Nghiên cứu sản xuất các chế phẩm enzym protease từ vi sinh vật để ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm

SỞ KHOA HỌC - CÔNG NGHỆ TP HỖ CHI MINH BÁO CÁO TIẾN ĐỘ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI (GIAIDOAN I) TÊN ĐỀ TÀI : NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÁC CHẾ PHẨM ENZYM PROTEASE TU VI SINH VẬT DE UNG DUNG TRONG LINH VUC CONG NGHE THUC PHAM CNĐT : PGS.TS ĐỒNG TH] THANH Tit TRUONG DH- KHOA HỌC TỰ NHT#* TPHCM 2004 We HỊ MỤC LỤC MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan vé protease vi sinh vat Nguồn nguyên liệu thu protease Ứng dụng protease Enzym thương mại II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Trang | 3 12) 12 ^ + Phương pháp tách chiết enzym 13 {ong pháp thu nhận Enzym dạng bột _.o Aác định hoạt tinh protease 2.4 Binh ludng protease theo pp Lowry 2.5 Xác định hoạt độ đông tụ sữa 2.6 Định lượng N- tổng số pp Kjeldahl 2.7 Phương pháp chuẩn độ formol theo Sorensen I KET QUA VÀ BIỆN LUẬN Tuyển chọn sơ V§V tổng hợp protease cao Xác định hoạt tính protease/chế phẩm enzym Nghiên cứu tổng hợp cẩm ting protease Thu nhận chế phẩm protease- xác định hoạt tính protease Xác định hoạt tính đơng tụ sữa Nghiên cứu chế phẩm enzym sx chao Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm protease IV KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ V_ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP GIAI ĐOẠN I1 | ị i ị 11 1, Vật liề Phượt ị 13 ị ị 13 14 45 16 ¡ 18 ị 17 19 19 24 26 31 ị | ị ị Ị 34 36 38 48 49 ị | i MỞĐẦU tạo Enzym chất xúc tác sinh học có chất protein Enzym thiếu thành tế bào sinh vật, đóng vai trị quan trọng khơng thể có tham qúa trình trao đổi chất Tất chuyển hóa hóa sinh thể gia xúc tác enzym Enzym hoạt động xúc tác bên tế mạnh, bào mà thoát ngồi tế bào điều kiện thích hợp hoạt động vào nhiều lĩnh điều có ý nghĩa quan trọng việc ứng dụng enzym vực khác công nghiệp đời sống Nguồn nguyên liệu để san xuất enzym thu nhận từ động vật, thực vật phức vi sinh vật Tuy nhiên việc khai thác enzym từ động vật, thực vật tạp, giá thành cao, việc sản xuất enzym từ vi sinh vật vấn để quan tâm nhiều Enzym từ vi sinh vật có tru điểm bật sau : nhỏ - Hoạt tính enzym vi sinh vật cao, cần sử dụng lượng enzym chuyển hóa lượng lớn chất - Vi sinh vật có khả tổng hợp nhiều loại enzym khác đưỡng vi sinh vật - Tốc độ sinh sản sinh vật nhanh, mơi trường ni thành chế đơn giản, rễ tiền, dễ kiếm thời gian thu enzym nhanh, giá phẩm enzym rẻ protease enzym Trong công nghệ sẩn xuất chế phẩm enzym, sau amylase thi kỹ nghệ quan trọng đứng hàng thứ hai Protease ứng dụng nhiều thực phẩm, kỹ nghệ sữa, dược phẩm, chất tẩy rửa.v.v protease Trong quy trình sắn xuất nước mắm, nước ch&m,tuong chao.v.v., cá, đậu nành góp phan rit ngắn thời gian thầy phân loại protein Trang Trong quy trình sản xuất fromage , nguồn enzym đơng tụ sữa sử dụng rennin lấy từ ngăn thứ tư đày bê non tháng tuổi Nhưng sản lượng fromage ngày gia tăng , lượng rennin có nguồn gốc từ động vật đáp ứng đủ nhu cầu mà cần phải có hỗ trợ:` protease từ vi sinh vật Đề tài tiến hành nghiên cứu nhằm tạo chế phẩm enzym protease vi sinh vat ưng dụng công nghiệp thực phẩm nhằm thay nguồn enzym ngoại nhập Trang PHANI ` ^ TONG QUAN TAI LIEU ` walle TONG QUAT VE PROTEASE VI SINH VAT: 1,1 Khái