Nghiên cứu sản xuất các chế phẩm enzym protease từ vi sinh vật để ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm 2

SỞ KHOA HỌC - CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH BAO CAO KET QUA NGHIEM THU DE TÀI NCKH TEN DE TAL NGHIEN CUU SAN XUAT CAC CHE PHAM ENZYM PROTEASE TU VI SINH VAT ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG LĨNH VỰC CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM CNĐT : PGS TS ĐỒNG THỊ THANH THU TRƯỜNG ĐH - KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP HỒ CHÍ MINH TPHCM - 2005 LOI CAM ON Xin chân thành cám ơn SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM xét duyệt chấp thuận tạo điều kiện cho thực để tài © Cám ơn cộng tác viên + TS Vũ Ngọc Bội + Cử nhân Đình thị Đào ` + cộng tác viên trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp HCM nhiệt tình hỗ trợ cho việc tiến hành đề tài ©- Xin chân thành cẩm ơn hỗ trợ giúp đỡ : + Xí nghiệp Thủy sản Nha Trang + Xí nghiệp nước mắm Liên Thành + Xí nghiệp nước mắm Liên Huỳnh + Cơ sở sẵn xuất chao Hoa sen s_ Cám ơn Quý Hội đồng đóng góp nhiều ý kiến cho đợt nghiệm thu dé tài giai đoạn I nghiệm thu kết thúc đề tai Chủ nhiệm đề tài PGS.TS Đồng Thị Thanh Thu MỤC LỤC MỞ ĐẦU TONG QUAN TAI LIBU Trang 1 Téng quan vé protease vi sinh vật Ngudn nguyén liệu thu protease Ứng dụng protease Enzym thương mại 10 13 IL VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Phương pháp 2.1 Phương pháp tách chiết enzym 2.2 Phương pháp thu nhận enzym dạng bột 2.3 Xác định hoạt tính protease theo Anson 2.4 Dịnh lượng protease theo pp Lowry 2.5 Xác định hoạt độ đông tụ sữa 2.6 Định lượng N ~ tổng số pp Kjeldahl 2.7 Phương pháp chuẩn độ formol theo Sorensen 14 15 15 15 16 17 18 19 20 IH KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Tuyển chọn sơ VSV tổng hợp protease cao Xác định hoạt tính protease / chế phẩm enzym Nghiên cứu tổng hợp cảm ứng protease Thu nhận chế phẩm protease ~ xác định hoạt tính protease Xác định hoạt tính đơng tụ sữa Nghiên cứu sản xuất chế phẩm — VSV ứng dụng SX chao Nghiên cứu ứng dụng ché phdm protease đông tụ sữa Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm protease thủy phân protit IV KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ V TÀI LIỆU THAM KHẢO 22 21 28 33 36 38 55 MỞ ĐẦU Enzym tạo Enzym chất xúc tác sinh học có bần chất protein thiếu thành tế bào sinh vật, đồng vai trò quan trọng khơng thể có tham qúa trình trao đổi chất Tất chuyển hóa hóa sinh thể bên trong tế gia xúc tác enzym Enzym hoạt động xúc tác động mạnh, bào mà ngồi tế bào điều kiện thích hợp hoạt vào nhiều lĩnh điểu có ý nghĩa quan trọng việc ứng dụng enzym vực khác công nghiệp đời sống vật Nguồn nguyên liệu để sẩn xuất enzym thu nhận từ động vật, thực thực vật phức vi sinh vật Tuy nhiên việc khai thác enzym từ động vật, vấn để tạp, giá thành cao, việc sản xuất enzym từ vi sinh vật quan tâm nhiều Enzym từ vi sinh vật có ưu điểm bật sau : sử dụng lượng nhỏ - Hoạt tính enzym vị sinh vật tất cao, cần enzym chuyển hóa lượng lớn chất ~ Vi sinh vật có khả tổng hợp nhiều loại enzym khác ni dưỡng sinh vật - Tốc độ sinh sản vi sinh vật nhanh, môi trường giá thành chế đơn giản, rẻ tiền, dé kiếm thời gian thu enzym nhanh, phẩm enzym rẻ protease enzym Trong cơng nghệ sản xuất chế phẩm enzym, sau amylase nhiều kỹ nghệ quan trọng đứng hàng thứ hai Protease ứng dụng thực phẩm, kỹ nghệ sữa, dược phẩm, chất tẩy rửa.v.V Trong quy trình sản xuất nước mắm, nước chấm,tương chao.v.v., prOi€as€ cá, đậu nành góp phần rút ngắn thời gian thủy phân loại protein Trang | Trong quy trình sẩn xuất fromage , nguồn enzym đông tụ sữa sử dụng - rennin lấy từ ngăn thứ tư dày bê non tháng tuổi Nhưng sán lượng iromage ngày gia tăng , lượng rennin có nguồn gốc từ động vật không thé đáp ứng đủ nhu cầu mà cần phải có hỗ trợ protease ti’ vi sinh vật Để tài tiến hành nghiên cứu nhằm tạo chế phẩm enzym protease vi sinh vat ⁄“ * è x Ung dung công nghiệp thực phẩm nhằm dân dẫn thay nguồn enzym ngoại nhập Trang “ PHANI TONG QUAN TAI LIEU TONG QUÁT VỀ PROTEASE VI SINH VẬT : [ 1.2,5,6 ] 1,1 Khái niệm : Tế bào vi sinh vật có khả tổng hợp nhiễu loại enzym khác Các enzym xúc tác phan ứng tế bào Một số enzym có khả thấm qua màng tế bào để ngồi mơi trường gọi enzym ngoại bào, bào có enzym khơng ngồi gọi enzym nội Nhiéu vi sinh vat có khả tổng hợp mạnh protease, protease ngoại bào hay nội bào Protease thu nhận từ vi sinh vật đa dạng phong phú : - Aspergillopepsin : Aspergillus oryzae, A niger - Mucorpepsin (Mucor rennin) : Rhizomucor miehei, R -pusillus - Saccharopepsin : Saccharomyces cerevisiae - Bacillolysin : Bacillus subtilis - Subtilisin : Bacillus amyloliquafaciens Tính chất : { 4,8,9,11,13 ] Protease từ vi sinh vật có ưu điểm hoạt động khoảng pH rộng, chúng tổng hợp hai loại enzym endopeptidase exopeptidase, thủy phân đến §0% liên kết peptid protein Protease vi khuẩn hoạt động vùng pH hẹp (pH - 8) so với protease nấm mốc (pH - 11) Điểm đặc biệt quan trọng để phân biét cdc protease pH tối du Protease thị trường gồm ba loại protease kiểm tính, protease trung tinh va protease acid tinh « Protease kiểm tính : Nhiều chủng vi sinh vật tiết protcase kiểm tính ngoại bào quan trọng chẳng vi khudn Bacillus : B licheniformis, B.pumillus v.V.nấm mốc chủng Aspergillus nhiều Subtilisin : A.niger, A.sozae v.v., protease kiểm tính biết BPN va Subtilisin Navo sản xuất từ vi khuẩn amyloliquafaciens với đặc tính chịu nhiệt cao vào khoảng 70° C, bến vững mơi trường kiểm pHÍ vào khoảng 9- [ e trung % Protease trung tính : Các chủng vi sinh vật có khả tiết proteas tính ngoại bào vi khuẩn B.subiilis, B.sereus V.V., nấm mốc A.oryzae, A.sozae v.v Protease trung tính có khodng pHop rat hẹp, không bến với nhiệt độ cao hoạt tính có diện protease kiểm « Protease acid tinh : Protease acid tinh hay cồn gọi aspartic protease, pHụạ, từ ứng dụng nhiều kỹ nghệ fromage, dược thực phẩm Khoảng - Các vi sinh vật có khả tiết protease acid gm Mucor pusillus, M.miehei, | i | tị Penicillium janthinellum, P,roqueforti, A.oryzae, Peseudomonas sp v.v Protesae vi khudn : [ 4,5,6,8,13 ] 1.3.1 Vài nét vé vikhudn: ị ~ Vị khuẩn vi sinh vật thuộc nhóm procaryote, thể cấu tạo đơn giản gồm đơn bào đa bào, sinh sản chủ yếu cách phân đơi Vi khuẩn có ba loại hình dạng :cầu khuẩn (coccus), trực khuẩn xoắn khuẩn ngồi (spirilum), cịn có nhiều dạng trung gian cầu trực khuẩn (coccobacille), phay khuẩn (vibrio) Vi khuẩn có mặt khắp nơi : khơng khí, đất, nước, thể động thực vật v.v Tuy có đời sống ngắn ngủi sức sống sinh sản mạnh mẽ Có lồi vi khuẩn gây hại cho người, động vật thực vật có if lồi hữu ích đời sống người dùng làm nguồn nguyên liệu để sản xuất chế phẩm enzym, vitamin, acid hữu v.v 1.3.2 Tinh chit protease vi khuẩn : [ 12,4} Protease ví khuẩn chia làm hai loại : protease trung tính vi khuẩn trình bày bang 1: protease kiểm Các tính chat cla protease Bảng : Một số tính chất cđa protease từ vi khuẩn Tính chất PH hoạt động PH tối thích “Tác nhân ức chế Những chất đặc trưng Protease kiểm khuẩn | Protease trung tính vi khuẩn 6-9 71 : 6-8 1.5-9.5 DIFP, PMSF EDTA, Sodium, Dodecy! sulfat Ester, amide, peptid Peptid va éster Ghi : DIFP :diisopropy! fluorophosphat b Ỉ EDTA : ethylenediaminetetraacetic acid PMSF : phenylmethanesulfony! fluoride | 1.4 Protease nấm mốc : [ 1,4,5,6] 1.41, Vài nết nấm mốc : mốc có cấu m nhân that (eucaryote) Nấm nhó ộc thu vật sinh Nấm mốc tai nấm h ngăn hay không khơng tạo vác có n, triể t phá ty tạo khuẩn tử bào tử, tiết bào tử ) bào tử : bào tử vơ tính ( đính Nấm mốc có hai loại bào hữu tính, người ta tử ) Dựa vào sinh sản bào g nan tử, bào hợp p hữu tính (tiế c xếp nấm mốc vào lớp o hạt ng đất, bào tử nấm thường the tro t biệ đặc , nơi p khắ có Nấm mốc chất Một cực vào việc phân giải tích gia m tha ng khí, bụi bay khơng acid ời làm tương, sẵn xuất