Nghiên cứu sản xuất một số chủng vi khuẩn dạng đông khô trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN DẠNG ĐÔNG KHÔ TRONG KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM VI SINH Phan Văn Hiếu1,, Vũ Thị Bích Hồng1, Đặng Thị Ngọc Dung1,3, Đồn Mai Phương2 Nguyễn Xuân Đạt1 Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học – Trường Đại học Y Hà Nội, Bệnh viện Vinmec Times City, Bộ mơn Hóa sinh – Trường Đại học Y Hà Nội Nghiên cứu sản xuất mẫu kiểm tra chất lượng vi sinh dạng đông khô để cung cấp cho phòng xét nghiệm nước nhằm nâng cao chất lượng xét nghiệm Nghiên cứu thực thiết bị đông khô Virtis Advantage Pro SP Scientific chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 với dung dịch bảo vệ Skimmilk 20% Sản phẩm đông khô đánh giá tiêu chuẩn đặc tính vật lý, độ sống, độ ẩm tồn dư, độ vô khuẩn, độ đồng độ ổn định vòng tháng Kết thu cho thấy tất lọ sản phẩm đơng khơ thu thỏa mãn tiêu chí chất lượng đề mặt cảm quan, tính háo nước, độ tơi xốp Các mẫu kiểm tra có độ sống ≥ 103CFU/mL, độ ẩm tồn dư < 4%, độ vô khuẩn độ đồng đạt 100%, mẫu ổn định tối thiểu tháng Như quy trình đông khô áp dụng nghiên cứu phù hợp cho mục đích sản xuất mẫu kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh dạng đông khô từ chủng vi khuẩn Từ khố: Đơng khơ khuẩn, độ đồng nhất, độ ổn định, độ sống, kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh I ĐẶT VẤN ĐỀ Vấn đề đánh giá lực xét nghiệm nâng cao chất lượng hoạt động phòng xét nghiệm lâm sàng nhiệm vụ quan trọng giai đoạn Chính phủ Bộ Y tế ngày quan tâm đạo triển khai thực mạnh mẽ Đề án 316/QĐ-TTg Thủ cần có mẫu kiểm tra chất lượng từ chủng vi khuẩn phù hợp để thực hiện.2,3 Hiện nay, đa số phòng xét nghiệm Việt Nam sử dụng chủng chuẩn mua từ nước ngồi thơng qua đơn vị phân phối nước với giá thành cao, hệ lớn gặp khó khăn tướng tăng cường lực hệ thống quản lý chất lượng xét nghiệm y học giai đoạn 2016 2025 đề nhiệm vụ Việt Nam tự nghiên cứu sản xuất mẫu kiểm tra chất lượng xét nghiệm.1 Một yếu tố quan trọng kiểm soát chất lượng xét nghiệm vi sinh phòng xét nghiệm phải thực nội kiểm ngoại kiểm, hai trình việc lưu giữ chủng làm giảm tính ổn định dài hạn chủng vi khuẩn Nghiên cứu sản xuất mẫu kiểm tra chất lượng vi sinh từ chủng vi khuẩn gần gũi với đặc điểm bệnh sinh Việt Nam để cung cấp cho phòng xét nghiệm nước giúp giải hạn chế Tác giả liên hệ: Phan Văn Hiếu Trường Đại học Y Hà Nội Email: phanvanhieu@hmu.edu.vn Ngày nhận: 15/01/2021 Ngày chấp nhận: 08/03/2021 TCNCYH 140 (4) - 2021 Bảo quản chủng vi khuẩn lâu dài phương pháp đông khô phương pháp phổ biến tổ chức uy tín ngân hàng chủng chuẩn Hoa Kỳ ATCC hay ngân hàng chủng chuẩn Anh Quốc khuyến cáo thực hiện.4,5 Các tổ chức ngoại kiểm nước phát triển Đại học Hoàng gia bệnh TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC học Australia, chương trình thử nghiệm độ thành thạo vi sinh lâm