niệm: :' ˆ : - Tế bào vi sinh vật có khả tổng hợp nhiều loại enzym khác Các enzym xúc tác phẩn ứng ngồi tế bào Một số enzym có : khả thấm qua mang tế bào để ngồi mơi trường gọi enzym ngoại bào, có enzym khơng ngồi gọi enzym nội: bào Nhiều vi sinh vật có khả tổng hợp mạnh protease, protease ngoại bào hay nội bào Protease thu nhận từ vi sinh vật đa dạng phong phú : - Aspergillopepsin : Aspergillus oryzae, A niger - Mucorpepsin (Mucor rennin) : Rhizumucor miehei, R pusillus - Saccharopepsin : Saccharomyces cerevisiae - Bacillolysin : Bacillus subtilis - Subtilisin : Bacillus amyloliquafaciens 1.,2 Tính chất :- : Protease từ vi sinh vật có ưu điểm hoạt động khoảng pH rộng, chúng tổng hợp hai loại enzym endopeptidase exopeptidase, thủy phân đến 80% liên kết peptid protein Protease vi khuẩn hoạt động vùng pH hẹp (pH - 8) so với ~ protease ném méc (pH - 11), Diém đặc biệt quan trọng để phan biét cdc protease pH tối ưu Protease thị trường gồm ba loại protease kiểm tinh, protease trung tính va protease acid tính » Protease kiểm tính : Nhiễu chủng sinh vật tiết protease kiểm tính ngoại bào quan trọng nhứ chủng vi khudn Bacillus : B licheniformis, B.pumillus v.vunấm mốc chủng Aspergillus : A.niger, A.sozae v.v., protease kiém tinh duge biét nhiều Subtilisin BPN va Subtilisin Novo san xudt từ vi khuẩn Ư amyloliquafaciens với đặc tính chịu nhiệt cao vào khoảng 70° C, vững môi trường kiểm pH vào khoảng 9-11 Trang * Protease trung tính : Các ching vi sinh vật có khả tiết protease trung tính ngoại bào vi khuẩn B.subiilis, B.sereus V.V., nấm mốc A.oryzae, A.sozae v.V Protease trung tính có Khoảng pHụy, hẹp, khơng bến với nhiệt độ cao , va mat hoat tính có diện protease kiểm - _ * Protease acid tinh : Protease acid tinh hay goi 1a aspartic protease, ứng dụng nhiều kỹ nghệ fromage, dược thực phẩm Khoảng pHụ, từ ˆ - Các vi sinh vật có khả tiết protease acid gỗm Mucor pusillus, M.miehei, Penicillium janthinellum, P.roqueforti, A.oryzae, Peseudomonas sp v.v 1;.3 Protesae vi khuẩn : 1.3.1 Vài nét ví khuẩn: — _ Vi khuẩn vi sinh vật thuộc nhóm procaryote, thể cấu tạo đơn giản gồm đơn bào đa bào, sinh sân chủ yếu cách phân đơi Vi khuẩn có ba loại hình dạng :cầu khuẩn (coceus), trực khuẩn xoắn khuẩn (spirilum), ngồi cịn có nhiều đạng trung gian cầu trực khuẩn (coccobacille), phẩy khuẩn (vibrio) Vi khuẩn có mặt khắp nơi : khơng khí, đất, nước, thể động thực vật v.v Tuy có đời sống ngắn ngủi sức sống sinh sẵn mạnh mẽ, Có lồi vi khuẩn gây hại cho người, động vật thực vật có lồi hữu ích đời sống người đùng làm nguồn nguyên liệu để sản xuất chế phẩm enzym, vitamin, acid hữu v.V, 1.3.2 Tinh chất protease vi khuẩn: vi khuẩn chia làm hai loại : protease trung tính Các tính chất protease vi khuẩn trình bày bang 1: Protease protease kiém "Protease kiểm vi khuẩn "Tính chất PH hoạt động np — PHtối tích :-; * “Tác nhân ức chế Những chất đặc trưng ` | Protease trung tính vỉkhuẩn PU 69 15-95 6-8 DIFP, PMSF EDTA, Sodium, Dodecy! suifat Ester, amide, peptid Peptid va ester Bang I ; Mét 30 tính chất protease từ vỉ khuẩn Ghi : DIEP sdiisopfopyl fluorophosphat: - - EDTA : ethylenediaminetetraacetic acid lmethanesulfony! fluoride, : PMSF pheny Trang 1.4 Protease nấm mốc ; 1.4.1, Vài nét nấm mốc :- „ Nấm mốc vi sinh vật thuộc nhóm nhân thật (eucaryote) Nấm