ngư g sốn đời vụ c phụ g số nấm mốc sử dụn kháng sinh Một số nấm mốc trưởng, acid amin chất hữu cơ, vitamin, chất sinh vật n người, động vật thực trê h bện gây n nhâ yên lại ngu oryzae : œ Tổng quan vé Aspergillus sợi conidi dài khác biệt với ng cuố có g, vàn mốc óm - Đặc điểm : Thuộc nh c vàng nhạt đến vàng đậm hoặ màu g Bôn ỗi chu nh idi tạo nấm dinh dưỡng, nhạt già thạch u n đổi thành màu lục pha nâ vàng hoa cau Khuẩn lạc biế chuyển ; lic đầu conidi có hình elip, um 4.5 từ h kín ng đườ có Czapek Conidi xù xì khơng dẫn thành hình cầu, nhấn lease từ nấm mốc : 1.4.2 Tính chất số pro tease Vì động rong hon so với pro t hoạ pH ng oả kh có Protease nấm mốc trung loai : protease acid, protease ba làm a chi thé có mốc khuẩn Protease nấm tinh va protease kiểm tease tt nấm mốc Bảng : Tính chất số pro PH thích hợp 3-45 Asp.saitoi ‘Asp.oryzae (protease acid) ‘Asp.oryzae (protesae trung tinh) Aip.oryzae (protease kiểm) Paccitomyces varioti Rhizopus chinensis Mucor pusillus L— Hemoglobin 3-4 5.5 - Tố 6-9.5 35-55 35-45 PH én dish Cơ chất Cơ chất Vi sinh vật Casein 25-3 2-5 25-3 65-10 7-8 3-5 36 nimide Ghi chi : NBS : N-bromosucci NBS EDTA T7 29-33 Chất ức chế DIFP 3.8-6.5 3-6 1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến tạo thành pro(ease nấm mốc [ 1,6,14,20} 1.4.3.1 Nhiệt độ: Nhiệt độ ánh hưởng đến phát triển nấm mốc khả tổng hợp enzyme cia chúng tính chất eozyme Hầu hết nấm mốc phát triển thích hợp nhiệt độ 22 — 32"C Ở số loài nấm Asp cardidus hay MucOr Renninus tăng nhiệt độ đến 36°C, làm hoàn toàn giảm khả động tụ sữa enzym Nhiệt độ cao dé làm hồng cấu trúc enzyme, gây giảm hoạt tinh xúc tác enzym H Shinmyo cho rang sy tong hdp protease tif Asp niger phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy Hiệu suất tổng hợp protease chúng Aspergillus tang giảm nhiệt độ nuôi cấy từ 30 - 32°C xuống 22 - 24°C 1.4.3.2 Độ Ẩm môi trường: Khi nuôi cấy nấm mốc phương pháp bể mặt, độ ấm yếu tố cần thiết cho sinh sắn nấm mốc Khi độ ẩm mơi trường thấp hệ sợi nấm mốc mọc yếu, sinh bào tử, thời gian sinh trưởng nấm mốc bị hạn chế, ảnh hưởng đến tạo thành enzyme nấm mốc i i : Độ ẩm thích hợp để thu canh trường nấm mốc có hàm lượng enzyme cao 53 - 70% phụ thuộc vào tính chất sinh lý chủng giống, cấu trúc học môi trường điều kiện nuôi cấy 1.4.3.2 Thời gian nuôi cấy Khi nuôi cấy nấm mốc Asperillus phương pháp bể mặt, tác gid Lesiacova (1965), Shilova (1967), Teaimina (1969) nghiên cứu ảnh hưởng thời gian ni cấy đến tích tụ enzyme Qua nghiên cứu, tác giả ghỉ nhận H thời gian nuôi cấy nấm mốc phụ thuộc vào chúng nấm mốc phụ thuộc vào ti — 30 ni cấy tích tụ lượng amylase lớn Sau bắt dau tich tu protease Hf loại enzyme chủng giống Như chủng nấm mốc Aspergillus oryzae sau 21 đạt cực đại giai đoạn ban đầu tạo thành bào tử Thời gian sinh tổng hợp protease thường giai đoạn bắt đầu tạo nhiều bào tử, Theo Doeokhov vi Conovaloy (1968), tổng hợp protcase acid nấm mốc xẩy yếu pha sinh trưởng, sau nuôi 24 khoảng 70% tống hợp enzyme tạo thành Với đa số nấm mốc thời gian nuôi từ 35 — 42 nuôi phương pháp bể mặt, nuôi phương pháp bẻ sâu thời gian thường khoảng 40 - 48 vào ị : 73.1 Ảnh hưởng nơng độ protease tới q trình thuỷ phân cá cơm Hàm lượng protein hoà tan 250 y =0/2196x” -4,8587x + 41.5254) ~ 173/27Ẻ + 371/3x - 134,86 200 +5 s § 150 6§ © 100 s y =-0/0852x2 + 128R6x- 683733) + 19, 1894 + 86,220 50 RỶ= 09996 Thời gian thuỷ phân (giờ) & Mẫu OMẫu4 ® Mẫu ⧠Mẫu * Miu { 12 T 10 r T T r 93 21, Ảnh hưởng tỷ lệ CPE đến hàm lượng protein hòa tan mẫu thủy phân cá cơm Đồ (Ham lượng protein hịa tan ban đầu 34,13mg/g mẫu ! mẫu 1: 64 mẫu 2: 0,1%; mẫu 3: 0,2%; mẫu 4: 0,3% mẫu 5: 0,4% enzyme so với cá nguyên liệu Quá trình thuỷ phân tiến hành nhiệt độ phòng 450 y = -0,1451x* + 4,1462x7 - 43,746x) + 224,91x - 86.186 (% so với bạn đầu) 400 Hàm lượng peptid pH tự nhiên Ri = 0.9989 350 300 250 200 150 y =0,2473x* - 3,7548x" + 19, L46x" - 16,452x + 1006 T + r + tờ 0+ R? = 0,9928 10 1? Thời gian thuỷ phân (giờ) XMiul MMu2 đMu3 OMõu4 &MuĐ th 22: nh hng ca tỷ lệ CPE đến hàm lượng peptid mẫu thủy phân cá cơm (Hàm lượng peptid ban đầu 0,364mg/g mẫu ) Bảng 47 Ảnh hưởng nỗng độ protease B.subsilis S5 tới hàm lương protein hoà tan mẫu thuỷ phân cá Thời Bran thuỷ phan (eid) Mẫu ] Mẫu Mẫu Mẫu Miu Protein | Protein | Protein | Protein | Protein | Protein | Protein } Protein | Protein | Protein (mg/g | (%s0 | mẫu) với (mg/g | mẫu) ban (%so | với ban đâu) (mgig | mẫu) (%so | với ban đầu) (mgýg | mẫu) (%so | (mg/g | với mẫu) ban đầu) (% so với { đầu) ; bạn đầu) | 34,13 100,0 | 34,13 100,0 | 34.13 100,0 | 34.13 100,0 | 34,13 100,0 36,35 106,5 | 39,97 117,1 | 54,88 160,8 | 57,54 | 168,6 | 60,24 | 176,5 38,77 113,6 | 43,96 128,8 | 61,50 180,2 | 64,95 190,3 68,16 | 199,7 41,06 1203 | 48,40 1418 | 67/71 198,4 | 70,58 | 2068 | 7434 | 217.8 44,81 1313 | 53,48 156/7 | 71,88 | 2106 | 73,69 | 215/9 | 78,19 | 229,1 10 49,49 145.0 | 5788 | 1696 | 73/99 | 2168 | 7724 | 2263 | 80,38 2355 12 53,62 157,1 1777 | 220,1 80/03 82.49 2417) 60,65 7312 | ; 2345 ị Bang 48 Ảnh hưởng nông độ protease B.subtilis S5 téi hàm lương peptid mẫu thuỷ phân cá cơm gian onan Giờ) Mẫu I Mẫu Mẫu Mẫu Peptid | Peptid | Peptid | peptid | peptid | peptid | peptid | peptid | peptid (mele (% so mẫu) | với bạn | Ị (mele mẫu) đầu) (% so với (gis mẫu) ban (® so với (mel (% so mau) với pepi | (nee | (% so i mẫu) ban đầu) ì Mẫu đầu) | với | ban | Ì đầu) 0,364 100,0 | 0,364 100,0 | 0,364 100,0 0,364 0,429 1179 | 0,643 176,6 | 0,648 1780 | 0,511 140,5 0,859 | 236,L 0909 | 0,618 169,7 0,962 | 264,2 § 0,639 175,6 1,042 | | 100,0 | 0,364 † 0/756 | 2078 | 0,784 | 215,3 249,6 1,051 288,7 1/094 | 300,6 1,038 | 285,1 1,208 331,8 1/2241 | 340,8 286,4 1,120 | 307/7 1,301 357,5 1,340 | 368,1 | 3868 | 10 0,744 | 2043 1110 | 304,9 1269 | 348,6 1408 0.833 228.8 1234 | 3391 1460 | 401.2 1505 | 413,4 1455 100,0 ị 399,6 1/520 | 41745 | AA Thời 60 300 y = 0,0242x" - 1,6712x" + 14,042x? + 5,43x + 82,871 & _ 250 soo 2's § 200 2s "Eis 150 sp 8 lo a8 Š = y=0/0178x' - 0,1543x” + 8,1958x7 - 12,503x + 105.06 * 0+3 r T * Miu | t8 Mẫu R® = 0,9999 r ® Mẫu r § 12 + 10 “Thời gian thuỷ phân (giờ) © Mẫu 4 Mau$ Dé thi 23 Anh hu@ng ciia tỷ lệ CPE dén ham lwong N,, cla cde mau thủy phân cá cơm (Ham lượng N„„ ban đầu 0,296mg/g mẫu) Bảng 49 Ảnh hưởng nồng độ protease B.subiilis S5 tới hàm lương N;¿ mẫu thuỷ phân cá cơm Thời - thu p lần ‡ (giờ) Mẫu I Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu | Nu | Na | NG | Nà | Ne | Ng | Nà | NG | NH | Nà | (mg/e | (%so | (mee | (%s0 | (mele | (so | (mele | (so | (male | (@gg | x § i | mẫu) | 6296 | với mẫu) với mẫu) với i j maw} ị | với | mẫu I | với | ị ban | đâu | ! ban ban đầu đầu đầu đầu 100 | 0296 | 100 | 0296 | 100 | 0296 | 100 | 0,296 | 100 | ban bạn ¡ : | 0317 | 1072 | 0346 | 117 | 0368 | 1242 | 0389 | 1314 | 0413 | 1396 | 9/361 | 1221 | 0456 | 1542 | 0472 | 1594 | 0/498 | 1683 | 0531 | 1794 | 0424 | 1433 | 0560 | 189L | 0606 | 2046 | 0653 ! 2206 | 0,673 | 227.8 § j 0,485 | 1637 | 0649 | 2193 | 0721 | 2435 | 0720 | 2601 | 0805 | 2718 1o | 0,349 | 185,6 | 0707 | 2387 | 0757 | 2559 | 0,836 | 2825 | 0/853 | 2881 12 | 0691 | 2031 | 0740 | 2501 | 0771 | 2606 | 0853 | 2883 | 0871 | 2942 61 7.3.2 Ánh hưởng nhiệt độ tới trình thuỷ phân cá cơm (% so với ban dau) Hàm lượng protein hoà tan protease B.subtilis SS 500 ý =0/1591x' -20232 + 80333x) + 49273x + 2Nó R? = 0.9993 400 300 200 Y= -O,0852x" + £,3886x° - 6.837527 + 19,1898 + 86.229 RẺ = 0/9996 100 T x 0+ Maul âMu2 đ Mẫu ©Mẫu4 l2 10 “Thời gian thuỷ phân (giờ) ^ Mẫu a Mẫu tan Đồ thị 24 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng protein hòa mẫu thủy phân cá cơm bing protease B.subtilis SS ) (Hàm lượng protein hòa tan ban đầu 34,14mg/g mẫu 1000 y=-10364x" +9,1152x” + 05x) + 38,724 + 58,314 R? = 0,9965 Lộ = T ° T đ Mu I âMu2 & Mu