sàng Canada, dịch vụ ngoại kiểm tra chất lượng quốc gia Vương quốc Anh sản xuất áp dụng rộng rãi mẫu ngoại kiểm dạng đông khô Qua thực tế tham gia trực tiếp vào chương trình ngoại kiểm cho thấy ưu điểm vượt trội mức độ thử thách, độ đa dạng vi khuẩn, độ ổn định loại mẫu đơng khơ Trước tình hình đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài với mục tiêu hồn thiện quy trình sản xuất đánh giá chất lượng số chủng vi khuẩn đông khô sử dụng kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng Các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 29213 hệ F3, Escherichia coli ATCC 29212 hệ F1, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 hệ F1 Tiêu chuẩn chấp nhận: Chủng chuẩn vi khuẩn ATCC nhất, hệ từ F0 đến F5 có lý lịch chủng nhà sản xuất cung cấp Tiêu chuẩn loại trừ: Chủng có kết định danh không giống nhà sản xuất công bố lý lịch chủng Kết nội kiểm kháng sinh đồ máy Vitek Compact không đạt Phương pháp Thiết kế nghiên cứu: Thực nghiệm phòng xét nghiệm Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11 năm 2019 đến tháng 08 năm 2020 Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Kiểm chuẩn Chất lượng Xét nghiệm Y học thuộc Trường Đại học Y Hà Nội Viện Công nghệ thực phẩm Phương pháp chọn mẫu cỡ mẫu: Chọn mẫu phù hợp với tiêu chuẩn lựa chọn loại trừ với cỡ mẫu: 50 lọ mẫu/chủng x chủng = 150 lọ mẫu Các số nghiên cứu: Đặc tính vật lý, độ ẩm tồn dư, độ sống, độ nhất, độ đồng nhất, độ ổn định Các bước tiến hành nghiên cứu Thu thập kiểm tra đặc tính chủng vi khuẩn trước đơng khơ: Chủng chuẩn ATCC sau hoàn nguyên lên cấy lên đĩa thạch máu thạch UTI, nuôi cấy điều kiện 35-370C vịng 18-24 Quan sát tính chất khuẩn lạc đặc điểm nhuộm Gram thực định danh kháng sinh đồ hệ thống Vitek Compact Sử dụng thẻ kháng sinh AST-GP67 cho chủng Staphylococcus aureus, thẻ AST-GN92 cho chủng Escherichia coli, thẻ AST-N204 cho chủng Pseudomonas aeruginosa Chuẩn bị phân phối mẫu: Thực gặt chủng vi khuẩn nuôi cấy nước muối 0,9% vô trùng, đo độ đục thiết bị Densicheck plus đảm bảo cho độ đục huyền dịch > 2McF, tiếp tục pha với dung dịch SKimmilk 20% với thể tích tương đương để thu huyền dịch vi khuẩn có độ đục > 1McF Phân phối mẫu cách dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch huyền dịch nhỏ vào đáy ống đông khô, không làm dính dung dịch lên mép thành ống Mỗi loài 50 ống Đồng thời thực cấy đếm để kiểm tra độ sống lọ huyền dịch vi khuẩn chuẩn bị Đông khô mẫu: Thực đông khô lọ mẫu chuẩn bị thiết bị Virtis Advantage Pro SP Scientific với chương trình sau: Giai đoạn làm đông: Nhiệt độ - 400C, trì vịng Giai đoạn khơ cấp một: Nhiệt độ -300C, áp suất 200 mtorr trì vịng 10 Giai đoạn khơ cấp hai: Tăng nhiệt độ lên đến 250C áp suất 200mtorr tổng thời gian Đánh giá chất lượng mẫu sau đông khô: TCNCYH 140 (4) - 2021 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Sản phẩm sau đơng khơ đánh