khổ qua quy mơ phịng thí nghiệm 4.3 Phân lập Charantin tinh khiết từ Khổ qua 4.4 Xác ñịnh cấu trúc Charantin 4.5 Khảo sát ñiều kiện chiết xuất Khổ qua tối ưu quy mơ 100 kg/mẻ 4.6 Khảo sát điều kiện sấy phun Khổ qua 4.7 Khảo sát ñộ tinh khiết chất ñánh dấu Charantin HPLC Xuyên tâm liên 5.1 Xác ñịnh nguồn nguyên liệu thực vật vi phẫu soi bột dược liệu 5.2 Khảo sát điều kiện chiết xuất Xun tâm liên quy mơ phịng thí nghiệm 5.3 Phân lập Andrographolid tinh khiết từ Xuyên tâm liên 5.4 Xác ñịnh cấu trúc Andrographolid 5.5 Khảo sát ñiều kiện chiết xuất Xuyên tâm liên tối ưu quy mơ 100 kg/mẻ 5.6 Khảo sát điều kiện sấy phun Xuyên tâm liên 5.7 Khảo sát ñộ tinh khiết chất ñánh dấu Andrographolid HPLC Gừng Nhật 6.1 Xác ñịnh nguồn nguyên liệu thực vật vi phẫu soi bột dược liệu 6.2 Khảo sát ñiều kiện chiết xuất tinh dầu Gừng Nhật quy mơ phịng thí nghiệm 6.3 Khảo sát ñiều kiện chiết xuất tinh dầu Gừng Nhật tối ưu V 40 42 45 45 47 48 48 50 53 54 56 57 59 64 64 68 71 72 78 78 80 81 81 83 86 87 91 92 93 102 102 103 104 Nhận xét: Thông số thời gian lưu so sánh HPLC khơng thấy có khác biệt chất A, chất D ñã chiết tách so với chuẩn làm việc andrographolid, dehydoandrographolid - ðiểm chảy Bảng 54: ðiểm nóng chảy chất ðiểm nóng chảy (0C) ðiểm nóng chảy (0C) A Andrographolid 228 oC 226-230 oC D Dehydoandrographolid 204 oC 203-204 oC - Sắc ký đồ IR Hình 112: Sắc ký đồ IR chất A chất D Sắc ký ñồ IR chất A D có đình hấp thu C=O (1727.5 1738), C=C (1674 1637) phù hợp với tài liệu công bố andrographolid dehydroandrographolid 100 - Sắc ký ñồ UV A Andrographolid A +andrographolid Hình 113: Sắc ký đồ UV chất A andrographolid chuẩn Chất D Dehydoandrographolid D+Dehydoandrographolid Hình 114: Sắc ký ñồ UV chất D Dehydroandrographolid chuẩn 101 6.1 Gừng Nhật Xác ñịnh nguồn nguyên liệu thực vật vi phẫu soi bột dược liệu Vi phẫu Vi phẫu thân rễ: Hình 115: Cây gừng Nhật Bản Hình 116: Thân rễ rễ gừng Nhật Bản Hình 118: Sơ đồ cấu tạo thân rễ Hình 117: Lá gừng Nhật Bản Hình 119: Vi phẫu thân rễ Hình 120: Sơ đồ cấu tạo Hình 121: Vi phẫu phần thịt 102 Hình 122: Vi phẫu phần gân Hình 123: Sơ đồ cấu tạo rễ Hình 124: Vi phẫu rễ -Kết luận: Dược liệu ñược nghiên cứu ñây ñúng Gừng, có tên khoa học là: Zingiber officinale var kintoki Nees, họ Gừng (Zinbiberaceae) 6.2 Khảo sát ñiều kiện chiết xuất tinh dầu Gừng Nhật quy mơ phịng thí nghiệm Phương pháp: Chưng cất lôi nước cổ ñiển Chỉ tiêu kiểm soát: Hàm lượng tinh dầu thu ñược (ml/kg nguyên liệu) Khảo sát hàm lượng tinh dầu theo thời gian chiết xuất Mỗi mẫu thí nghiệm 500 g nguyên liệu Bảng 55: Hiệu suất chiết xuất tinh dầu Gừng Nhật quy mơ phịng thí nghiệm Mẫu phút V (ml) Hiệu suất (%) 15 0,60 38,78 30 0,80 51,71 60 0,90 58,17 90 1,20 77,56 120 1,30 84,02 150 1,40 90,49 180 1,50 96,95 103 % 1.80 1.60 1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 y = -2E-05x + 0.0092x + 0.4892 R = 0.9846 0.20 phút 0.00 