Nghiên cứu chế tạo bán thành phẩm giàu epigallocatechin 3 gallate egcg từ chè xanh và thử nghiệm tác dụng bảo vệ gan

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BÁN THÀNH PHẨM GIÀU EPIGALLOCATECHIN-3-GALLATE (EGCG) TỪ CHÈ XANH VÀ THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: DS Trần Lê Tuyết Châu CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TT Phát triển KH CN Trẻ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 2010 Lời cảm ơn Tơi xin thay mặt nhóm nghiên cứu gửi lời cảm ơn đến: - Ban lãnh đạo Sở Khoa học Công nghệ - Ban lãnh đạo anh chị em công tác Trung tâm Phát triển KHCN Trẻ - Thành đoàn Tp.HCM tạo sân chơi lành mạnh, tạo điều kiện thuận lợi để cán trẻ tham gia nghiên cứu khoa học Xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô Hội đồng xét duyệt Hội đồng thẩm định đề tài đóng góp ý kiến quý báu để đề tài hoàn thiện Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 09 năm 2010 Chủ nhiệm đề tài, Trần Lê Tuyết Châu LỜI GIỚI THIỆU Các sản phẩm chứa polyphenol chiết xuất từ chè, đặc biệt Epigallocatechin-3gallate (EGCG) – thành phần chống oxy hóa hữu hiệu nhóm hợp chất catechin chè xanh, có giá trị mặt khoa học thương mại – sản xuất với quy mơ cơng nghiệp nước có vùng trồng chè tập trung lớn Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ… Ngày nay, kết nghiên cứu chứng minh chè có tác dụng phịng ngừa chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau, từ đẩy mạnh việc sản xuất, sử dụng chè thành phần chiết xuất từ chè, đặc biệt polyphenol, loại thực phẩm chức dùng phòng bệnh Việc chiết xuất làm giàu hàm lượng hoạt chất để sử dụng bổ sung mục tiêu cơng nghệ sản xuất chế phẩm giàu hoạt tính sinh học Chính vậy, đề tài “Nghiên cứu chế tạo bán thành phẩm giàu epigallocatechin3-gallate (EGCG) từ chè xanh thử nghiệm tác dụng bảo vệ gan” thực INTRODUCTION The product contains polyphenols, extracted from tea, especially Epigallocatechin3-gallate (EGCG) - the most effective antioxidant compounds of catechins in green tea, are very valuable in scientific and trade - is being produced a lot of countries: China, Japan, India Today, researches have shown that tea is useful to prevent and treat many different diseases, thereby promoting the production and using of tea and its components from tea extracts, especially polyphenols, as a functional food The extraction and enrichment active ingredients use for supplement is the goal of technology of manufacturing products rich in biologically compounds Therefore, the project "Research on manufacturing semi-finished products with high epigallocatechin-3-gallate (EGCG) ratio from green tea and experiment the protective effect on liver" is done i MỤC LỤC Trang Tóm tắt đề tài/dự án (gồm tiếng Việt tiếng Anh) i Mục lục ii Danh sách chữ viết tắt v Danh sách bảng vi Danh sách hình vii Bảng tốn viii PHẦN MỞ ĐẦU Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu chế tạo bán thành phẩm giàu epigallocatechin-3-gallate (EGCG) từ chè xanh thử nghiệm tác dụng bảo vệ gan Chủ nhiệm đề tài/dự án: Trần Lê Tuyết Châu Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Thời gian thực hiện: 09/2008 – 09/2009 Kinh