y=0/2473X)- 3/7548) + 19,146x - 16/4524 + 100,6 Re 20,9928 v T r © Mẫu 10 12 Thời gian thuỷ phân (giờ) ^ Mẫu A Mẫu hàm lượng peptid mẫu Đề thị 25 Ảnh hưởng nhiệt độ đến thủy phân cá cơm bing protease B.subllis S5 (Ham lượng peptid ban đầu 0,366mg/g mau’) Bang 50 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hàm lượng protein hoà tan mẫu thuỷ phân cá cơm protease B.subtilis S5 Thời Miu | ‘ "°F u li Miu Mẫu Mẫu Mẫu6 protein | Protein | Protein | Protein } Protein | Peutein | Protein | Protein | Proteiz | Protein | Protein | Protein (mg, ‘ ø (% so mẫu) | egi Ị (mg/g với | mẫu) | ban đầu) (sọ (mg/g với | mẫu) | ban dâu) (# sơ (mg/g (% so với | mẫu | (mg/g với | mẫu | ban ban đầu) đầu) (% ser (mg/g với | mẫuy | ( so với ban ban đâu) đấu) 34,14 | 100,0 | 3414 | 100,0 | 3414 | 109/0 | 344 | 1000 | 34/14 | 190/0 | 3414 | 1000) 36.36 | 106,5 | 57,56 | 168/6 | 3772 | 110/5 | 56,47 | 1654 | 3708 | 1086 | sa.or | 158.2 | i £38.78 113,6 | 6497 | 190.3 | 49,06 | 143.7 | 82.58 | 2419 | 4752 | 1392 | 8H12 | 26 | | 2L07 | 1203 | 7060 | 2068 | 57.12 | 1673 | 98.63 | 288.9 | S67 | 165,4 : 94,05 | 7755 | $ Ï 2483 | gia | 732L | 2159 | 625 | 1926 | H23 | 3304 | 6207 | t8L8 | 10345 | 300,1 | 10} 49,50 | 1450 | 77126 | 2263 | 75A1 | 2200 | 131,92 | 3864 | 7146 | 209/3 | 13574 | 3916 | i + | 33.63 57,4 | 8006 | 2345 | 8204 | 2403 | 13018 | 3813 849 | 2382 +¡ 160,63 | 470,5 J Lửa Ae ` Bảng 51 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hàm lượng peptid mau thuy phan cd com bing protease B.subtilis S5 Mẫu Mẫu Mẫu3 Mẫu2 Mẫu | [mu | Mẫu | peptid | Peptid | peptid | Peptid | peptid | Peptid | peptid | Peptid | peptid | Peptid | peptid | Peptid ng (mglg | (%s0 | (meg | (so | Gmelg | eso | (mg | (so | (mgg | (so | ingle | (eso mẫu) | vảiban với mẫu) với mẫu) với mẫu} với mẫu) với mẫu) oe P a tran ban ww đầu) dấu) | tan i đầu) ban i | | Ị dau) "“ | 0,366 100.0 | |0,366 | 100,6 | 0.366 | 100,0 | 0/366 | 100,0 | 0,366 i — —L — nr Ì 055 | 200.8 | 0,73 | 149.6 | 0,55 | 207.8 | 076 11129] | 943 Fg L + Í | { — = ae at ƒ—— ! i ‡ | 051 | 140,5 | 1,06 | 288,7 | 0,73 | 200.8 | 1,25 | 340,4 | 0,79 0,62 | 169,7 | 1,24 | 331.8 | 0,86 | 236,2 | 1,89 | 516,5 | 0,89 0,64 | 175/6 | 1,31 | 357,5 | 100 | 272.4) 2,72 | 743.4 | 1/04 | 283,5) 2.79 10 0,75 | 204,3 | 1,42 | 386,8 | 1,24 | 339.51 3,05 | 832.1 125 | 341.9} 3,21 | 084 |2288 | Lối oc ee da ee |413,4| bl 1.36 | 3724] se 3.09 18434} Fn bene ——-——] ke 513,8 | | 763,6 ‡ 876.2 Ị | +i tae | 3978| 3.47 | 9486 | heed + 63 (% so với ban đầu) Hàm lượng nit axít amin 700 ¬ y =-LL6Lx! + 14/9454) - $5,904x? + 148,02x - 4/7714 R= 0,9991 600 + 500 — ea 400 + 300 206 ¥ = 0.01 78x" - 0,7543x" + 819584" - (2.503% + 105,06 R?=0,9999 r r r T too ¢ ~ 10 12 “Thời gian thuỷ phân (giờ) @Miul Đồ thị26 S©Mẫu2 ®Mẫu3 OMẫu4 aMiuS AMẫu6 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hàm lượng N,„ mẫu thủy phan c4 com bing protease B.subtilis $5 (Hàm lượng N„„ ban đầu 0,295mg/g mẫu } Bảng 52 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hàm lượng N,„ mẫu thuỷ phan ca com bang protease B.subtilis $5 Trai} = Maul thea Now | Ne | Na | Ne | Na | Nw | Ne | Ne | Nu ne mạn (mg | g Miu2 Mẫu Mẫu Mins (% | @g | (% | @ng | (% | ứng | (% | ứng | so SỐ so so 8 | Maué Na | Nu ENy! (% | (mg | sỐ SỐ ¿ ¡ (88 | mầu | với | mẫu | với | mẫu) | với | mẫu) | với | mẫu | với | mẫu | với ‡ 10295 | | 032 | | 036 — | | 042 | ban ban ban ban ban bạn đầu) đâu) đầu) đâu) đầu) đầu) 100,0 | |1072| |1221| 143,3 | | 0,48 | 163.7] 10 | 055 0/295 | 039 050 | 0,65 | 100,0 | |1314| 1683 | 220,6 | 0295 | 033 | 042 | 0,66 | 100,0 | ¡107 | 142/8 | —223.2 | 0/295'| 051 | 072 1,02 | 0,77 | 260,1 | 0,72 | 245.5 | 145 100,0 | 172.6 | |2427 | 346,71 0/295 | 100,0 | 0295 | 100,0 0,32 | 109.9! 