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 Hình 125: Hiệu suất chiết xuất tinh dầu Gừng Nhật quy mơ phịng thí nghiệm Kết luận: - Hàm lượng tinh dầu đạt cực ñại 3,09 ml/kg chiết xuất với thời gian 229 phút - Hàm lượng tinh dầu tăng mạnh thời gian 90 phút ñầu, tương ứng với hiệu suất thu ñược 77,56 % 6.3 Khảo sát ñiều kiện chiết xuất tinh dầu Gừng Nhật tối ưu quy mô 100 kg/mẻ Tiến hành chiết xuất với 500 kg nguyên liệu gừng tươi ðo thể tích tinh dầu thu theo thời gian tính hiệu suất so với phịng thí nghiệm Bảng 56: Hiệu suất chiết xuất tinh dầu Gừng Nhật quy mô 100 TG (phút) V (lít) Hiệu suất (%) 60,00 0,76 49,03 90,00 1,03 66,45 120,00 1,21 78,06 150,00 1,22 78,71 180,00 1,25 80,65 104 kg/mẻ Hình 126: Hiệu suất chiết xuất tinh dầu Gừng Nhật quy mô 100 kg/mẻ Nhận xét: Hiệu suất thu ñược sau 180 phút chiết xuất đạt 80,65 % so với phịng thí nghiệm Hàm lượng tinh dầu ñạt 0,25 % so với nguyên liệu tươi 6.4 Khảo sát ñiều kiện sấy phun Gừng Nhật a Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ khí mang ðiều kiện: Tỉ lệ phụ gia / cao chiết 50: 50; Hàm lượng chất rắn hòa tan: 30 % Bảng 57: Ảnh hưởng nhiệt độ khí mang sấy phun Gừng Nhật TT Nhiệt ñộ (oC) ðộ ẩm (%) Cảm quan 190 6,5 Vón cục, ẩm Khơng đạt 200 5,2 Khơ, tơi xốp, đồng đều, màu vàng nhạt, vị tự nhiên Khơng đạt 210 3,8 Khơ, tơi xốp, đồng đều, màu vàng nhạt, vị tự nhiên ðạt 220 3,1 Khơ, tơi xốp, đồng ñều, màu vàng nhạt, vị tự nhiên ðạt 230 3,4 Khơ, tơi xốp, đồng đều, màu vàng, vị tự nhiên ðạt 240 3,1 Khơ, tơi xốp, đồng đều, màu vàng sậm, có dấu hiệu bị cháy Khơng đạt - Kết luận: Sấy phun Gừng Nhật khoảng 210 - 230 oC 105 Kết luận b Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng chất rắn hoà tan ðiều kiện: Nhiệt ñộ: 210 oC; Tỉ lệ phụ gia/ cao chiết 50:50 Bảng 58: Ảnh hưởng hàm lượng chất rắn hoà tan sấy phun Gừng Nhật TT Hàm lượng chất rắn hòa tan (%) ðộ ẩm Kết luận 20 3,3 ðạt 25 3,4 ðạt 30 3,8 ðạt 35 3,4 ðạt 40 3,6 ðạt (%) Kết luận: Hàm lượng dịch sấy khoảng 30 – 40 % thích hợp c Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ phụ gia/cao chiết Bảng 59: Ảnh hưởng tỉ lệ phụ gia/cao chiết sấy phun Gừng Nhật TT Tỉ lệ cao chiết/ phụ gia ðộ ẩm (%) Cảm quan Kết luận (kg/kg) 25 : 75 3,4 Màu trắng ngà, vị tự nhiên ðạt 50: 50 3,8 Màu trắng ngà, vị tự nhiên ðạt - Kết luận: Tỉ lệ cao chiết / phụ gia thích hợp 50:50 d Kết luận ðối với cao chiết từ Gừng Nhật bản, điều kiện thích hợp ñể tiến hành sấy phun sương là: - Nhiệt ñộ: 210 - 230 oC - Hàm lượng chất rắn hòa tan dịch phun: 30 - 40 % - Tỉ lệ phụ gia / cao chiết 50:50 106 Thẩm ñịnh phương pháp kiểm nghiệm định lượng CÁC BƯỚC THẨM ðỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH Cơ sở để thẩm định qui trình dựa vào tính chất sau: Tính đặc hiệu (tính chọn lọc): Khả qui trình cho phép xác định xác đặc hiệu chất cần phân tích khơng bị ảnh hưởng có mặt chất khác có mẫu thử ðộ xác: Là mức ñộ sát gần kết bột phun sấy khô thử riêng rẽ với giá trị