phí duyệt: 80.000.000 đồng Kinh phí cấp: 49.000.000 đồng theo TB số: TB-SKHCN ngày / / 10.000.000 đồng theo TB số: TB-SKHCN ngày / / Mục tiêu: Chế tạo bán thành phẩm giàu hoạt chất epigallocatechin-3gallate (EGCG) từ chè xanh thử nghiệm tác dụng bảo vệ gan bán thành phẩm Nội dung Sản phẩm đề tài/dự án: Nguyên liệu đạt tiêu chuẩn số liệu thực nghiệm Các số liệu thực nghiệm quy trình định lượng Bán thành phẩm cao chè xanh chứa  60% EGCG (100 g) Các số liệu thực nghiệm chống oxy hóa thông số MDA protein carbonyl CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY CHÈ 1.1.1 Thực vật học 1.1.2 Hiện trạng vùng chè 1.1.3 Phân loại chè thành phần hóa học chè 1.2 NHÓM HỢP CHẤT CATECHIN TRONG LÁ CHÈ 1.2.1 Tính chất hóa lý 1.2.2 Sinh tổng hợp catechin chè ii 1.3 TÁC DỤNG CỦA EGCG TRONG CHÈ XANH 1.4 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHÈ XANH 11 CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 13 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 13 2.1.1 Dược liệu chất đối chiếu 13 2.1.2 Động vật thử nghiệm 13 2.1.3 Hóa chất thuốc thử 13 2.1.4 Trang thiết bị 14 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 15 2.2.1 Kiểm nghiệm dược liệu 15 2.2.2 Chiết xuất tinh chế cao chè xanh 20 2.2.3 Thử độc tính cấp cao chè xanh 24 2.2.4 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vivo cao chè xanh 27 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU 33 3.1.1 Đặc điểm cảm quan 33 3.1.2 Đặc điểm vi học 33 3.1.3 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật chè 36 3.1.4 Định tính 37 3.1.5 Các tiêu hóa lý 37 3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG EGCG 37 3.2.1 Tính tuyến tính 37 3.2.2 Độ 40 3.2.3 Độ lặp lại 40 3.3 TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO CHÈ XANH 41 3.3.1 Đặt kế hoạch thực nghiệm 41 3.3.2 Ma trận bố trí thí nghiệm kết 42 3.3.3 Tiến đến vùng gần dừng phương pháp Box-Willson 43 3.3.4 Thực nghiệm kiểm chứng 43 iii 3.4 TINH CHẾ CAO CHÈ XANH 44 3.5 KẾT QUẢ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CAO CHÈ XANH 45 3.6 ĐÁNH GIÁ HTCO IN VIVO CỦA CAO CHÈ XANH 46 3.6.1 Xây dựng đường chuẩn định lượng MDA 46 3.6.2 Thử nghiệm thăm dò 48 3.6.3 Thử nghiệm HTCO cao chè xanh 50 3.7 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO CHÈ XANH 54 3.8 KIỂM NGHIỆM CAO CHÈ XANH THEO TCCS 60 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61 PHỤ LỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO iv DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT CCl4 Carbon tetrachloride CĐ Chuẩn độ cP Centipoise DC Dịch chiết DĐVN Dược điển Việt Nam DL Dược liệu HDL Lipid tỉ trọng cao (High-density Lipoprotein) HIV Virus gây suy giảm miễn dịch người (Human Immunodeficiency Virus) HPLC Sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) HTCO Hoạt tính chống oxy hóa LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp (Low-density Lipoprotein) M Phân tử lượng PA Tiêu chuẩn phân tích (Pure Analysis) PBS Đệm phosphat (Phosphate Buffer Saline) RP Pha đảo (Reverse phase) rpm vòng/ phút RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) SDS Sodium Dodecyl Sulfat SKLM Sắc ký lớp mỏng TB Trung bình TBA