giá tiêu tính chất vật lý, độ ẩm tồn dư, độ nhất, độ đồng thời điểm sau đông khô Độ sống, độ ổn định đánh giá tháng lần vòng tháng Xử lý số liệu Số liệu nghiên cứu xử lý phần mềm Microsoft Excel 2017 Thống kê mô tả áp dụng để trình bày tần suất, tỷ lệ % chất lượng mẫu vi khuẩn đông khô nghiên cứu Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu thực mục đích khoa học Các chủng vi khuẩn có nguồn gốc rõ ràng sử dụng quy mô phịng xét nghiệm, q trình sử dụng, vận chuyển, bảo quản tuân thủ đầy đủ biện pháp đảm bảo an toàn chất lây nhiễm loại B theo quy định Bộ Y tế III KẾT QUẢ Kết đánh giá chất lượng mẫu sau đông khô Tất sản phẩm thu đảm bảo yêu cầu tính chất vật lý; mẫu đóng bánh đều, màu sắc đồng nhất, xốp mịn, khơng vón cục, khơng bị teo vỡ, tan nhanh hoàn nguyên (Bảng 1) Bảng Kết đánh giá ban đầu chất lượng mẫu đơng khơ STT Nội dung kiểm tra Tính chất vật lý Tiêu chuẩn Kết Mẫu đóng bánh đều, màu sắc đồng nhất, xốp mịn, khơng vón cục, khơng bị teo vỡ, tan nhanh hoàn nguyên Đạt 2,18% S aureus Độ ẩm tồn dư E coli < 4% 1,99% P aeruginosa Độ 2,65% 100% Đạt Độ ẩm tồn dư lọ mẫu đông khô kiểm tra chủng vi khuẩn 10>3 10 CFU/ml, thỏathỏa mãnmãn tiêu chí đề 3 tiêu chí đềTCVN theo9298:2014 TCVN 9298:2014 ≥ 10 CFU/ml, S.ATCC aureus ATCCcó29213 cóvimật độ vitrung bình trong S aureus 29213 mật độ khuẩn ≥ 10 CFU/ml, CFU/ml và7 CFU/ml E coli ATCC có nồng độcó thấp mật độ 4.3x đơng cao 2.5x10 khuẩn trung bìnhkhơ saucao đơng khơ 2.5x10 E 25922 coli ATCC 25922 nồng độvới thấp CFU/ml (Hình CFU/ml 1) với mật độ 4.3x10 (Hình 1) 10 Log CFU/ml S aureus E coli P aeruginosa Thời gian Hình Độ sống chủng vi khuẩn đông khô theo thời gian Hình Độ sống chủng vi khuẩn đơng khơ theo thời gian Chú thích: Mốc thời gian tương đương với thời điểm trước đông khô, mốc tương đương thời điểm kiểmChú tra độ đồng đông khô,với mốc từ 3trước đến đơng tương ứng với2 khoảng thích: Mốc thời giansau tương đương thời điểm khô, mốc tương đương thời điể tra độ đông từ mốc từ 36đến tương ứng với khoảng thời gian ki thời gian kiểm trađồng độ ổnnhất địnhngay sau sau đông khô khô, đến tháng độ ổn định sau đông khô từ đến tháng Đánh giá độ ổn định Mẫu đông khô tiến hành kiểm tra độ ổn định theo hướng dẫn ISO/ IEC 13528: 2015: Lựa chọn ngẫu nhiên lọ mẫu/lồi sau đơng khơ, thực định danh kháng sinh đồ hệ thống Đánh giá độ ổn định Vitek Compact tháng lần vòng tháng Kết định danh mẫu giống với kết định danh chủng gốc với độ tin cậy dao động từ 93% đến 99% Kết kháng sinh đồ thu giống với kết kháng sinh đồ chủng trước đông khô thỏa mãn tiêu chuẩn giới hạn QC công bố CLSI M100 cập nhật năm 2019 Như sản phẩm đông khơ lồi có độ ổn định đạt 100%, thỏa mãn tiêu chí đề theo ISO/IEC 13528:2015 Mẫu ổn định tối thiểu vòng tháng IV BÀN ḶN Các đặc tính vật lý mẫu đơng khơ tiêu chí quan trọng ban đầu giúp đánh giá sơ sản phẩm đơng khơ có đạt chất lượng hay không Kết đánh giá sản phẩm nghiên cứu cho thấy 100% sản phẩm đóng bánh đều, đẹp, màu trắng ngà, không bị teo, vỡ hay sủi bọt bám lên thành ống, sản phẩm xốp, mịn, khơng vón cục tan hồn tồn vịng phút sau hoàn nguyên Kết thu hoàn toàn phù hợp với tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9298:2014 kết nghiên cứu N.T Kê cộng năm 1999.5,6 Việc kiểm tra độ ẩm tồn dư thực Trung tâm phân tích Giám định thực TCNCYH 140 (4) - 2021 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC phẩm Quốc gia - Viện Công nghệ thực phẩm theo quy trình phân tích phương pháp thử Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4846:1989, kết đo lường cho thấy lọ có độ ẩm tồn dư cao 2,89%, thấp 1,47% độ ẩm tồn dư trung bình 2,27% Kết nghiên cứu phù hợp với tiêu chuẩn cho tiêu sản phẩm đông khô vi sinh vật vacxin theo quy định Viện kiểm định Vacxin Quốc gia Tổ chức y tế Thế giới ≤ 3% Quyết định số 03/1999/QĐ-BNN/TCCB cứu Yukie Miyamoto-Shinohara cộng (2000).10 Kết nghiên cứu cho thấy cầu khuẩn S aureus có tỷ lệ sống cao so với trực khuẩn lại, kết nghiên cứu phù hợp với kết luận nghiên cứu Kandil S El Soda M (2015).11 E coli P aeruginosa chủng di động có tỷ lệ sống sau đơng khơ thấp so với chủng không di động S aureus, kết phù hợp với kết nghiên cứu Morgan CA cộng (2006).12 ngày 06/01/1999 việc ban hành tiêu chuẩn nghành bảo quản ngắn hạn nguồn gien vi sinh vật nông nghiệp (348-99) bảo quản dài hạn nguồn gien vi sinh vật nông nghiệp phương pháp đông khô (349-99) < 4%.7 Độ ẩm tồn dư nghiên cứu cao so với kết nghiên cứu số tác A Mehaffey cộng (1984) < 1% nghiên cứu W Griffin C Cook (1981) 0,2 - 0,4%.8,9 Đối chiếu lại quy trình đơng khơ nghiên cứu nhận thấy thời gian giai đoạn đông khô cấp nghiên cứu kéo dài 25 giờ, nhiều lần so với thời gian giai đoạn tương ứng nghiên cứu Điều lần khẳng định tầm quan trọng thời gian giai đoạn đông khô cấp liên quan đến độ ẩm tồn dư sản phẩm Độ đồng cao cho thấy quy trình sản xuất ổn định, chất lượng lọ mẫu tương đương Đặc biệt mẫu ngoại kiểm việc đảm bảo độ đồng yêu cầu bắt buộc quy định rõ ISO 13528:2015.13 Nếu lơ mẫu khơng đảm bảo tính đồng khơng chấp nhận cho mục đích làm mẫu kiểm tra chất lượng xét nghiệm Số lượng mẫu để kiểm tra độ đồng loài nghiên cứu 10 lọ dựa hướng dẫn ISO 13528:2015.13 Kết kiểm tra độ đồng định danh kháng sinh đồ chủng vi khuẩn sau đông khô nghiên cứu chúng tơi hồn tồn giống với kết kiểm tra đặc tính chủng vi khuẩn trước đơng khơ cho thấy độ đồng sản phẩm đông khô đạt 100% Phù hợp với tiêu chuẩn độ đồng thể ISO 13528:2015.13 Kết nghiên cứu độ sống cho thấy nhìn chung nồng độ chủng vi khuẩn có có xu hướng giảm mạnh thời điểm sau đơng khơ trì ổn định khoảng thời gian tháng kiểm tra ổn định sau đó, độ sống chủng vi khuẩn thời điểm sau đông khô >103 CFU/mL, phù hợp với tiêu chuẩn đề theo TCVN 9298:2014.5 Chủng có tỷ lệ sống sau đơng khơ cao S aureus dao động từ 77% - 84%, thấp