mốc có cấu tạo khuẩn ty phát triển, có vách ngăn hay khơng khơng tạo tai nấm Nấm mốc có hai loại bào tử : bào tử vơ tính ( đính bào tử, tiết bào tử ) bào tử hữu tính (tiếp hợp bào tử, nang bào tử ) Dựa vào sinh sản hữu tính, người ta xếp nấm mốc vào lớp khác Nấm mốc có khắp nơi, đặc biệt đất, bào tử nấm thường theo hạt bụi bay khơng khí, chúng tham gia tích cực vào việc phân giải chất Một số nấm mốc sử dụng phục vụ đời sống người làm tương, sản xuất acid „ hữu cơ, vitamin, chất sinh trưởng, acid amin chất kháng sinh Một số nấm mốc lại nguyên nhân gây bệnh người, động vật thực vật + Tổng quan vé Aspergillus.oryzae : - Đặc điểm : Thuộc nhóm mốc vàng, có cuống conidi dài khác biệt với sợi nấm dinh đưỡng, conidi tạo thành chuỗi Bông màu vàng nhạt đến vàng đậm vàng hoa cau Khuẩn lạc biến đổi thành màu lục pha nâu nhạt già thạch Czapek Conidi có đường kính từ 4.5 - ym ; hic đầu conidi có hình elip, chuyển dẫn thành hình câu, nhấn xù xì khơng đều, 1.4.2 Tinh chất số prolease từ nấm mốc : Protease nấm mốc có khoảng pH hoạt động rộng so với protease vi khuẩn Protease nấm mốc chia làm ba loại : protease acid, protease trung tính protease kiểm PH thich hop PHốn định Cơ chất Cơ chất Vi sinh vật Hemoglobin Chất ức chế Casein Asp.saitol 3-45 2.5-3 2-5 Asp.oryzae (protease acid) 3-4 25-3 Asp.oryzae (protesat trung tính) 55°75 Asp.oryzae (protease idm) 6-95 Paccitomyces varioti NBS EDTA 6.5 -10 7-8 DIFP 35-53 3-5 Rhizopus chinensis 29-33 38-65 Mucor pusillus 35-45 36 3-6 Bằng : Tính chất số protease từ nấm mốc Ghi : NBS : N-bromosuccinimiđe Trang ˆ Nguồn nguyên liệu thu nhận Protease: ; Các Protease phổ biến động vật, thực vật vi sinh vật Tuy nhiên, phân bố ` chúng khơng đồng lồi, mơ, quan khác Một loài, quan mơ động thực vật có chứa hay số protease định dùng làm nguồn nguyên liệu để tách enzym tương ứng Nguyên liệu Enzym Cmorypsin Tùyủ tạng Màng nhây Ghi Cacboxy peptidase A Cacboxy peptidase B Pepsin A | Pepsin B,C,D dày Gastrisin người, lợn, chó, gà, thổ Dạ dây động vật có sừng | Renin Các enzym tiết not i tế bào vdivới dịch dic! My Các enzym tiết tế bào Với dịch vị non lách, tỉm, Enzym Catepxin A,B,C,D Gan, Aa than, tế bào, thận, da Leucinaminopeptidase | không sản xuất chế phẩm Trombii Huyết tương Mủ du đủ, ficus, sung, vả3 (ở quả), lá, thân Peosin Phụ lazmin Fixin đứa đặc biệt vỏ B romelin Bang 3 Một số nguyên liệu dùng thu nhận protease(l/Bộng vật thực vật) Vị sinh vật Asp, flavus Asp.oryzae pH tối thích 8,5 - 10 pHổn định 5-10 2,5-6 , Asp.saitoi Loại protease Kiểm Acid Kiểm Carboxypeptidase 25-3 2,5-6 6,5 -7,5 5-9 Trung tinh 4 3-8 4-6 Acid Acid Rhyzopus chinensis 2,9 - 3,3 2,8 ~ 6,5 Acid hniveus 2,9 -3,3 2,8 - 6,5 Acid 10 7-11 Asp.sojae Mucor michei Mucor pusillus Streptomyces fradiae 85-10 7-8 5-9 4-8 Acid Kiém : Aminopeptidase Carboxyloeptidase Bac.subtilis 10,3 ¬ 10,8 3-11 Kiểm Bac.allophilic 10-12 4-12 Kiém Bang 4°: Một số chẳng sinh vật có khả sinh protease Trang Vi sinh vat Asp.oryzae Ghi chi protease laacid trung tinh va kiém Asp Satoi Asp.awamori Asp Niger Asp.shirousami Protease Protease Protease Protease Asp fumigatus Protease acid va kiém Asp Candidus Protease làm đông tụ sữa Asp.ochraceus Asp.sojae Asp flavus Protease trung tính _ Protease kiém Protease kiém va trung tinh Pen, janthinellum _Pen.chrysogenum