Nghiên cứu sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định thường gặp phục vụ công tác kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ Y TẾ TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRUNG TÂM KIỂM CHUẨN XÉT NGHIỆM TP.HCM ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP THÀNH PHỐ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT MẪU BỆNH PHẨM GIẢ ĐỊNH THƢỜNG GẶP PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG XÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG TS TRẦN HỮU TÂM ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) N H N ỨU SẢN UẤT ẪU ỆNH PHẨ Ả ĐỊNH THƢỜN ẶP PHỤ VỤ N T Ể TR HẤT LƢỢN T N H Ệ V S NH L S N CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI CƠ QUAN CHỦ TRÌ THÀNH PH H CHÍ MINH THÁNG 08/2015 TÓ TẮT NỘ DUN N H N ỨU Để có kết xét nghiệm vi sinh lâm sàng tin cậy, cần phải tiến hành kiểm tra chất lượng, mẫu kiểm chuẩn vật liệu thiếu kiểm tra chất lượng xét nghiệm Vi sinh lâm sàng Do đặc tính mẫu chứa vi khuẩn gây bệnh, sống dạng mẫu bệnh phẩm khác nhau, thời gian, số lượng sử dụng mẫu khác nhau, vấn đề an toàn sinh học, bệnh cảnh vùng, quốc gia, chưa có đơn vị sản xuất,….Vì vậy, Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm TP.HCM cấp ngân sách nghiên cứu khoa học thành phố để thực đề tài “Nghiên cứu sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định thƣờng gặp phục vụ công tác kiểm tra chất lƣợng xét nghiệm vi sinh lâm sàng”, đề tài thực vịng 30 tháng phịng thí nghiệm Vi sinh đạt tiêu chuẩn An toàn Sinh học cấp II Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm TP.HCM Nội dung kết đề tài bao gồm chuyên đề từ việc khảo sát lựa chọn 05 dạng mẫu bệnh phẩm thường gặp Phòng xét nghiệm Vi sinh Đàm, Máu, Mủ, Nước tiểu, Phân với 10 chủng vi khuẩn đặc trưng cho dạng mẫu này; xây dựng quy trình cụ thể với 04 giai đoạn sản xuất mẫu; nghiên cứu thành phần môi trường qua bước sàng lọc 11 yếu tố, thí nghiệm tối ưu theo đường dốc tối ưu bề mặt RSM-CCD để đạt mức tối ưu hàm lượng vi khuẩn gây bệnh sống sót ≥ 103 khoảng thời gian 15 ngày điều kiện phịng thí nghiệm; áp dụng quy trình sản xuất quy mơ pilot đánh giá độ đồng ổn định; kiểm tra tác động mơi trường qua q trình vận chuyển đến phòng xét nghiệm khoảng cách địa lý khác Qua kết nghiên cứu áp dụng thực tế, quy trình nghiên cứu tạo mẫu bệnh phẩm giả định hồn tồn thích hợp cho việc sử dụng đánh giá chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng, tập huấn nâng cao tay nghề nhân viên xét nghiệm, góp phần đảm bảo chất lượng xét nghiệm Vi sinh lâm sàng SUMMARY OF RESEARCH CONTENT External quality control (EQC) material is essential especially in Clinical Microbiology quality assessment to have a reliable result Due to specifications of EQC material as vital bacteria with different type of microbiological samples, different shelflife, different using purposes, biology safety issues, suitable with region and country epidemiology, Center for Standardization and Quality Control in Medical laboratory of Ho Chi Minh