trung bình thu áp dụng phương pháp ñề xuất cho mẫu thử ñồng ñiều kiện xác ñịnh ðộ xác bị ảnh hưởng sai số ngẫu nhiên, ñược biểu thị : - ðộ lệch chuẩn (SD = Standard deviation) - ðộ lệch chuẩn tương ñối (RSD = Relative Standard Deviation) Cách tiến hành: Với mẫu ñược làm ñồng nhất, tiến hành xác ñịnh phương pháp ñề xuất n lần (n: 6-10 lần, hay nhiều ), sau áp dụng cơng thức: Chú ý: Các lần thử nghiệm phải ñược tiến hành ñộc lập với nhau, mẫu ñã ñược làm đồng Khi đề cập đến độ xác cách chi tiết, ta có: ðộ lặp lại: Biểu thị độ xác điều kiện tiến hành khoảng thời gian ngắn, cụ thể việc thực phương pháp ñược tiến hành người phịng thí nghiệm dụng cụ máy móc thời gian ðộ xác trung gian: Biểu thị độ xác phương pháp theo biến số phịng thí nghiệm nhiều ngày khác với nhiều kiểm nghiệm viên khác với dụng cụ khác nhau… ðộ chép lại: Biểu thị độ xác nhiều phịng thí nghiệm (hợp tác nghiên cứu) tiến hành nghiên cứu mẫu ñồng ñã ñược phân thành nhiều mẫu nhỏ 107 Bảng 60: Phân tích khác độ lặp lại, độ xác trung gian, độ chép lại Người Phịng thí nghiệm Dụng cụ Thời gian ðộ lặp lại + + + + ðộ xác trung gian - + - - ðộ chép lại - - - - ðộ ñúng: Là mức độ sát gần giá trị tìm thấy với giá trị thực áp dụng qui trình đề xuất mẫu thử ñã ñược làm ñồng ñiều kiện xác ñịnh ðộ ñúng bị ảnh hưởng sai số hệ thống, bao gồm ñại lượng ñặc trưng Tiến hành: Xác ñịnh hàm lượng chất cần thử mẫu ñem thử phương pháp dự kiến Sau cho vào mẫu thử lượng chất chuẩn có hàm lượng 90%, 100%, 110% hàm lượng lý thuyết hay hàm lượng nhãn xác định phương pháp đề xuất Tính tuyến tính : Sự tuyến tính qui trình phân tích khả thu kết bột phun sấy khơ thử nghiệm tỷ lệ thuận với nồng ñộ (số lượng) chất cần phân tích có mẫu thử (trong khoảng nồng độ cho phép) Tính chất tuyến tính ñược biểu thị hệ số tương quan R Tiến hành : Xác định độ đáp ứng nồng độ Tìm phương trình y = ax + b Ngồi cịn có tiêu chuẩn khác: Giới hạn phát hiện, giới hạn ñịnh lượng, miền giá trị… Bảng 61: Tóm tắt tiêu chuẩn cần phải có phép phân tích (theo ICH) Kiểu qui trình ðịnh tính Thử tinh khiết ðịnh lượng ðịnh lượng Giới hạn + + + + ðộ lặp lại - + - + ðộ xác trung gian - + - + Tính đặc hiệu ðộ xác 108 ðộ lại - - ðộ ñúng - + Giới hạn phát - + + - Giới hạn ñịnh lượng - + - - Tính tuyến tính - + - + Khoảng giá trị - + - + - + + THẨM ðỊNH QUI TRÌNH ðỊNH LƯỢNG Xây dựng đường cong chuẩn- KHOẢNG TUYẾN TÍNH Pha dung dịch mẹ nồng độ mg/ml Từ dd mẹ pha loãng thành dung dịch có nồng độ tăng dần từ 0,1mg/ml đến 0,275 mg/ml Tiến hành triển khai HPLC, dùng phần mềm Excel để tính tốn Kết bảng sau Bảng 62: kết khảo sát tương quan nồng ñộ diện tích đỉnh C(mg/ml) 0,1 S 0,125 0,15 0,175 0,2 0,225 0,25 0,275 7499837 9987719 11753410 14282431 15970329 18686925 20232563 230006 25000000 y = 9E+07x - 1E+06 R2 = 0.9976 diện tích đỉnh 20000000 15000000 Series1 Linear (Series1) 10000000 5000000 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 nồng ñộ (mg/ml) Hình 127: ðồ thị ñường cong chuẩn phyllanthin Trắc nghiệm giả thuyết thống kê cho phương trình hồi quy tuyến tính Hệ số B: 86771; Hệ số B0: -1E+06 Trắc nghiệm tính tương thích phương trình hồi quy Giả thiết H0: Phương trình khơng tương thích 109 Giả thiết HA: Phương trình tương thích P = 3,065E-09 < 0,05 bác bỏ giả thiết H0 => phương trình tương thích - Trắc nghiệm ý nghĩa hệ số Giả thiết H0: Hệ số hồi quy khơng có ý nghĩa Giả thiết HA: Hệ số hồi quy có ý nghĩa Hệ số B: P = 4,06573E-09 < 0,05 bác bỏ giả thiết H0 => Hệ số B có ý nghĩa Hệ số B0: P = 0,017 < 0,05 bác bỏ giả thiết H0 => Hệ số B0 có ý nghĩa Vậy phương trình tuyến tính Ŷ =86771X – 1E+06 Khảo sát tính tương thích hệ thống chuẩn Thực hiện: tiến hành triển khai HPLC, bơm lần liên tiếp dd mẫu chuẩn có nồng độ 0,25mg/ml Kết sau tính tốn giá trị thống kê Kết bảng sau Bảng 63: Tính tương thích hệ thống chuẩn Lần bơm tR S K’ As N 15,043 19812449 9,7446 1,25 8235 15,071 19905666 9,7652 1,25 8296 15,092 19842034 9,7812 1,25 8296 15,105 19858974 9,7892 1,24 8190 15,114 19888092 9,7959 1,26 8229 15,129 19851520 9.806 1,24 8194 TB 15,09 19859639 9,78 1,248 8240 SD 0,03 33266,37 0,22 0,0075 46,98 RSD (%) 0,20 0,17 0,23 0,60 0,57 Nhận xét: RSD thông số sắc ký bao gồm diện tích đỉnh, thời gian lưu tR < % Các thông số khác hệ số dung lượng (K’), hệ số bất ñối (As), số ñĩa lý thuyết (N) đạt u cầu Như tính tương thích hệ thống mẫu chuẩn đạt u cầu 110 Khảo sát ñộ hồi phục – ñộ ñúng Chuẩn bị mẫu Cân xác 0,1 g mẫu cho vào bình nón nút mài 100 ml Thêm 10 ml MeOH vào đậy nắp bình nón, ngâm 10 phút Sau chiết với hỗ trợ bể siêu âm 10 phút nhiệt ñộ 60 oC, gạn lọc qua bơng vào cốc có mỏ 100 ml lấy dịch chiết lần 1, làm thêm lần lần với 10 ml MeOH (các lần không ngâm 15 phút) Gộp dịch chiết, đến cắn Lấy xác 50 ml MeOH hịa từ từ vào cắn, lọc từ từ qua giấy lọc ñã thấm dung mơi vào bình định mức 50ml Dùng MeOH tráng phễu lọc, sau thêm vừa đủ thể tích bình ñịnh mức 50 ml Dịch chiết bình dùng làm mẫu thử ñể ñịnh lượng Bảng 64: Kết khảo sát độ Hàm lượng có sẵn (mg) Hàm lượng thêm vào (mg) Hàm lượng thu ñược (mg) Tỉ lệ phục hổi (%) 1,651 0,65 2,284 97,4 1,651 1,00 2,691 104 1,651 1,35 3,161 111 ðộ phục hồi có ñược từ 97,4% - 111 % ðạt ñược ñộ phục hồi theo u cầu Khảo sát độ lặp lại Hình 128: Sắc ký ñồ khảo sát ñộ lặp lại mẫu thử 111 Bảng 65: Kết khảo sát ñộ lặp lại mẫu thử TT Khối lượng mẫu thử (g) Diện tích đỉnh (St) Hàm lượng (mg) Kết n =6 0,5001 19005879 0,246 0,5000 18924768 0,245 0,5002 17973979 0,233 SD = 0,01 0,5001 20146192 0,261 RSD = 4,35% 0,5003 18550465 0,240 0,5002 19968572 0,259 Hình 129:Thiết bị chiết xuất 112 p=0,95; t = 2,57 Xtb = 0,248 e = ± 0,01 Hình 130: Thiết bị đặc CHƯƠNG IV KẾT LUẬN Qua thời gian thực Dự án, chúng tơi đạt kết sau: ðã khảo sát nguyên liệu thực vật mô tả hình thái, vi phẫu, soi bột Bạch tật lê, Diệp hạ châu, Giá ñậu nành, Khổ qua, Xuyên tâm liên Gừng Nhật ðã khảo sát