Nghiên cứu chế tạo mẫu sinh phẩm đo số lượng hồng cầu bạch cầu tiểu cầu trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm huyết học

Nghiên cứu chế tạo mẫu sinh phẩm đo số lượng hồng cầu bạch cầu tiểu cầu trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm huyết học Nghiên cứu chế tạo mẫu sinh phẩm đo số lượng hồng cầu bạch cầu tiểu cầu trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm huyết học Nghiên cứu chế tạo mẫu sinh phẩm đo số lượng hồng cầu bạch cầu tiểu cầu trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm huyết học

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ Y TẾ TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRUNG TÂM KIỂM CHUẨN XÉT NGHIỆM TP CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO MẪU SINH PHẨM ĐO SỐ LƯỢNG HỒNG CẦU, BẠCH CẦU, TIỂU CẦU TRONG KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM HUYẾT HỌC Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm TP.HCM Chủ nhiệm nhiệm vụ TS Trần Hữu Tâm : Thành phố Hồ Chí Minh - Tháng 07/2018 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ Y TẾ TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRUNG TÂM KIỂM CHUẨN XÉT NGHIỆM TP CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO MẪU SINH PHẨM ĐO SỐ LƯỢNG HỒNG CẦU, BẠCH CẦU, TIỂU CẦU TRONG KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM HUYẾT HỌC (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 12/07/2018) Chủ nhiệm nhiệm vụ: (ký tên) Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: (ký tên đóng dấu) MỤC LỤC CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu 1.1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài 1.1.2 Tình hình triển khai chương trình ngoại kiểm tra (EQAs) giới 1.1.3 Tình hình triển khai chương trình ngoại kiểm tra (EQAs) nước 1.2 Tính cấp thiết đề tài 1.3 Ý nghĩa tính khoa học thực 1.4 Phạm vi nghiên cứu 1.4.1 Thời gian nghiên cứu 1.4.2 Địa điểm nghiên cứu 1.4.3 Đối tượng nghiên cứu 1.5 Mục tiêu hoàn thiện công nghệ 1.5.1 Mục tiêu tổng quát 1.5.2 Mục tiêu cụ thể CHƯƠNG 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu điều kiện sở vật chất để thực nghiên cứu 2.2 Trang thiết bị sở vật chất 2.3 Thiết kế nghiên cứu: 10 2.4 Chuyên đề 1: Nghiên cứu dung dịch bảo quản mẫu hồng cầu 11 2.4.1 Bố trí thí nghiệm 11 2.4.2 Phương pháp đánh giá độ đồng độ ổn định 13 2.4.3 Phương pháp lấy mẫu kiểm tra 15 2.4.4 Phương pháp phân tích tế bào 15 2.5 Chuyên đề 2: Nghiên cứu vật liệu thay chế tạo mẫu tiểu cầu giả định 16 2.5.1 Bố trí thí nghiệm 16 2.6 Chuyên đề 3: Nghiên cứu vật liệu thay chế tạo mẫu bạch cầu giả định 18 2.6.1 Bố trí thí nghiệm 18 2.7 Chuyên đề 4: Khảo sát môi trường để tổ hợp thành phần tế bào hồng cầu