Protease acid Protease acid Mucor pusillus Protease Phymatotrichum omnivorum, Asp.terricola Str.griseus,Str faecaiis, acid acid acid acid Str.rimosus,~ Str fradiae, Str.reelusvar Bac.subtilis, Bac circulan, Bac.sphaericus, Bac.aerothermophilus, acid làm đông tụ sữa(ở Nhật đùng thay renin) Aminopeptidase, Cacboxypeptidase Dùng kỹ nghệ Nhật Mỹ với tên protease , gồm 1] enzym với chất procolagen phân giải 70% đến acid amin Proteasetrungtính,protease kiểm Bac.thermoacidurans Cl.perfringens Colagenase Bằng s.: Một số chẳng sinh vật có khả sinh protease Trang ˆ 5, NGHIÊN CỨU SÂN XUẤT CÁC CHẾ PHAM VSV VA ENZYM UNG DUNG TRONG SAN XUAT CHAO Chao sản phẩm truyền thống Việt nam số nước Châu A, hién qúa trình sẩn xuất chao chủ yếu phương pháp lên men tự nhiên ( nhờ hệ VSV tự nhiên ngun liệu , khơng khí ),thường nhiễm vi sinh vật lạ , tạp nhiễm gây tác bại cho người chất lượng sản phẩm không ổn định Trong hướng nghiên cứu để tài muốn thử nghiệm số sản phẩm nhằm phục vụ cho việc cải tiến góp phần nâng cao chất lượng chao Hệ VSV tự nhiên chao đa đạng , thường có chủng :Áctinomucor elegans M.hiemalis, M.silvaticus , M subtilis, Rhizopus oligosporus (Wai- 1967) Chúng thử nghiệm sản xuất loại sản phẩm phục vụ cho sx chao : bột bào tử chế phẩm protease tiv ching Mucor sp , bước đâu thử nghiệm có kết qúa xí nghiệp chao Hoa sen ( phần kết qủa cụ thể báo cáo giải đoạn để tài ) 5.1-SX Bột bào tử~ Äfucor sp Với quy trình đơn giản , tóm tắt sau : Mơi trường bã đậu hũ xí nghiệp , phối trộn với bột gạo số chất dinh đưỡng cho nấm mộc Từ ống giống thạch nghiêng ,chúng tiến hành nuôi cấy tiếp môi trường trung gian trên, với thời gian thích hợp , độ ẩm 55-60% , pH 5-6, phối trộn bột gạo rang , nghiền trộn ,xoa , sấy nhẹ sơ bộ, nghiền mịn , rây lấy phần bột mịn rây , bảo qủa nhiệt độ lạnh, sử dụng bổ sung SX chao SX ché phdm protease tiv Mucor sp Qúa trình Sx tương tự Sx chế phdm enzym protease tit Asp.oryzae ¿ tác nhân kết tủa etanol 96 độ, hoạt tính protease giới thiệu Bảng 30 Bước đâu thử nghiệm với kết qủa giới thiệu Báng 3l ,32_, THẦb 7- Đợi thí nghiệm AOD trung bình 0,092 0,087 0,176 0,167 pmol Tyrosin Số ĐVHI protease (UI/gCPE) Sé PVHt protease (UI/gCPE) trung bình đợt Bảng 30 il I 2,93 2,79 286 , Số ĐVHI prơtease tính trén g CPE thd 36 5.3 l Sự biến đổi hàm lượng N- Amin hiệu suất thuỷ phân protid thời gian ủ mốc: Hàm lượng N Amin N- Amoniac % tính hiệu số lượng N- formol Hiệu suất thuỷ phân = Thời gian mốc Ham lượng N- Formon *100 22 N*Amin / NL (%) TN-WE! TNI | TN] me (gid) 1,58 158 158 158 211 3,16 474 526 684 1,58 1,58 1,58 1,58 2,11 3,16 3,68 4,74 5,79 12 18 24 30 36 42 48 | | | | | | ] | | 158 1,58 1,58 158 158 3.68 474 526 684 lượng l (%) Hàm lượng N- tổng số Hiệu suất thuỷ phần (%) Ủ theo | | | | | | | | | 0024 0/019 0,019 0007 0,006 0,020 0025 0,033 0,048 TNH TNHỊ TNI| | | | | | | | | | 0,013 0/013 0,007 0,002 0,006 0,015 0,039 0,049 0,062 | | | | | | | | | 0,013 0,013 0013 0,007 0/002 0,025 0/039 0,043 0,072 Bắng 31 Sự biến đổi hàm lượng N- Amin/NL (%) theo thdi gian ủ mốc chao tự NL: Mai b4» nhiên ÍThời gian | Hiệu suất thuỷ phân ủ mếc (giờ) 12 18 24 30 36 42 48 @®) N~Amin/ NL (%) TNI | 1,58 1,58 TN-H | -TN-1 1,58 | 0,024 1,58 | 0.024 1,58 1,58 3,16 5,26 6,84 9,47 1.58 | 2,41 3,16 | 4.74 _|684 | 8,95«| 1,58 1,58 0,019 0,012 0,020 0,046 0,060 0079 0,123 | TN 0,019 0,019 0,019 0,013 0,013 0,023 6,050 0,085 0,193 Bang 32 Sự biến đổi lượng /N-Amin/NL (%) theo thời gian ủ mốc Mucor 37 | N-amin/NL(%) 10.25 oe es |e TNA {> IND “02! 