city (CSQL of HCMC) have been approved by Department of Science and Technology in using budget for doing research to carry-out the study “Research in manufacture of common stimulating samples using for quality assessment in clinical microbiology” lasting period of 30 months in Biosafety level II laboratory of CSQL of HCMC The content and result of study have 05 specific subjects included from investigation and selection of 05 types of specimen presenting frequently in microbiology laboratory such as sputum, blood, pus, urine, and feces with 10 strains of bacteria specified in those samples; making plan for detailed process of 04 stages of sample manufacturing; doing research of medium ingredients based on screening experiments of 11 factors then optimize them following the Plackett-Burman matrix, the steepest descent method, response surface methodology–central composite design (RSM-CCD) in order to achieve maximally malignant bacteria surviving ≥ 103 during 15 days in laboratory condition; applying manufacturing process in pilot and assess homogeneity and stability of these samples; evaluation the effect of environment on, by the route to delivery to the medical laboratories in various distances Throughout the study results and practical application, the study process makes stimulated samples quite suitable for using in quality assessment of clinical microbiological testing, in training for laboratory staffs, contribution in quality assurance Clinical microbiology MỤC LỤC TÓ TẮT NỘ DUN N H N ỨU D NH Ụ HỮ V ẾT TẮT D NH Ụ ẢN D NH Ụ HÌNH 13 HƢƠN Ở ĐẦU 15 1.1 Mục tiêu tổng quát 15 1.2 Mục tiêu cụ thể 15 1.3 Nội dung nghiên cứu 15 1.4 Đối tượng thực 16 1.5 Bảng toán kinh phí 16 HƢƠN TỔN QU N 19 2.1 Xét nghiệm Vi sinh lâm sàng 19 2.2 Kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng 23 2.3 Tình hình triển khai ngoại kiểm tra xét nghiệm (EQAs) vi sinh lâm sàng 24 2.4 Mẫu ngoại kiểm Vi sinh 25 2.5 Tối ưu hóa 28 2.6 Tính cấp thiết đề tài 30 2.7 Ý nghĩa tính khoa học thực tiễn 32 HƢƠN NỘ DUN N H N ỨU 33 3.1 Vật liệu điều kiện sở vật chất để thực nghiên cứu 33 3.2 Trang thiết bị sở vật chất 34 3.3 Nội dung 1: Khảo sát lựa chọn dạng mẫu bệnh phẩm vi sinh thường gặp 35 3.4 Nội dung 2: Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định quy mơ phịng thí nghiệm 39 3.5 Nội dung 3: Tối ưu hóa điều kiện sản xuất, sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định qui mơ phịng thí nghiệm, đánh giá độ đồng độ ổn định mẫu 42 3.6 Nội dung 4: Sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định qui mô pilot, đánh giá độ đồng độ ổn định mẫu 48 3.7 Nội dung 5: Đánh giá tác động môi trường thực tế (nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện vận chuyển) 49 HƢƠN ẾT QUẢ V N LUẬN 51 4.1 Nội dung 1: Khảo sát bệnh phẩm vi khuẩn gây bệnh thường gặp PXN Vi sinh lâm sàng 51 4.2 Nội dung 2: Xây dựng quy trình sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định quy mơ phịng thí nghiệm 62 4.3 Nội dung 3: Tối ưu hóa điều kiện sản