Thiobarbituric acid TCCS Tiêu chuẩn sở Tnc Nhiệt độ nóng chảy TT Thuốc thử UV Tử ngoại (Ultra Violet) v DANH SÁCH HÌNH SỐ TÊN HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cây chè (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) Hình 1.2 Diện tích sản lượng chè Việt Nam Hình 1.3 Cấu tạo khung hợp chất catechin Hình 1.4 Sơ đồ tổng hợp catechin chè Hình 2.1 Quy trình chiết xuất cao chè xanh Hình 2.2 Quy trình tinh chế cao chè xanh Hình 2.3 Phản ứng MDA acid thiobarbituric Hình 2.4 Phản ứng protein carbonyl DNPH Hình 3.1 Búp chè Hình 3.2 Vi phẫu chè Hình 3.3 Các thành phần vi phẫu chè Hình 3.4 Các cấu tử bột chè Hình 3.5 Sắc ký đồ phản ứng định tính EGCG SKLM Hình 3.6 Hình 3.7 Sự liên quan nồng độ diện tích đỉnh EGCG Cao khơ chè xanh giàu hàm lượng EGCG Hình 3.8 Đường chuẩn định lượng MDA Hình 3.9 Hàm lượng MDA nhóm thử nghiệm thăm dị Hình 3.10 Hàm lượng protein carbonyl nhóm thử nghiệm thăm dị Hàm lượng MDA nhóm thử nghiệm mơ hình ngày Hàm lượng protein carbonyl nhóm thử nghiệm mơ hình ngày Hàm lượng MDA nhóm thử nghiệm mơ hình 14 ngày Hàm lượng protein carbonyl nhóm thử nghiệm mơ hình 14 ngày Hình 3.11 Hình 3.12 Hình 3.13 Hình 3.14 vi TRANG 21 22 28 29 33 33 34 35 37 39 45 47 48 49 51 52 53 54 DANH SÁCH BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG Bảng 3.1 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật chè 36 Bảng 3.2 Kết kiểm nghiệm tiêu hóa lý nguyên liệu chè Sự liên quan nồng độ diện tích đỉnh EGCG Kết khảo sát độ phương pháp định lượng EGCG 38 Kết độ lặp lại phương pháp định lượng EGCG Các yếu tố khảo sát tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao chè xanh Ma trận bố trí thí nghiệm tối ưu hóa Kết thí nghiệm lặp (No = 6) 41 42 Các thí nghiệm tiến theo gradient phương trình Thực nghiệm kiểm chứng điều kiện chiết xuất tối ưu 43 Hàm lượng EGCG cao chè xanh trước sau tinh chế Hiệu suất chiết cao chè xanh Mơ tả tính chất cao chè xanh Kết thử nghiệm độc tính cấp cao chè xanh Kết xây dựng đường chuẩn định lượng MDA Hàm lượng MDA nhóm thử nghiệm thăm dị Hàm lượng protein carbonyl nhóm thử nghiệm thăm dị Hàm lượng MDA nhóm thử nghiệm mơ hình ngày Hàm lượng protein carbonyl nhóm thử nghiệm mơ hình ngày Hàm lượng MDA nhóm thử nghiệm mơ hình 14 ngày Hàm lượng protein carbonyl nhóm thử nghiệm mơ hình 14 ngày Kết kiểm nghiệm cao chè xanh theo TCCS 44 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 Bảng 3.12 Bảng 3.13 Bảng 3.14 Bảng 3.15 Bảng 3.16 Bảng 3.17 Bảng 3.18 Bảng 3.19 Bảng 3.20 Bảng 3.21 Bảng 3.22 vii 39 40 42 42 44 45 45 46 47 48 49 50 51 52 53 60 CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 CÂY CHÈ 1.1.1 THỰC VẬT HỌC Hình 1.1 Cây chè (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) Phân loại khoa học[18] Giới: Plantae Ngành Ngọc Lan (hạt kín): Angiospermae Lớp Ngọc Lan (2 mầm): Dicotyledonea Bộ: Theales Họ: Theaceae Chi: Camellia Loài: Camellia sinensis Danh pháp khoa học: Camellia sinensis (L.) O Kuntze Camellia sinensis có nguồn gốc khu vực Đông Nam Á ngày trồng phổ biến nhiều nơi giới, khu vực nhiệt đới cận nhiệt đới Nó loại xanh lưu niên mọc thành bụi nhỏ, thông thường xén tỉa để thấp mét trồng để lấy Nó có rễ dài