40 Đề thị : e 30 ' 60 _ Sự biến đổi hàm lượng N- Amin/NL (%) theo thời gian ủ mốc Mucor *Nhân xét: > Dya vào kết hàm lượng N- Amin/NL (%) trường hợp ta thấy: © Từ24 giờ- 48 giờ: Hàm lượng N-Amin tăng dẫn đặc biệt tăng rõ từ thời điểm 36 trở Bởi thời gian mốc bất đầu phát triển mạnh, lượng enzyme protease tích luỹ ngày nhiều với hoạt tính phân giải protein cao, lượng N- Formol tăng nhanh nhiều so với gia tăng lượng Đ- Amoniac Chính lượng N-Amin tích luỹ cảng nhiều > So với mốc chao tự nhiên, mốc Mucor có ưu điểm chỗ tổng hợp enzyme protease c6 hoat độ phân giải protid cao nên hiệu suất phân giải protein đậu hũ nhanh Vì vậy, lượng N-:Amin tích luỹ chao lên men nhờ chủng mốc Mucor nhiều thời điểm 24 đến 48 TH.6 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÁC CHẾ PHẨM PROTEASE TU BAC SUBTILIS ( CPE-B) VA TỪ ASP.ORYZAE (CPE-A) 6.1 UNG DUNG TRONG QUA TRINH THUY PHAN PROTIT ~ Chúng sử dụng chế phẩm protease từ vi khuẩn nấm mốc thu để thủy phân số protit, theo đối biến đổi lượng N- amin / N- tổng số theo thời gian thủy phân, xác định hiệu suất thủy phân so sánh chế phẩm enzym Kết qủa biểu thị bảng 33 34` 38 | Ding enzyme protease cia Bacillus subtilis để thủy phân protein động vật thực vật: Tiến hành thủy phân protein tự nhiên động vật thực vật dung dich enzyme protease cia Bacillus subtilis dugc tủa tác nhân aceton nhiệt độ 40°C Sau thủy phân xác định hầm lượng Nitơ ~ formol tạo theo phương pháp Sorensen trình bày mục 1L2.7 So sánh hiệu suất thủy phân enzyme loại protein động vật thực vật ~ Thờigian Dich thit cá Dịch đậu nành Cơ chất ANaOH | Nito- | Higu | ANaOH | (ml) | formoll (gf)_| thủy phân (giờ) suất (%) Nitd= | (ml) | formoll Hiệu suất (%) (gf) 0.64 0.9 6.15 0.56 | 7.79 1,07 1.5 10.25 1.00 1.40 | 19.47 1.42 2.0 13.67 1.32 1.85 |25.73 2,00 2.8 19.14 1.52 2.13 | 29,62 2.71 3.8 25.97 1.85 2.59 | 36.02 3.00 42 28.71 2.00 2.80 | 38.94 3.57 5.0 34.18 2.15 3.15 |41.12 4.00 3.6 38.09 2.33 3.26 | 45.34 4.07 5.7 38.96 2.33 3.26 | 45.34 4.07 5.7 38.96 0.5 0.10 0.40 9° 0.14 1.9 Bảng 33: Sự biến thiên tỉ lệ (%) Nitơ — formol/ Nitd tổng số theo thời gian thủy phân protein béi protease cla Bacillus subtilis Nhận xét: “Trong khoảng thời gian thủy phân (9 giờ) 40°C, lượng Nitơ — formol dịch biến đổi: 39 q Lượng nitd-formol tăng đầu, từ thứ trở tăng chậm ngưng hẳn sau thứ q Đối với dịch thịt cá, hiệu suất thủy phân 38.96% q_ Đối với dịch đậu nành, hiệu suất thủy phân 45.34% Lượng Nitơ - formol tạo qúa trình thủy phân thịt cá cao (5.7 g/l) hiệu suất thủy phân đat (38.96%) thấp so sánh với qúa trình oy thủy phân protein đậu nành Nitd-formol | (24) wo r a“ |i “ 01 “ Hy dich &utành —— dịch tịtzá een a on — a _ ⁄ + thời gian , (gis) † 4 FT 19 Đồ thị Đề thị biểu diễn biến đổi Nitơ - formol qúa trình thủy phân protein protease Bacillus subtilis 4.2.Ding enzyme protease ca Aspergillus oryzae để thủy phân protein động vật thực vật: Tiến hành thủy phân protein tự nhiên động vật thực vật dung dịch enzyme protease Aspergillus oryzae tủa tác nhân aceton nhiệt độ 40°C Sau thủy phân xác định hầm lượng Nitơ — formol tao theo