050 | 168.4 040 | 1312 to 0,57 | 193.2 |4913 | 069 | 232.9 |185,6 | 0,83 | 282,5 | 076 | 257.6 | 158 | 534,7| 0.75 | 2547 L 12 | 0,60 | 203,1 | 0,85 | 288,3 | 0,80 | 272.1 | 1,87 | 632,4 | 077 | 2604 64 Ghi : Về nhiệt độ mẫu thí nghiệm : Để chọn nhiệt độ thích hợp cho q trình thủy phân cá cơm protease B.subrilis $5, tiến hành mẫu thí nghiệm: mẫu 1: mẫu đối chứng thủy phân nhiệt độ thường, mẫu 2: mẫu có bổ sung protease thủy phân nhiệt độ thường; mẫu 3: mẫu đối chứng thủy phân nhiệt độ 50°C, mẫu 4: mẫu có bổ sung protease thủy phân nhiệt độ 50C; mẫu 5: mẫu đối chứng thúy phân nhiệt độ 50°C gid ddu sau dé tién hành nhiệt độ phịng, mẫu 6: mẫu có bổ sung protease thủy phân nhiệt độ 50°C đầu sau tiến hành nhiệt độ phịng Các mẫu thí nghiệm đều sử dụng 5kg cá cơm xay, bổ sung 0,2% CPE thủy phân pH tự nhiên cá Sau lấy mẫu theo thời gian thủy phân để phân tích hố học Nhận xét biện luận kết qúa : « Về lượng CPE sử dụng : Qua kết qủa trình bày Bảng 47,48,49 Đồ thị 21,22,23, rút kết luận lượng CPE thích hợp cho qúa trình thủy phân protein cá 0,2 % So với nguyên liệu cá, tương ứng với lượng CPE , lượng protein hòa tan lương peptit lượng axit amin đạt cao so với trường hợp khúc « - Về nhiệt độ thủy phân : Qua kết qổa trình bày Bảng 50,51,52, Đồ thị 24,25,26, chúng tơi nhận thấy qúa trình thủy phân nhiệt độ 50°C qúa trình thủy phần nhiệt độ 50°C sau thủy phân nhiệt độ thường đạt hiệu suất thủy phân cao Tuy nhiên phương án thủy phân liên tục nhiệt độ 50°C thời gian dai tất khó khăn điểu kiện sẵn xuất thực tế Việt nam „vì phí giá thành sắn phẩm tăng cao Từ lý chọn phương án sử dụng thủy phân nhiệt độ 50°C thời gian ngắn sau thủy phần nhiệt độ thường thời gian đài điều khả thi qúa trình lên men sản xuất nước mắm thực tế có kết hợp phơi nắng có nhiệt độ cao lên men nhiệt độ thường, 65 1.4 Thử nghiệm sẩn xuất nước mắm cá cơm protease B.subHls SS Thí nghiệm tiến hành thử sản xuất nước mắm phương pháp sử dụng protease B.subiilis để thuỷ phân cá cơm qui mô nhỏ với cỡ mẫu 20kg, thông số khác tương tự kết tìm Sau 21 ngày thuỷ phân cá cơm thường (Stolephorus commersonii) protease B.subilis $5 chế phẩm protease khác, thu nước mắm cá cơm Kết phân tích thành phẩn axit amin nước mắm cá cơm sản xuất theo phương pháp truyền thống kéo rút sau tháng loại nước mắm cá cơm sản xuất phương pháp sử dụng: bảng 53 protease B.subiilis mẫu sử dụng enzyme kéo rút sau 21 ngày thể biện Ư.subiilis SŠ có hàm lượng axit amin cao mẫu không sử dung enzyme Bảng 53 Thành phần axit amin nước mắm cá cơm sản xuất theo phương pháp truyền thống phương pháp sử dụng enzyme (Ig/ml) q ;m Ï ` Tên mắt amin" | Alanine | | Giyeinc i + Er | + ios | j| & |Aminehu tyriethun axiL Hàm lượng axit amin (jig/ml) Mẫu a I | Mẫu 12 i " ,„ Mân3ẫu | Mâu4 | os | axit amin 1287 |2215 |1199 26534 | 6605 [99,7 |1363 |Í 12 | Hydro- |4681 | 46L9 [2011 | 142.2 | — ! i HN |Mẫu¡ | Mẫu2 | Mẫu: 3| Mẫu a4 } | : _ 5; Xyproline [isis || 13 Prem! L3 | Serine cục | 10 | AspardcaxiL| ng 1Í | Methionine 391,9 2623 vl 79, 379.0 544 | 62.2 No{2556 | 183, 356 H 886 1143 fuss | 1432 | 335 | 93,5 36i,2 : -alanine B¬¬¬—- Si Ị „ Tig | Tyrosine le dt 151,8 20 ÍTrgpiePhar I Téng cong 15735 - h Guta | vatine 2492 | 2569 | 375.5 |TT 4317 || | ta | | Glutamic axit | Levine 1076 | 1807 |2283 | 4009 15 | Omithine | Boleu 161,0 |2436 |3910 | 1737 Soleucine |Í is | Lysine | Norleuci 485 | 120 1536 | 9L, sôi orieucine | 49 ie WG Histidine L & | Threonine Feonine Ghỉ chÚ: | | 129,5 | 224/7 | 2045 | 1661 | | 1573 bee | Ị m i ot 196,8 | H84 | 13282 | 408.7 665,4 | 530i | 3126.2 | 1175.7 sac : 3731 215,3 | 5874 IR : 16744 | 958.7 | i| 169,3 |i 133.4 3562,0 i 3767.4 | 10004,0 | 5008.6 - Mẫu 2: Nước mắm cá cơm xay sản xuất theo phương pháp truyền thống, - Mẫu 3: Nước mắm cá cơm xay sắn xuất theo phương phdp ding protease B.subtilis S5 protease B.subtilis 85 7i _ Vău |: Nước mắm cá cơm sản xuất theo phương pháp truyền thống - Mẫu 4: Nước mắm L cá cơm nguyên sản xuất theo phương pháp dùng 66 : Bảng 54: So sánh kết qủa sẵn xuất nước mắm Mẫu thử nghiệm Thông số kỹ thuật 