điều kiện chiết xuất quy mơ phịng thí nghiệm nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ dung mơi/ngun liệu ðã phân lập chất ñánh dấu (marker) xác ñịnh cấu trúc phương pháp phồ là: Tribulosin (Bạch tật lê), Phyllanthin, Hypophyllanthin, Niranthin (Diệp hạ châu), Genistein (Giá ñậu nành), Charantin (Khổ qua) Andrographolid (Xuyên tâm liên) ðã khảo sát điều kiện chiết xuất tối ưu quy mơ từ 100-200 kg/mẻ cho nguyên liệu dược liệu ðã khảo sát điều kiện sấy phun với cơng suất nước lít/giờ điều kiện nhiệt độ, tỷ lệ phụ gia, hàm lượng rắn dịch sấy phun ðã xác ñịnh ñộ tinh khiết chất ñánh dấu HPLC ðã xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm bột sấy phun xác ñịnh tiêu chuẩn: Hàm ẩm, ñộ tan, cỡ hạt, hàm lượng kim loại nặng, hàm lượng vi sinh, hàm lượng chất bảo vệ thực vật, hàm lượng chất ñánh dấu ðã thẩm ñịnh phương pháp định tính định lượng ðã xây dựng tiêu chuẩn chất ñánh dấu 10 ðã sản xuất loại cao sấy phun với số lượng sau: • Bạch tật lê: 50 kg • Diệp hạ châu: 3.490 kg • Giá đậu nành: 2.600 kg • Khổ qua: 35 kg • Xuyên tâm liên: 200 kg • Gừng Nhật bản: 300 kg • Tinh dầu Gừng: 100 kg • Bột sấy phun Gừng 150 kg Ngồi cịn sản xuất cao đặc Diệp hạ châu: 550 kg 113 Tổng doanh số ñã bán 4.240.925 ñồng (Bốn tỉ hai trăm bốn mươi triệu chín trăm hai mươi lăm ngàn ñồng) so với kế hoạch ñã ñăng ký 3.030.000 ñồng (Ba tỉ ba mươi triệu ñồng), cho công ty dược Công ty cổ phần dược DANAPHA (ðà Nẵng), Công ty dược Nam ðịnh (Nam ðịnh), Cơng ty Khang Minh (TP Hồ Chí Minh), Cơng ty ðơng Nam ( TP Hồ Chí Minh) 11 ðã sản xuất chất ñánh dấu dạng tinh kiết > 97 % (HPLC) , loại 200 mg là: Tribulosin, Phyllanthin, Hypophyllathin, Niranthin, Genistein, Charantin Andrographolid 12 HIỆU QUẢ KINH TẾ VÀ XÃ HỘI CỦA DỰ ÁN: Các sản phẩm chiết xuất dự án Cơng ty dược ñạt tiêu chuẩn GMP-WHO sử dụng sản xuất thuốc như: ● HAMEGA, VG-5, DIỆP HẠ CHÂU… ñể trị bệnh viêm gan, men gan cao tăng cường chức gan ● TRAGUTAN, BRONZONIE: Trị ho ● BẢO XUÂN: Cân nội tiết tố nữ, chống lão hoá… ● SAVIGOLD, TÂY THI: Thực phẩm chức năng… Các thuốc có hiệu cao giá rẻ, thị trường nước tiêu thụ rộng rãi, góp phần giảm chi phí điều trị cho cộng đồng Tham gia góp phần chuyển đổi cấu trồng cho nơng dân sống vùng đất cát ven biển, ven sơng Miền Trung Các nông dân trồng Diệp hạ châu, Gừng Nhật Bản, Khổ qua, Xuyên tâm liên… có thu nhập cao ổn định Bình qn 1ha thu 200-250 triệu/6 tháng Nơng dân an tâm, vui sống với đồng ruộng khơng phải rời quê lên thành phố tìm việc ðơn vị thực dự án – Trung tâm Nghiên cứu sản xuất dược liệu Miền Trung có điều kiện đổi thiết bị sản xuất ñại hơn, suất cao chất lượng ổn ñịnh so với thiết bị cũ ðồng thời cho phép Trung tâm ñáp ñầy ñủ yêu cầu số lượng chất lượng xí nghiệp dược - Các sản phẩm chất chuẩn Dự án góp phần tiêu chuẩn hố, định lượng đuợc hoạt chất sản phẩm, nâng cao giá trị sản phẩm, chất lượng dược liệu thuốc sản xuất từ dược liệu Việt Nam 114