người, hồng cầu động vật dùng thay tiểu cầu, hoặc bạch cầu 21 2.7.1 Bố trí thí nghiệm 21 2.7.2 Phương pháp chuyển đổi dung dịch huyết tương thành huyết 24 2.8 Chuyên đề 5: Khảo sát yếu tố môi trường ảnh hưởng đến số lượng tế bào máu… 24 2.8.1 Thí nghiệm sàng lọc yếu tố ảnh hưởng 24 2.8.2 Phương pháp ma trận Plackett-Burman 25 2.9 Chuyên đề 6: Tối ưu hóa thành phần dung dịch chứa tế bào máu 26 2.9.1 Thí nghiệm tối ưu hố thành phần chất mơi trường bảo quản 26 2.9.2 Đánh giá mơ hình thực nghiệm 26 2.9.3 Phương pháp tối ưu hoá Response Surface Methodology – Central Composite Design (RSM-CCD) 26 2.10 Chuyên đề 7: Khảo sát tuổi thọ mẫu điều kiện bảo quản 2-80C điều kiện vận chuyển 28 2.11 Chuyên đề 8: Xác định giá trị tối thiểu số lượng loại tế bào máu môi trường tối ưu 29 2.11.1 Thí nghiệm sàng lọc yếu tố ảnh hưởng 29 2.11.2 Thí nghiệm tối ưu hóa theo phương pháp RSM-CCD 30 2.11.3 Đánh giá mơ hình thực nghiệm 30 2.12 Chuyên đề 9: Xác định giá trị cực đại số lượng loại tế bào máu môi trường tối ưu 30 2.12.1 Thí nghiệm sàng lọc yếu tố ảnh hưởng 30 2.12.2 Thí nghiệm tối ưu hóa theo phương pháp RSM-CCD 31 2.12.3 Đánh giá mơ hình thực nghiệm 31 2.13 Chuyên đề 10: Xây dựng quy trình tạo mẫu sinh phẩm chuẩn dùng kiểm tra chất lượng xét nghiệm đếm tế bào hồng cầu, bạch cầu tiểu cầu Huyết học 32 2.13.1 Xây dựng sơ đồ tổng quát trình sản xuất bước thực 32 2.13.2 Xây dựng nội dung kiểm tra tiêu chí kiểm tra công đoạn 32 2.14 Chuyên đề 11: Xác định giá trị ấn định số lượng hồng cầu, tiểu cầu bạch cầu mẫu sinh phẩm theo nhóm thiết bị 32 2.15 Chuyên đề 12: Gửi mẫu cho PXN đối chiếu để đánh giá giá trị ấn định 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 35 3.1 Kết nghiên cứu dung dịch bảo quản mẫu hồng cầu 35 3.1.1 Kết đánh giá độ đồng 35 3.1.2 Kết đánh giá độ ổn định 36 3.2 Kết nghiên cứu vật liệu thay chế tạo mẫu tiểu cầu giả định 39 3.2.1 Kết phân tích máu dê 39 3.2.2 Kết đánh giá độ đồng 39 3.2.3 Kết đánh giá độ ổn định 40 3.3 Kết nghiên cứu vật liệu thay chế tạo mẫu bạch cầu giả định 44 3.3.1 Kết phân tích máu ngỗng 44 3.3.2 Kết đánh giá độ đồng 44 3.3.3 Kết đánh giá độ ổn định 45 3.4 Kết khảo sát môi trường để tổ hợp thành phần tế bào máu 48 3.4.1 Kết khảo sát lựa chọn dung dịch làm môi trường tổ hợp tế bào 48 3.4.2 Kết khảo sát thời gian bảo quản mẫu tổ hợp tế bào máu 50 3.4.3 Khảo sát sức bền tế bào hồng cầu 55 3.5 Kết khảo sát yếu tố môi trường ảnh hưởng đến số lượng tế bào máu 59 3.6 Kết tối ưu hóa thành phần dung dịch chứa tế bào máu 63 3.6.1 Kết tối ưu hoá thành phần chất môi trường bảo quản 63 3.6.2 Kết đánh giá mơ hình thực nghiệm 68 3.7 Kết khảo sát tuổi thọ mẫu điều kiện bảo quản 2-80C điều kiện vận chuyển 68 3.8 Kết xác định giá