3.000 Khối lượng cá (kg) Số mẫu Tỷ lệ muối bổ sung ban đầu (% so với ~ Mẫu đối chứng | 2.000 5 Lúc Ngay ban đầu 0,3 cA) Thời gian cho muối Tỷ lệ enzyme protease B.subtilis S5 (% so với cá nguyên liệu) | Nhiệt độ thuỷ phân - Nhiệt độ thường 540 + 20 | lượng loại đạm nước (tính trung bình cho tất cà i loại nước mắm) : Nitd axit amin (gN/lit) | 530 + 20 470 +20 Lượng nước mắm thứ phẩm i T80+15 630 + 20 Lượng nước cốt (Lít /1000kg cá) - 120+7 35+5 (ngây) - Nito tng s6 (gNAit) Ì Nhiệt độ thường 2142 Thời gian chu kỳ chế biến | mắm | tiếp nhiệt | tiếp nhiệt i phơi nắng phơi nắng i Thời gian thuỷ phân (ngày) Ham T2 TT | | 18/28+ 015 23+ 0,15 12,86 + 0,15 : 15,26 + 0,15 3,884 0,10 | 4182010 — Nạn; (gNHÒ Trạng thái cẩm quan nước mắm | Trong suốt, mẫu | Trong suốt, mầu cánh cốt dén, nước mắm mùi dán, |cánh mùi vừa, vị | nước mấm đặc ! trưng, có hậu vị có hậu Độ mặn nước mắm (g NaCULít) Hàm lượng axit nước mắm cốt 265+ 4,67 + 0,15 265 + 4,45 +0,15 (tính theo g axit acetic/lit) Ti két qua & bang 3.28 cho thay mẫu thử nghiệm sử dụng protease B.subuilis $5 để sản xuất nước mắm cá cơm có thời gian chế biến ngắn lượng nước mắm cốt thu cao gấp 1,8 lần so với phương pháp sán xuất nước mắm 67 truyền thống Kết giải thích tác động protease bổ sung làm thịt cá bị thuỷ phân nhanh triệt để 7.5 Để xuất qui trình sản xuất nước mắm Từ kết nghiên cứu để xuất qui trình sản xuất nước mắm ngắn ngày sau: « Sodé 4, Nguyên liệu | Xay nhd Muéian = [> | Ỉ | Thuy phan Protease B subtilis SS Kéo rút, lọc Nước muối 22° Bé [—_$ Dich chiết | t Bal Dich chiét Ỳ Ba Dich chiét L — L——>y Phá bã Y Xác mắm Y Phân bón mm Pha đấu Y Đóng chai Y Thành phẩm Quy trình sản xuất nước mắm cá cơm 68 8- TINH TOAN SƠ BỘ GIÁ THÀNH CHẾ PHẨM ENZYM Từ thí nghiệm chúng tơi dự tính sơ giá thành sản phẩm sau : a/ CPE-TN ~canh trường : Tính cho mẻ SX từ 10 kg nguyên liệu ban đâu: + Nguyên liệu cho mơi trường ni VSV Bột ngơ , cấm, ngũ cốc giá trung bình _ 7.000đ/kgx l0 kg =70.000 đ + Chất cảm ứng ( có ): bột cá ,bột đậu nành 15.000đ/kgx 0,8kg=12.000đ + Điện , nước 25.000đ + Khoáng chất , chất bổ sung đinh dưỡng cho VSV _ ( vi lượng ) 15.000đ + Céng LD 25.000đ + Ơng giống VSV 30.000đ + Chi phí phát sinh khác 10.000đ Cộng 187.000đ Trung bình khí nuôi cấy VSV 10 kg môi trường thu 13 kg sinh khối( canh trudng) giá trung bình/ Ikg 187.000đ/ 13kg = 14.384đ/kgCPE ( Dạng canh trường ) b- Chế phẩm sau tủa dung mơi ( ví dụ sử dụng ), có độ tỉnh khiết cao hoạt độ cao nhiều Từ 10 kg canh trường x 14.384 đ /kg Cần 30 lít cổn kỹ thuật 96 độ x 8.000d/lit ( để kết tủa edzym)—— = = 143.840 đ 240.000đ crrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr Cộng 383.840 đ Hiệu suất thu nhận CPE trung bình từ canh trường khoảng 10% Vậy từ ¡0 kg canh trường thu Ikg CPE vdi gid 383.840 d/kg(sau nia) +⁄/ Giá tham khảo sản phẩm enzym thị trường ( giá trung bình ) Glucoamilase 30 USD/kg tưởng đương 471.000đ VN/kg Amilase 250 USD/kg _ 3.925.000đ VN /kg Glucoizomerase Protease tẩy rửa 250 USD /kg 100 USD/kg _ _ 3.925.000đ VN/kg 1.570.000đ VN/kg Rennet 5.000 USD/kg _ 7.850.000đ VN/kg Động vật Rennet từ VSV 500 USD/kg 785.000đ VN/kg Ti bang nhận thấy CPE-TN chúng tơi có giá thành thấp nhiều hoạt tính cao xấp xỉ sản phẩm thương mai ( ahư phần trình bày) 69 IV KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ !- KẾT LUẬN Từ kết qủa , chúng tơi có số kết luận sau : 1.1 Từ4 chủng nấm mốc chủng vi khuẩn tiến hành tuyến chọn sơ chủng có tổng hợp protease cao :Asp.uryzue vd Buc subtilis để thu nhận protease, nghiên cứu thời gian tối ưu để tổng hợp protease cao 1.2.Nghiên cứu cảm ứng tổng hợp protease cao với chất cảm ứng: bột cá, bột đậu nành, pepton, chọn lựa chất cẩm ứng phù hợp 1.3.Nghiên cứu thu nhận protease dạng bột với tác nhân tủa khác : cần, aceton, sulphatamon; từ chọn lựa tác nhân tủa phù hợp etanol 1.4.Xác định hoạt tính protease chế phẩm enzym thu với tác nhân tủa khác 1.5 Xác