xuất, sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định qui mơ phịng thí nghiệm, đánh giá độ đồng độ ổn định mẫu 65 4.4 Nội dung 4: Sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định quy mô pilot đánh giá độ đồng nhất, độ ổn định mẫu 126 4.5 Nội dung 5: đánh giá tác động môi trường thực tế (nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện vận chuyển) 141 HƢƠN ẾT LUẬN V ẾN N HỊ 145 5.1 KẾT LUẬN 145 5.2 KIẾN NGHỊ 149 T L ỆU TH HẢO 152 PHỤ LỤ 155 D NH Từ viết tắt Ụ HỮ V ẾT TẮT Tiếng nh Tiếng Việt ATCC Americal Type Culture Collection Chủng vi khuẩn tiêu chuẩn Hoa Kỳ CFU Colony forming unit Đơn vị khuẩn lạc EQAs External Quality Assessment schemes Chương trình ngoại kiểm tra chất lượng IQC Internal Quality Control Nội kiểm tra chất lượng ISO International Standard Organization Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế Phòng xét nghiệm PXN RSMCCD Response Surface Method – Central Composite Designs Phương pháp đáp ứng bề mặt – thiết kế tâm đối xứng WHO World Health Organization Tổ chức Y tế giới D NH Ụ ẢN Bảng 2.1 Thiết kế ma trận Plackett-Burman 11 yếu tố 28 Bảng 3.1 Tổng hợp thành phần môi trường chuyên chở 43 Bảng 3.2 Mười yếu tố khảo sát cho thiết kế sàng lọc yếu tố thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman 44 Bảng 3.3 Thí nghiệm thiết kế sàng lọc 11 yếu tố thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman 44 Bảng 3.4 Bố trí 20 thí nghiệm theo CCD 46 Bảng 4.1 Bảng thống kê số lượng loại mẫu bệnh phẩm 51 Bảng 4.2 Thống kê số lượng phòng xét nghiệm thường gặp chủng vi khuẩn mẫu bệnh phẩm 54 Bảng 4.3 Chủng vi khuẩn cho mẫu bệnh phẩm giả định 61 Bảng 4.4 Nội dung công việc, thời gian hồ sơ liên quan đến sản xuất mẫu 63 Bảng 4.5 Bảng tiêu kiểm tra vi khuẩn 64 Bảng 4.6 Các tiêu kiểm tra môi trường chất bệnh phẩm 64 Bảng 4.7 Các tiêu kiểm tra mẫu thành phẩm 65 Bảng 4.8 Kết thí nghiệm sàng lọc theo Plackett-Burman mẫu Đàm chứa Pseudomonas aeruginosa 67 Bảng 4.9 Kết phân tích mức ảnh hưởng yếu tố khảo sát mẫu Đàm chứa Pseudomonas aeruginosa 68 Bảng 4.10 Kết tính bước nhảy cho 03 yếu tố ảnh hưởng đến Pseudomonas aeruginosa 69 Bảng 4.11 Bước nhảy 03 yếu tố ảnh hưởng đến Pseudomonas aeruginosa 70 Bảng 4.12 Bước nhảy 03 yếu tố ảnh hưởng đến Acinetobacter baumannii 70 Bảng 4.13 Kết thí nghiệm sàng lọc theo Plackett-Burman mẫu Máu chứa Acinetobacter baumannii 72 Bảng 4.14 Kết phân tích mức ảnh hưởng yếu tố khảo sát mẫu Máu chứa Acinetobacter baumannii 72 Bảng 4.15 Kết tính bước nhảy cho 03 yếu tố ảnh hưởng đến Acinetobacter baumannii 74 Bảng 4.16 Bước nhảy 03 yếu tố ảnh hưởng đến Acinetobacter baumannii 74 Bảng 4.17 Bước nhảy 03 yếu tố ảnh hưởng đến Staphylococcus epidermidis 75 Bảng 4.18 Kết thí nghiệm sàng lọc theo Plackett-Burman mẫu Phân chứa Shigella sonnei 76 Bảng 4.19 Kết phân tích mức ảnh hưởng yếu tố khảo sát mẫu Phân chứa Shigella sonnei 77 Bảng 4.20 Kết tính bước nhảy cho 03 yếu tố ảnh hưởng đến Shigella sonnei 78 Bảng 4.21 Bước nhảy 03 yếu tố ảnh hưởng đến Shigella sonnei 79 Bảng 4.22 Bước nhảy 03 yếu tố