phương , pháp Sorensen trình bày mục I127 So sánh hiệu suất thủy phân loại protein động vật thực vật: 40 Địch thịt cá Dịch đậu nành ANaOH (m) Thời gian Thủy phân (giờ) Bảng Hiệu | ANaOH | Nitơ— suất formol (g1) (%) (mi) Nitd- Hiệu (gM) (%) formol | $uất 0.5 0.06 0.084 1.17 0.22 0.32 2.19 011 0.154 2.14 0.64 0.65 4.44 0.22 0.308 4.28 0.72 1.01 6.90 0.65 0.910 12.66 0.94 1.32 9.02 4+ 0.85 1.190 16.55 1.21 1.69 11.55 0.91 1.274 17.72 1.59 2.21 15.10 1.05 1.470 20.44 2.00 2.80 19.14 1.19 1.666 23.17 2.21 3.10° | 21.19 1.25 1.764 24.53 2.25 3.15 21.55 1.25 1.764 24.53 | 2.25 3.15 21.55 “| 34 Sự biến thiên tỉ lệ (%) Nitơ - formol/ Nitơ tổng số theo thời gian thủy phn protein béi enzyme protease cha Aspergillus oryzae Nito-formol (8Ð a ~— dịh đậu nành Ct ga dich th.t cd city Đồ thị Đồ thị biểu diễn biến đổi Nitơ ~ formol qúa trình thủy phân protein protease Aspergillus oryzae Nhân xét: Trong thời gian thủy phân (9 giờ) 40°C, lượng Nitơ — formol địch biến đổi: a Lượng đạmNitơ — formol tăng đầu từ thứ trở tăng chậm ngưng hẳn sau thứ a Lượng Nitơ ~ formol tạo qúa trình thủy phân thịt cá cao (3.15 g/l) hiệu suất thủy phân đạt (21.55%) thấp so với qúa trình thủy phân protein đậu nành (45.34%) Nhận xét: Hiệu suất thủy phân protein tự nhiên (%) chế phẩm enzyme thu từ Bacillus subtilis va Aspergillus oryzae, theo bang dudi day: Vi sinh vat Co chat tr đền nÀ Protein đậu nành Protein thịt cá Aspergillus oryzae 24.53 21,55 Bacillus subtilis 45.34 38.96 Nói chung, hai enzyme hai lồi vi sinh vật có khả thủy phân tốt protein thực vật (dịch đậu nành) protein động vật (dịch thịt cá) Chúng nhận thấy, enzyrae protease Øacillus subrilis có khả thủy phân tốt nhiều so với enzyme protease nấm mốc Aspergillus oryzae DONG TU SUA 11.62 UNG DUNG CHE PHAM PROTEASE TRONG QUA TRINH loại sữa khác Chúng ứng dụng chế phẩm protease CPE-B va CPE-A để đông tụ béo sữa bột : sữa tươi có béo , sữa tươi tách béo , sữa bột có tách béo , nghiên protease VSV trịng đơng tụ cứu đặt sở cho nghiên cứu ứng dụng 'chế phẩm enzym biểu thị bảng 35.36 sữa để sản xuất Phomat Kết qủa nghiên cứu đông tụ sữa Biểu để 1, Nhìn chung chế phẩm CPE-B CPE-A có khả tốt, khối đơng tụ dai , đàn hồi , không so với CPE ngoại .mø Chế phẩm enzym thu nhận từ nấm mốc Asp.oryzae: Thời gian đông tụ (phút) Loại sữa TN, “TN, 2,83 2,83 4,75 34 1,83 4,83 .| 3⁄4 1,15 TN SBKB 10% SBCB (*) STKB (*) STCB(*) TB 289 — ] Hoạtđộ đông tụF |0,69 479 - [0,42 3,51 | 0,57 7,78 | 0,26" 48 3,53 7⁄15 Bang 35 : Hoạt độ đông tụ sữa CPE-A.oryzae chất khác - Hoạt độF 0.8 07 0.6 0.5 04 03 0.2 6.1 03 4 + ’ Cơ chất SBKB 10% SBCB ® STKB ®) Biểu để ! Hoạt độ đông tụ sữa CPE-A.oryzae i STCB œ® chất khác Ghi chú: SBKB : Sữa bột không béo SBCB: Sữa bột có béo STKB : Sữa tươi khơng béo - STCB : Sữa tươi có béo: lượng Protein so với SBKB (®) Các loại sữa cân hàm ; 45 : /.w Chế phẩm enzym thu nhận từ vi khuẩn B-subtilis Loại sữa Hệ số pha “| “Thời gian đông tụ (Phút) jotng TN, TN TN; Hoạt độ đồng TB tụE SBKB 10% 15 3,23 3,25 3,2 3,23 4,64 SBCB (*) 75 311 3,08 5,13 5,13 2,92 STKB (*) 15 45: 4,47 4,47 4,48 3,35 -.6,68 6,67 6,67 2,25 STCB(*) '} T15 6,65 Bảng 36 Hoại độ đông tụ sữa CPE_8 subtilis, chất khác Hoạt độ F : Cơ chất SBKB 10% ' SBCB (*) STEKB (*) STCB Œ®*) " Biểu đổ Hoạt độ đông tụ sữa CPE-B.subtilis chất khác w