trị tối thiểu số lượng loại tế bào máu môi trường tối ưu 74 3.8.1 Kết sàng lọc yếu tố ảnh hưởng 74 3.8.2 Kết tối ưu hoá thành phần chất môi trường bảo quản 77 3.8.3 Kết đánh giá mơ hình thực nghiệm 82 3.9 Kết xác định giá trị cực đại số lượng loại tế bào máu môi trường tối ưu 83 3.9.1 Kết sàng lọc yếu tố ảnh hưởng 83 3.9.2 Kết tối ưu hố thành phần chất mơi trường bảo quản 86 3.9.3 Kết đánh giá mơ hình thực nghiệm 91 3.10 Quy trình tạo mẫu sinh phẩm chuẩn dùng kiểm tra chất lượng xét nghiệm đếm tế bào hồng cầu, bạch cầu tiểu cầu Huyết học 91 3.10.1 Quy trình tổng quát 91 3.10.2 Xây dựng tiêu kiểm tra mẫu sinh phẩm 94 3.11 Kết xác định giá trị ấn định số lượng hồng cầu, tiểu cầu bạch cầu mẫu sinh phẩm theo nhóm thiết bị 96 3.11.1 Kết xác định giá trị ấn định số lượng tế bào máu phương pháp đo điện trở 96 3.11.2 Kết xác định giá trị ấn định số lượng tế bào máu phương pháp đo quang 100 3.13 Kết đánh giá giá trị ấn định 103 3.13.1 Kết đánh giá dòng máy đo trở 103 3.13.2 Kết đánh giá dòng máy đo quang 113 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 121 4.1 Kết luận 121 4.2 Kiến nghị 122 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt ASG Tiếng Anh Alsever’s Solution Glycerol Tiếng Việt Dung dịch Alsever’s cải tiến bổ sung Glycerol CD Celldyn CPD Citrate Phosphate Dextrose CPDA-1 Citrate Phosphate Dextrose Adenin-1 CFU Colony forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc EQAs External Quality Assessment schemes Chương trình ngoại kiểm tra chất lượng IQC Internal Quality Control Nội kiểm tra chất lượng ISO International Standard Organization Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế PBS Phosphate Buffered Saline PLT Platelets PXN Tế bào tiểu cầu Phòng xét nghiệm RBC Red Blood Cell Tế bào hồng cầu RSM-CCD Response Surface Method – Central Composite Designs Phương pháp bề mặt đáp ứng – thiết kế tâm đối xứng TTKCXN Trung tâm Kiểm chuẩn Xét Nghiệm WBC White Blood Cell Tế bào bạch cầu WHO World Health Organization Tổ chức Y tế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng nghiên cứu Bảng 2.2 Thành phần môi trường ASG 11 Bảng 2.3 Thành phần môi trường cố định tế bào hồng cầu 12 Bảng 2.4 Thành phần dung dịch đệm PBS 18 Bảng 2.5 Các yếu tố khảo sát sàng lọc theo ma trận Plackett-Burman mẫu có nồng độ bình thường 25 Bảng 2.6 Bố trí 20 thí nghiệm theo CCD 27 Bảng 2.7 Các yếu tố khảo sát sàng lọc theo ma trận Plackett-Burman mẫu có nồng độ thấp 30 Bảng 2.8 Các yếu tố khảo sát sàng lọc theo ma trận Plackett-Burman mẫu có nồng độ cao 31 Bảng 3.1 Kết đánh giá độ đồng mẫu hồng cầu người 36 Bảng 3.2 Kết độ ổn định tế bào hồng cầu 100 ngày bảo quản 37 Bảng 3.3 Kết đánh giá độ đồng mẫu tiểu cầu giả định 40 