hoạt tính đơng tụ sữa chế phẩm enzym protease so sánh với enzym ngoại nhập, đạt kết qủa cao 1.6 Bước đầu nghiên cứu sx chế phẩm E sử dụng sx chao, bước đầu tăng nhiên thủy phân tạo N-amin cao điểu kiện lên men tự 1.7 Ứng dụng chế phẩm protease thủy phân protit cá đậu nành 1.8 Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzym với dạng: - Bột enzym protease thô từ canh trường - Botenzym protease sau kết tủa với tác nhân khác - Bot bao tl Mucor sp ding sx chao - Chế phẩm protease dùng sx chao - Chế phẩm protease đông tụ sữa dùng chế biến sữa Khi so sánh với chế phẩm enzym nhập ngoại hoạt tinh protease va hoat tinh Udng tụ sữa cao với giá thành hạ so với enzym nhập ngoại 70 1.9- Ứng dụng chế phẩm protease - V§V sở sắn xuất 1.9.1- Ứng dụng chế phẩm 4ucor qúa trình sẩn xuất chao sở sản xuất chao Hoa sen, với kết qủa làm tăng hàm lượng N-amin , N-formoi qúa trình lên men sản phẩm cuối, đặc biệt sử dụng bổ sung bột bào tử Mucor hạn chế nhiễm mốc lạ, bảo đẩm an toàn hương vị thơm ngon cho sẵn phẩm chao 1.9.2- Ứng dụng chế phẩm protease —VSV qúa trình đơng tụ loại sữa khác , kết qủa chế phẩm protease —VSV có khả đơng tụ loại sữa khác , điều đặt sở cho ứng dụng protease công nghiệp chế biến sữa Việt nam 1.9.3- Ứng dụng chế phẩm protease B.subiilis thủy phân protein-cá, kết qủa sử dụng protease bổ sung làm cho qúa trình thủy phân nhanh hầm lượng axitamin tự đo tăng lên so với trường hợp không bổ sung enzym , rút ngấn thời gian sx nước mắm Bước đầu xây dựng quy trình thử nghiệm sx nước mắm cá cơm ngắn ngày xí nghiệp thủy sản với việc sử dụng chế phẩm enzym-từ B.subtilis với tiêu chất lượng thành phần axit amin cao so với phương pháp lên men truyền thống 2- ĐỀ NGHỊ _ Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng nhiều chế phẩm enzym ~VSV vào qúa trình sx thực phẩm sở sx thực tế, nhằm góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm - Xây dựng quy trình sx loại enzym khác từ VSV với quy mô lớn hơn, nhằm ứng dụng nhiều qúa trình sx ,thay dẫn dẫn sản phẩm enzym nhập ngoại TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiển cộng tác (1998), Công nghệ enzym NXB ~ Nông nghiệp TPHCM Nguyễn Hữu Chấn (1996), Enzym = xúc tác sinh học NXB — Y học Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vị sinh vật NXB — Khoa học kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Thanh Dat (1996), Vi sinh vat hoc NXB - Giáo 5, Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ ví sinh vật NXB ~ duc ĐH Quốc gia TPHCM Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzym NXB - ĐH Quốc gia TPHCM Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành Sinh hóa NXB ~ Khoa học kỹ thuật Hà Nội Trân Minh Tâm (2000), Công nghệ vi sinh ứng dụng NXB — Nông nghiệp Nguyễn Tiến Thắng, Bezborodov A.M cộng tác (1994), Công nghệ sinh học số ứng dụng Việt nam NXB — Nơng nghiệp 10 Đồng Thị Thanh Thu (2001), Sinh hóa NXB — ĐH Khoa học Tự Nhiên TPHCM 11 Đồng Thị Thanh Thu (2002), Sinh hóa ứng dựng NXB - ĐH Quốc gia TPHCM 12 Lê Ngọc Tú cộng tác (1998), Hóa sinh cơng nghiệp NXB - Khoa học kỹ thuật Hà Nội m vi sinh vật 13 Lê Ngọc Tú, Phạm Trân Châu (1982), Enzy NXB - Khoa học kỹ thuật Hà Nội 14 Fordham I.R Use (1995), enzyme in industry / proteins Food Sci Tech Abst Vol 27 No IL 15 Fox P.F (1991), Food Enzymology, Vol EL sevier Science Publishers, LTD, England 16 Klyszeiko St (1988), Cwiczenia University Biochemii Lodz ~ Polska 17 Reed G and T.W Nagodawithana Enzymes, (1995), biomas, food and feed VH.C Weinheim, Germany 18 Whitaker R.J (1990), “New and Future uses of enzymes ut food processing”, Food biotechnology, Vol 19 Wolfgang Gerhartz (1990), Enzymes in Industry VCH Publishers, New York, USA tease.hitm ropro 20 http://delphi.phys.univ-tours.fr/prolysis/int ecamet.gif ges/m 21 http://delphi.phys.univ-tours.fr/prolysis/Ima 22 ngi/Aspergillus http://www.truman.edu/-jherrera/anamorphicfu oryzae/Aspergillus oryzae.htm