Hoa màu trắng ánh vàng, đường kính từ 2,5–4 cm, với 7–8 cánh hoa Hạt ép để lấy dầu[10] 39 Vaishali Sharma, Ashu Gulati , S.D Ravindranath (2005), “Extractability of tea catechins as a function of manufacture procedure and temperature of infusion”, Food Chemistry 93, pp 141–148 40 Wang, H., Helliwell, K., & You, X (2000), “Isocratic elution system for the determination of catechins, cafeine and gallic acid in green tea using HPLC”, Food Chemistry 68, pp 115–121 41 Yagi, K (1998), Free Radicals and Antioxidant Protocols, 108:101-106 42 Yokozawa Takako; Nakagawa Takako; Kitani Kenichi (2002), “Antioxidative activity of green tea polyphenol in cholesterol-fed rats”, Journal of Agricultural and Food chemistry 43 Yukihiko Hara (2001), Green Tea - Health Benefits and Applications, Marcel Dekker, Inc., USA, chapter 44 Zhou, Y.-D., Kim, Y.-P., Li, X.-C., Baerson, S.R., Agarwal, A.K., Hodges, T.W., Ferreira, D., Nagle, D.G., (2004), Hypoxia-inducible factor-1 activation by ()-epicatechin gallate: Potential adverse effects of cancer chemoprevention with high-dose green tea extracts, J Nat Prod 67, 2063–2069 45 Zhu, Manqun; Huang, Tzou-Chi; Lin, Jen-Kun; Yang, Chung S.; Ho, Chi-Tang (2002), “Free Radical and Oxidative Reactions of (-)-Epigallocatechin and (-)Epigallocatechin Gallate, Two Major Polyphenols in Green Tea”, ACS Symposium Series PHỤ LỤC Hình PL 1.1 Sắc kí đồ EGCG mẫu chuẩn Hình PL 1.2 Sắc kí đồ EGCG mẫu thử PHỤ LỤC CÔNG TY…………… Trang: /5 TÀI LIỆU SẢN XUẤT GỐC Số: Ngày hiệu lực: Thay số: CAO KHÔ CHÈ XANH Biên soạn: Kiểm tra: Phê chuẩn: Họ Tên: Họ tên: Họ tên: Chức vụ: Chức vụ: Chức vụ: Chữ ký: Chữ ký: Chữ ký: Ngày: Ngày: Ngày: DANH SÁCH PHÂN PHỐI TÀI LIỆU: 1- Xưởng Sản xuất sao: 01, 02 2- Phòng Kiểm Nghiệm sao: 03 3- Phòng Nghiên Cứu Phát Triển sao: 04 4- Phòng Đảm Bảo Chất Lượng sao: 05, lưu gốc KIỂM SOÁT Tài liệu sản xuất phân phối lưu trữ theo chế độ kiểm soát MỤC LỤC 1- Thông tin sản phẩm trang 2- Công thức trang 3- Đặc điểm kỹ thuật nguyên liệu trang 4- Thiết bị sử dụng trang 5- Sơ đồ trình sản xuất trang 6- Mơ tả q trình sản xuất trang 7- Các yêu cầu kiểm tra, kiểm soát chất lượng trang 1- Thông tin sản phẩm: - Tên sản phẩm: Cao khô chè xanh - Cách chế biến: Sấy phun sương - Tính chất:bột mịn, màu nâu đỏ, mùi thơm dược liệu - Độ ẩm: 5% - Nồng độ chất bảo quản: 0,1% acid citric tính theo thể tích cao CƠNG TY…………… Trang: /5 TÀI LIỆU SẢN XUẤT GỐC Số: Ngày hiệu lực: Thay số: CAO KHƠ CHÈ XANH - Định tính: * Bằng phản ứng hóa học: Phản ứng với FeCl3, tạo tủa xanh đen * Bằng SKLM: Trên sắc ký đồ dung dịch mẫu thử phải có vết có trị số Rf màu sắc, hình dạng tương ứng với vết sắc ký đồ dung dịch mẫu đối chiếu - Độ nhiễm khuẩn: theo DĐVN III 2- Công thức: cho 100 g cao (qui 0% ẩm) TT Tên nguyên liệu Công thức Đơn vị Đọt chè xanh 6,0 kg Acid citric 0,1 gam Ethanol 60% 10,0 lít 3- Đặc điểm kỹ thuật nguyên liệu: 3.1 Chè (Camellia sinensis) Đạt TCCS 3.2 Acid citric Đạt tiêu chuẩn dược dụng 3.3 Ethanol 60% Đạt tiêu chuẩn dược dụng 4- Thiết bị sử dụng: TT Thiết bị Bình ngấm kiệt Máy quay Tủ sấy Máy sấy phun sương Nơi sản xuất Việt Nam Thụy Sĩ Đức Thụy Sĩ Mã số CÔNG TY…………… Trang: /5 TÀI LIỆU SẢN