Bảng 3.4 Kết độ ổn định tiểu cầu giả định 100 ngày bảo quản 41 Bảng 3.5 Kết độ đồng tế bào bạch cầu giả định 45 Bảng 3.6 Kết độ ổn định bạch cầu giả định 100 ngày bảo quản 46 Bảng 3.7 Kết độ đồng mẫu tổ hợp tế bào máu 51 Bảng 3.8 Kết độ ổn định mẫu tổ hợp tế bào máu 90 ngày 53 Bảng 3.9 18 thí nghiệm xác định độ bền loại tế bào hồng cầu 55 Bảng 3.10 Các yếu tố khảo sát cho thiết kế sàng lọc yếu tố thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman 61 Bảng 3.11 Kết ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman mẫu có mức nồng độ trung bình 61 Bảng 3.12 Các biến ma trận Plackett-Burman ảnh hưởng chúng 62 Bảng 3.13 Nồng độ yếu tố ảnh hưởng sử dụng thiết kế thí nghiệm CCD 63 Bảng 3.14 Tối ưu hố mơi trường bảo quản theo RSM – CCD mẫu có nồng độ trung bình 64 Bảng 3.15 Kết khảo sát tuổi thọ mẫu PXN Trung tâm KCXN PXN đối chiếu 69 Bảng 3.16 Các yếu tố khảo sát sàng lọc theo ma trận Plackett-Burman mẫu có nồng độ tối thiểu 74 Bảng 3.17 Kết ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman mẫu có nồng độ tối thiểu 75 Bảng 3.18 Các biến ma trận Plackett-Burman ảnh hưởng chúng 76 Bảng 3.19 Nồng độ yếu tố ảnh hưởng sử dụng thiết kế thí nghiệm CCD 77 Bảng 3.20 Tối ưu hố mơi trường bảo quản theo RSM – CCD mẫu có nồng độ tối thiểu 78 Bảng 3.21 Các yếu tố khảo sát sàng lọc theo ma trận Plackett-Burman 83 Bảng 3.22 Kết ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman mẫu có nồng độ cực đại 84 Bảng 3.23 Các biến ma trận Plackett-Burman ảnh hưởng chúng 85 Bảng 3.24 Nồng độ yếu tố ảnh hưởng sử dụng thiết kế thí nghiệm CCD 86 Bảng 3.25 Tối ưu hố mơi trường bảo quản theo RSM – CCD mẫu có nồng độ cực đại 87 Bảng 3.26 Chỉ tiêu đánh giá nguồn nguyên liệu đầu vào 95 PL4.4 Kết 10 phòng xét nghiệm chạy máy CD3200 PL4.5 Kết 10 PXN chạy máy CD Ruby PHỤ LỤC PL5.1 Bảng kết chạy 10 lần lặp lại dòng máy ABX TTKCXN STT 10 WBC (109) 3.8 3.7 3.9 3.6 3.8 3.7 3.8 3.9 4.1 HH1 RBC (1012) 3.36 3.38 3.35 3.9 3.4 3.38 3.4 3.32 3.41 3.43 PLT (109) 98 90 92 93 97 99 97 91 96 93 WBC (109) 8.2 8.4 8.3 8.2 8.5 8.2 8.1 8.7 8.6 HH2 RBC (1012) 4.44 4.44 4.42 4.47 4.24 4.43 4.48 4.41 4.45 4.49 PLT (109) 152 155 152 149 151 148 152 153 144 156 WBC (109) 26.5 26.1 26.8 26.9 26.3 26.6 26.6 26.2 26.9 27.1 HH3 RBC (1012) 5.76 5.77 5.62 5.77 5.7 5.75 5.49 5.79 5.74 5.53 PLT (109) 419 415 410 420 423 423 412 411 415 416 PL5.2 Bảng kết chạy 10 lần lặp lại dòng máy CD 1700 Phòng khám đa khoa Nhân Hậu STT 10 WBC (109) 4.1 4.6 4.2 4.8 3.8 4.5 4.5 4.1 4.7 HH1 RBC (1012) 3.9 3.6 3.52 3.55 3.56 3.52 3.47 3.53 3.82 3.5 PLT (109) 59 55 68 62 59 57 61 62 61 58 WBC (109) 8.6 8.2 8.8 8.2 8.8 8.9 8.3 8.1 9.1 8.1 HH2 RBC (1012) 5.58 5.1 5.65 6.01 5.52 5.16 5.71 5.68 5.62 