ảnh hưởng đến Salmonella paratyphi A 79 Bảng 4.23 Kết thí nghiệm sàng lọc theo Plackett-Burman mẫu Mủ chứa Staphylococcus aureus 80 Bảng 4.24 Kết phân tích mức ảnh hưởng yếu tố khảo sát mẫu Mủ chứa Staphylococcus aureus 81 Bảng 4.25 Kết tính bước nhảy cho 03 yếu tố ảnh hưởng đến Staphylococcus aureus 82 Bảng 4.26 Bước nhảy 03 yếu tố ảnh hưởng đến Staphylococcus aureus 83 Bảng 4.27 Bước nhảy 03 yếu tố ảnh hưởng đến Pseudomonas aeruginosa 83 Bảng 4.28 Kết thí nghiệm sàng lọc theo Plackett-Burman mẫu Nước tiểu chứa Proteus vulgaris 84 Bảng 4.29 Kết phân tích mức ảnh hưởng yếu tố khảo sát mẫu Nước tiểu chứa Proteus vulgaris 85 Bảng 4.30 Kết tính bước nhảy cho 03 yếu tố ảnh hưởng đến Proteus vulgaris 86 Bảng 4.31 Bước nhảy 03 yếu tố ảnh hưởng đến Proteus vulgaris 87 Bảng 4.32 Bước nhảy 03 yếu tố ảnh hưởng đến Enterococcus faecalis 87 Bảng 4.33 Thiết kế thí nghiệm leo dốc mẫu Đàm chứa P aeruginosa 87 Bảng 4.34 Phạm vi nghiên cứu yếu tố dùng RSM-CCD mẫu đàm chứa Pseudomonas aeruginosa 88 Bảng 4.35 Thiết kế thí nghiệm leo dốc mẫu Máu chứa Acinetobacter baumannii 88 Bảng 4.36 Phạm vi nghiên cứu yếu tố dùng RSM-CCD mẫu Máu chứa Acinetobacter baumannii 89 Bảng 4.37 Thiết kế thí nghiệm leo dốc mẫu mủ chứa Staphylococcus aureus 89 Bảng 4.38 Phạm vi nghiên cứu yếu tố dùng RSM-CCD mẫu mủ chứa Staphylococcus aureus 90 Bảng 4.39 Thiết kế thí nghiệm leo dốc mẫu Phân chứa Shigella sonnei 90 Bảng 4.40 Phạm vi nghiên cứu yếu tố dùng RSM-CCD mẫu Phân chứa Shigella sonnei 91 Bảng 4.41 Thiết kế thí nghiệm leo dốc mẫu Nước tiểu chứa Proteus vulgaris 92 Bảng 4.42 Phạm vi nghiên cứu yếu tố dùng RSM-CCD mẫu nước tiểu chứa Proteus vulgaris 92 Bảng 4.43 Kết CCD 20 thí nghiệm mẫu đàm chứa Pseudomonas aeruginosa 93 Bảng 4.44 Mật độ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa mẫu bệnh phẩm đàm giả định 100 ml 500 ml môi trường tối ưu 96 Bảng 4.45 Kết CCD 20 thí nghiệm mẫu máu chứa Acinetobacter baumannii 97 Bảng 4.46 Mật độ vi khuẩn Acinetobacter baumannii mẫu bệnh phẩm máu giả định 100 ml 500 ml môi trường tối ưu 99 Bảng 4.47 Kết CCD 20 thí nghiệm mẫu mủ chứa Staphylococcus aureus 100 Bảng 4.48 Mật độ vi khuẩn Staphylococcus aureus mẫu bệnh phẩm mủ giả định 100 ml 500 ml môi trường tối ưu 103 Bảng 4.49 Kết CCD 20 thí nghiệm mẫu phân chứa Shigella sonnei 104 Bảng 4.50 Mật độ vi khuẩn Shigella sonnei mẫu bệnh phẩm phân giả định 100 ml 500 ml môi trường tối ưu 106 Bảng 4.51 Kết CCD 20 thí nghiệm mẫu nước tiểu chứa Proteus vulgaris 107 Bảng 4.52 Mật độ vi khuẩn Proteus vulgaris mẫu bệnh phẩm nước tiểu giả định 100 ml 500 ml môi trường tối ưu 110 Bảng 4.53 Mật độ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa mẫu đàm giả định để đánh giá độ đồng quy mơ phịng thí nghiệm 111 Bảng 4.54 Mật độ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa mẫu đàm giả định 15 ngày bảo quản quy mơ phịng thí nghiệm 113 Bảng 4.55 Mật độ vi khuẩn Acinetobacter baumannii mẫu máu giả định để đánh giá độ đồng quy mơ phịng thí nghiệm 115 10 Variance 0.009584 0.004738 10 10 df 9 F 2.022533 P(F