XUẤT GỐC Số: Ngày hiệu lực: Thay số: CAO KHÔ CHÈ XANH 5- Sơ đồ q trình sản xuất kiểm sốt chất lượng: Rửa dược liệu Đọt chè búp Tủ sấy (120 C/ 10 phút) Ức chế men Chiết xuất o DL xử lý Bình ngấm kiệt Dịch chiết Máy cô quay Tinh chế Dịch chiết Dịch chiết tinh chế Máy sấy phun sương Cao Chè xanh Kiểm nghiệm bán thành phẩm Đạt tiêu chuẩn Đóng gói Nhập kho CÔNG TY…………… Trang: /5 TÀI LIỆU SẢN XUẤT GỐC Số: Ngày hiệu lực: Thay số: CAO KHÔ CHÈ XANH 6- Mơ tả q trình sản xuất 6.1 Chuẩn bị dược liệu Chè xanh rửa nước sạch, khơng để dập dược liệu, sau để 6.2- Chế biến 6.2.1- Chiết xuất: Ngấm kiệt dược liệu Dược liệu ức chế men nhiệt khô 120 oC 10 phút, xay dược liệu đạt kích thước 0,3–0,5 mm Làm ẩm dược liệu thể tích vừa đủ ethanol 60% Cho dược liệu vào bình ngấm kiệt, vừa thêm dung môi ethanol 60% vừa mở khố bình ngấm kiệt đến đuổi hết khí bình dung mơi ngập mặt dược liệu Ngâm 24 Sau rút nhỏ giọt dịch chiết với tốc độ ml/ phút, đồng thời bổ sung dung mơi phía cho lớp dung mơi ngập dược liệu khoảng 3-4 cm, thu lượng dịch chiết gấp 6,5 lần lượng dược liệu Tiến hành cô quay để loại bớt dung môi thu cao lỏng với thể tích cịn ½ thể tích ban đầu 6.2.2 Tinh chế dịch chiết Cao lỏng gia nhiệt đến 40 oC, thêm dung dịch gelatin 25% vào (tỉ lệ lần thể tích cao lỏng lần thể tích gelatin), làm lạnh 10 oC, lọc chân không, thu dịch lọc Cô quay để loại bớt dung môi thu cao lỏng với thể tích cịn ½ thể tích ban đầu Cao lỏng lắc với cloroform (tỉ lệ lần thể tích cao lỏng lần thể tích cloroform), làm lần, thu dịch chiết nước, loại bỏ dịch chiết cloroform Dịch chiết nuớc acid hoá HCl 10% đến pH=3 chuyển pha ethyl acetat (tỉ lệ lần thể tích dịch chiết lần thể tích ethyl acetat), làm lần, thu dịch chiết ethyl acetat Cô quay để loại bớt dung mơi thu cao lỏng có độ ẩm 30-40% CÔNG TY…………… Trang: /5 TÀI LIỆU SẢN XUẤT GỐC Số: Ngày hiệu lực: Thay số: CAO KHÔ CHÈ XANH 6.2.2- Sấy phun sương dịch chiết tinh chế: Cao lỏng pha loãng cồn 60% với tỉ lệ 1/80, sau đem sấy phun sương máy BUCHI B-290 công suất lít/ giờ, sản phẩm thu cao khơ chè xanh 6.3- Đóng gói: Sau có kết kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn Đóng cao bao PE, bao đóng 100 g cao khơ chè xanh quy 0% ẩm Nhãn ghi rõ tên nồng độ chất bảo quản dùng (g/ kg) tính theo khối lượng cao khan, khối lượng thực độ ẩm thực cao 6.4- Bảo quản: nơi khô mát 7- Các yêu cầu kiểm tra: 7.1- Kiểm tra trình sản xuất: 7.1.1- Nhận nguyên liệu: nguyên liệu, khối lượng đạt tiêu chuẩn 7.1.2- Cân nguyên liệu: theo công thức 7.1.3- Rửa nguyên liệu: theo qui trình 7.1.4- Chiết xuất: khối lượng dược liệu mẻ, thể tích ethanol sử dụng, thời ngấm kiệt, tốc độ rút dịch chiết 7.1.5- Cơ dịch chiết: thể tích dịch cô, độ ẩm qui định cao nồng độ chất bảo quản 7.2- Kiểm nghiệm bán thành phẩm: 7.2.1- Mẫu phải lấy: cao khơ chè xanh đóng gói bảo quản 7.2.2- Yêu cầu kiểm: đầy đủ tiêu theo tiêu chuẩn 7.3- Kiểm trình đóng gói: 7.3.1- Qui cách đóng gói: khối lượng cao khan, khối lượng cao thực 7.3.2- Nhãn dán: ghi đủ CÔNG TY ,…………… Trang: i / i TÀI LIỆU SẢN XUẤT GỐC Số: Ngày hiệu lực: Thay số: CAO KHÔ CHÈ XANH 7-Xem xét / Sửa đổi / Bổ sung: Số SOP Ngày ban hành Ngày xem xét Nội dung Sửa đổi hay Bổ sung