5.12 PLT (109) 145 141 143 139 143 140 149 146 147 141 WBC (109) 26.8 26.9 26.3 25.1 25.5 26.3 25 27 27.5 27.7 HH3 RBC (1012) 6.05 5.1 5.92 5.94 5.9 5.89 5.88 6.04 5.85 5.4 PLT (109) 417 410 415 417 416 414 425 411 418 415 PL5.3 Bảng kết chạy 10 lần lặp lại dòng máy Mindray Bệnh viện Quận STT 10 WBC (109) 3.8 3.7 3.9 3.9 3.5 3.9 3.8 3.7 3.6 3.7 HH1 RBC (1012) 3.32 3.31 3.8 3.38 3.41 3.35 3.36 3.31 3.31 3.78 PLT (109) 60 62 65 65 64 60 64 61 61 63 WBC (109) 7.7 7.7 7.7 7.5 7.8 7.8 7.6 8.5 7.6 8.9 HH2 RBC (1012) 5.28 5.19 4.93 5.24 5.11 5.3 5.5 5.4 5.5 4.99 PLT (109) 132 138 137 139 144 135 139 139 136 138 WBC (109) 25.3 24.9 24.8 25.7 24.5 24.1 24.1 23.9 25.2 25.8 HH3 RBC (1012) 5.08 5.93 5.8 4.99 5.45 5.42 5.67 5.32 5.6 5.01 PLT (109) 399 391 395 389 402 398 391 397 400 397 PL5.4 Bảng kết chạy 10 lần lặp lại dòng máy CD3200 Bệnh viện Quận 11 STT 10 WBC (109) 3.49 3.55 3.77 3.86 3.55 4.01 3.46 3.88 4.2 3.81 HH1 RBC (1012) 3.51 3.12 3.32 3.49 3.47 3.45 3.05 3.45 3.5 3.49 PLT (109) 94.2 96.7 90.4 90.4 94.6 94.8 91.6 94.9 96.7 99.1 WBC (109) 8.14 8.9 7.78 8.13 8.29 8.01 7.91 8.76 7.66 8.11 HH2 RBC (1012) 5.29 5.75 5.6 5.74 5.12 5.17 5.47 5.37 5.47 5.17 PLT (109) 153 158 158 155 150 151 157 156 159 151 WBC (109) 23.6 24.5 24.5 23.2 25.6 23.9 23.6 22.8 20.1 25.4 HH3 RBC (1012) 5.63 5.69 5.89 5.68 5.35 5.41 5.71 5.11 5.94 5.97 PLT (109) 425 423 420 427 429 430 420 432 422 429 PL5.5 Bảng kết chạy 10 lần lặp lại dòng máy CD Ruby Bệnh viện Hùng Vương STT 10 WBC (109) 3.38 3.85 3.87 3.86 3.85 3.79 4.2 3.85 3.71 3.87 HH1 RBC (1012) 3.15 3.12 3.17 2.99 3.1 3.03 3.17 3.16 3.06 3.08 PLT (109) 146.3 145 144 150 149.8 141 147 150.1 149 148 WBC (109) 7.5 8.17 8.09 8.02 8.55 7.8 7.44 8.35 7.86 8.09 HH2 RBC (1012) 5.19 5.25 5.55 5.13 5.27 5.1 5.69 5.3 5.2 4.81 PLT (109) 251 250 244 242 246 251 242 245 249 238 WBC (109) 22.3 22.3 21.9 25.3 22.3 22.7 22.7 22.3 22.8 20.9 HH3 RBC (1012) 5.91 5.97 6.02 5.92 5.99 5.11 5.97 5.98 5.98 5.13 PLT (109) 670 674 675 669 665 663 664 665 672 673 PHỤ LỤC PL6.1 Kết chạy mẫu (HH1, HH2, HH3) xác định giá trị ấn định TT KCXN PL6.2 Kết chạy mẫu (HH1, HH2, HH3) xác định giá trị ấn định Bệnh viện quận PL6.3 Kết chạy mẫu (HH1, HH2, HH3) xác định giá trị ấn định Bệnh viện quận 11 PL6.4 Kết chạy mẫu (HH1, HH2, HH3) xác định giá trị ấn định Bệnh viện Hùng Vương PL6.5 Kết chạy mẫu (HH1, HH2, HH3) xác định giá trị ấn định Phòng khám Nhân Hậu ĐỀ TÀI ĐƯỢC THỰC HIỆN BỞI NHÓM NGHIÊN CỨU TS.DS Trần Hữu Tâm – Chủ nhiệm đề tài ThS Trương Quân Thụy – Thư ký đề tài ThS Võ Ngọc Nguyên ThS Lê Thị Thùy Như KS Nguyễn Thị Thanh Tâm CN Nguyễn Thị Hồng Phương CN Nguyễn Thị Nhạn ThS Nguyễn Đức Quỳnh Như ThS Vũ Đình Dũng 10 CN Nguyễn Đàm Châu Bảo