Nhận xét chung : -_ Hoạt độ đôag tụ sữa enzyme cao sữa không béo - Đối với sữa béo hoạt độ enzym thấp “bạt sữa béo có tính chất hút bám protein có sữa việc tiếp xúc enzym với micelle sữa bị hạn chế enzym bị “hạt sữa béo” hút bám 44 - " Hoạt độ đông tụ sữa F +;4: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt độ đông tụ sữa chế phẩm protease T——r—— 15 TT 20 25 TT 30 rrrrrTTrT 35 40.45 50 55 60 65 Nhiệt để (°C) 70 - Đề thị 10 Ảnh hưởng nhiệt độ lền hoạt độ đông tụ sữa CPE - Asp.oryzae * Nhận xét : Từ đồ thị so nhận thấy: Khả đông tụ sửa CPEAs?.2ryzae tốt khoảng nhiệt độ từ Ị 45°C- 55°C | Hoạt độ đông tụ sữa E Nhiệt độ t6i.um khodng 50°C 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ~ Nhiệt độ (oC) Đổ thị 11 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt độ đông tụ sữa CPE Bac sublilis x Nhận xét: Từ đổ thị ¿chúng nhận thấy: Khả đông tụ sữa CPE subtilis Ot ð khoang nhiét d6 tir 45°C - 55°C Nhiệt độ tối tu khoảng 55°C 45 SƠ ĐỒ THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYM TỪ VI SINH VẬT [vi sinh nh vật vật: } - Vi khuẩn nấm mốc Nuôi cấy bể sâu Dịch nuôi cấy vi khuẩn | Nuôi cấy bể mặt Canh trường nấm mốc Nghiễn nhỏ Ly tam Hòa nước (hay dụng dịch muối) Khuấy Ba Bỏ | dung dịch Vv Tủa enzym sấy khô bảo quản < beth DMP hay Ừ Lagi mudlal, ' Chế phẩm: bột enzym 46 NHẬN XÉT KẾT QỦA VÀ BIỆN LUẬN !-Các chế phẩm enzym thượng phẩm ngoại nhập thị trường đa dạng: lồng, bột, hạt nhé; với nhiều loại enzym khác nhau, chất lượng khác độ tỉnh sạch, số đơn vị hoạt tính/g hay số đơn vị hoạt tính / ml giá thành tất khác phụ thuộc vào số đơn vị hoạt tính đơn vị trọng lượng hay thể tích Tùy theo mục đích sử dụng mà khách hàng chọn lựa sản phẩm enzym với mức độ tĩnh hoạt tính khác Sau số sản phẩm protease thị trường: - Protamex 1a protease tif vi khudn Bac.subtilis - Rennet protease từ động vật Rennin 1a protease tif vi sinh vat - Neutrase 1a protease tif Bac Amyloliquefaciens - - Flavourzyme 1A protease ti ném méc Asp.oryzae 2- Esperase la protease ttf Bac Lentus Atcalase li protease tit Bac.licheniformis v.v Trong để tài chúng.tôi chọn sử dụng sản phẩm protease sau để so sánh với chế phẩm enzym chúng tơi thí nghiệm (CPE-TN): Protamex, Flavourzym, Rennin Hãng NoVo-Đan mạch, Rennet HãngRhodia (Pháp) 3- So sánh hoạt tính protease : - Protamex hoạt dé protease - Flavourzym ~ 403,6 Ul/g 227,1 Ul/g - CPE-TN-tủa cổn(khơng có chất cảm ứng) 162,5 UUg từ Asp.ory:ae - CPE-TN-tia bing aceton ( khơng có chất cẩm ứng ) 167,5 UUg - CPE-TN-tủa ( có chất cẩm ứng ) - CPE-TN- tủa aceton ( có chất cảm ứng ) 286,5Ulg 342,5 UUg - CPE-TN-tủa aceton 820,0 UUg ~ CPE-TN-tủa cén - CPE-TN- canh trường _ 654,5 UUg từ Bac.subrilis TB _ 33-70 Ug VK- n/méc Từ kết qủa cụ thể nhận thấy hoạt độ CPE-TN có gía trị cao, đạt xấp xỉ với sản phẩm protease thương mại ( nấm mốc ), với trường hợp có chất cảm ứng với vi khuẩn Bac.subiilis CPE có hoạt độ cao + So sánh hoạt độ đông tụ sữa : Rennet Hoạt độ đông tụ sữa = 46.512 U/ml Rennin _ 42.120 U/ml Flavourzym _ 9.066 Ul/g ( Asp.oryzae ) CPE-TN- từ nấm mốc _ CPE-TN- từ vi khuẩn _ trungbinh 6.480 UUg 29.600 UV/g _ ( Bac.subtilis) Hoạt tinh đông tụ sữa chế phẩm enzym từ nấm mốc thường thấp chế phẩm enzym từ khuẩn, hoạt độ đông t cao , khoảng 68% so với chế phẩm thương (chi tiết phần sau ) tủa CPE-TN chúng tơi đạt mại gía thành rẻ nhiều Trang 47a 3- Tính tốn sợ giá thành CPE-TN Từ thí nghiệm chúng tơi di ự tính sơ giá thành sản phẩm sau a/ CPE-TN ~canh trường ; : Tính cho mẻ SX từ 10 kg nguyên liệu ban đầu: + Nguyên liệu cho môi trường nuôi VSV Bột ngô, cám , ngũ cố c giá trung bình 7.000đ/kgx ¡0 kg =70 + Chất cảm ứng ( 000 đ có ): bột cá ,bột đậu nành „ Ị 3.000đ/ksx 0, + Điện, nước 8kg= 12.000đ + Cơng LÐ + Khống chất , chất bổ sung dinh dưỡng cho VS$V + Ống giống VSV + Chỉ phí phát sinh khác { vỉ lượng) 25.000đ 25.000đ 15.000đ 30.000đ 10.000đ Trung bình khí ni Cộng 187.000đ cấy VSV 10 kg môi trường thu 13 Trường) vi vay gid tr kg sinh khối( canh ung binh / Ike sé 1a 187.000đ/ 13kg= 14 384đ/kgCPE ( Đạng canh trường ) b- Chế phẩm sau tủa dụng mơi ( ví dụ sử dụng ), se cao hon va hoat độ có độ tỉnh khiết Cũng cao nhiều Từ 10 kg canh trườ ng x 14.384 đ “kg Can 30 lit cén kỹ thuật 96 độ x 8.00 0đ/ ( để kết tủa enzym ) Glucoamilase Amilase Glucoizomerase Protease ty rita Rennet Động vật Rennet từ VSV 30 250 250 100 USD /kg USD/kg USD /kg USD/kg 5.000 USD/g 300 USDK&g = ~ tưởng đương _ _ _ 143.840đ 240.000 @ 471.0004 3.925.000đ 3.925.000đ 1.570.000đ VN/kg VN “kg VNikg VNi/kg 7.850.000đ VNik g TY bang trén chúng 785.0004 VNikg nhận thấy CPE-TN tủa ch ún g tơi có giá thành th nhiều ho ạt tính ấp cao Xấp xỈ sản ph ẩm trình bày) thương mại ( phần Trang 47b IV KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 1- KẾT LUẬN Từ kết qửa , chúng tơi có số kết luận sau : 1.1 Từ chúng nấm mốc chủng vi khuẩn tiến hành tuyển chọn sơ chủng có khả tổng hợp protease cao :Asp.oryzae Bac subtilis để thu nhận protease, nghiên cứu thời gian tối ưu để tổng hợp protease cao 1.2.Nghiên cứu cảm ứng tổng hop protease cao với chất cầm ứng: bột cá bột đậu nành, pepton, chọn lựa chất cầm 1.3.Nghién cứu thu nhận protease dạng bột với như: aceton sulphatamon; từ chọn lựa tác 1.4.Xác định hoạt tính protease chế phẩm ứng phù hợp : tác nhân tủa khác nhân tủa phù hợp etanol enzym thu với tác nhân tủa khác 1.5 Xác hoạt tính đơng tụ sữa chế phẩm enzym protease so sánh với enzym ngoại nhập, đạt kết qủa cao 1.6 Bước đâu nghiên cứu sx chế phẩm E sử dụng sx chao, bước đầu tăng khả thủy phân tạo N-amin cao điều kiện lên men tự nhiên 1.7 Ứng dụng chế phẩm protease thủy phân protit cá đậu nành 1.8 Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzym với dang: - Bột enzym protease thô từ canh trường - Bot enzym prote::s sau kết túa với tác nhân khác - Bột bào tử Muecør sp dùng sx chao - Ché phdm protease ding sx chao - Chế phẩm protease đông tụ sữa dùng chế biến sữa Khi so sánh với chế phẩm enzym nhập ngoại hoạt tính protease hoạt tính đơng tụ sữa cao với giá thành hạ so với enzym nhập ngoại 2- DE NGHỊ -_ - Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình thu nhận enzym protease Ung dung chế phẩm protease vào thực tiễn sx số nhà máy thực ' phẩm , - 48 V- HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO TRONG GIAI DOAN I Trong giai đoạn tiến hành công việc sau : Hồn thiện quy trình 3x phẩm protease vsv be Ứng dụng chế phẩm protease qúa trình SX nước mắm ngắn ngày sở Sx nước mắm Nha trang TPHCM Ứng dụng chế phẩm bột bào tử chế phẩm protease sổ ‘SX Chao ( XN Hoa sen ) 4- Ứng dụng chế phẩm protease đông tụ sữa sở chế biến sữa TPHCM 49