E coli dao động quanh 43% - 48% Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên Chúng thực kiểm tra độ ổn định cho mẫu vi khuẩn đơng khơ vịng tháng Kết kiểm tra độ ổn định định danh kháng sinh đồ hoàn toàn giống với kết kiểm tra độ đồng kết kiểm tra đặc tính chủng vi khuẩn trước đơng khơ cho thấy độ ổn định mẫu đông khô nghiên cứu đạt 100% phù hợp với tiêu chuẩn độ ổn định theo ISO 13528:2015.13 Từ rút kết luận thời gian ổn định mẫu vi khuẩn đông khô nghiên cứu tối thiểu tháng Kết nghiên cứu TCNCYH 140 (4) - 2021 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC chúng tơi tương đồng với kết nghiên cứu tác giả S Kandil M El Soda (2015) tác giả N.Đ Tú cộng (2015).11,14 Một số nghiên cứu giới cho thấy thời gian ổn định mẫu vi khuẩn đông khô kéo dài nghiên cứu Yukie Miyamoto cộng (2000) 10 năm, Sakane cộng (1997) 20 năm.10,15 Từ sở đó, chúng tơi tiếp tục theo dõi thời gian ổn định tối đa chủng nghiên cứu thời gian tới Hướng dẫn thực hành kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng ban hành theo định số 1539/QĐ-BYT ngày 20/4/2017 Bộ Y tế V KẾT LUẬN Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9298-2014 Về vi sinh vật - bảo quản dài hạn vi sinh vật dùng nông nghiệp - phương pháp đơng khơ Bộ KH&CN 2014 Hồn thiện quy trình đơng khơ cho chủng vi khuẩn S aureus ATCC 29213, E coli ATCC 25922, P aeruginosa ATCC 27853 thiết bị Virtis Advantage Pro SP Scientific với dung dịch bảo vệ Skim milk 20% Áp dụng quy trình sản xuất thành cơng mẫu vi khuẩn đông khô chủng vi khuẩn S aureus ATCC 29213, E coli ATCC 25922, P aeruginosa ATCC 27853 đảm bảo yêu cầu chất lượng tính chất vật lý, độ ẩm tồn dư, độ nhất, độ sống, độ đồng nhất, độ ổn định theo tiêu chuẩn ISO 13528:2015, TCVN 9298:2014 TCN 34:99 LỜI CẢM ƠN Đề tài nghiên cứa nhận hỗ trợ kinh phí đề án 316/QĐ-TTg “Tăng cường lực hệ thống quản lý chất lượng xét nghiệm y học giai đoạn 2016-2025” Thủ tướng Chính phủ Nhóm nghiên cứu cam kết khơng có xung đột lợi ích với tổ chức, cá nhân từ kết nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Quyết định 316/QĐ-TTg ngày 27 tháng năm 2016 Thủ tướng Chính phủ phê duyệt đề án tăng cường lực hệ thống quản lý chất lượng xét nghiệm y học giai đoạn 2016-2025 Đặng Thị Ngọc Dung, Tạ Thành Văn Kiểm Soát Chất Lượng Xét Nghiệm - Nội Kiểm Thống Kê Nội Kiểm Trong Kiểm Soát Chất Lượng Xét Nghiệm y Học Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật; 2018 4.LeeJJ.ATCCPreservationMethods:Freezing and Freeze-Drying J Protozool 1992;39(5):651651 doi:10.1111/j.1550-7408.1992.tb04871.x Nguyễn Thị Kê, Nguyễn Thị Thế Yến, Huỳnh Ánh Hồng Nghiên cứu sản xuất Vacxin mẫu chuẩn quốc gia Bạch hầu - Uốn ván - Ho Gà Viện Vacxin chế phẩm sinh học IVAC 1999 Quyết định số 03/1999/QQD-BNN/TCCB ngày 06/01/1999 việc ban hành tiêu chuẩn nghành bảo quản ngắn hạn nguồn gien vi sinh vật nông nghiệp (348-99) bảo quản dài hạn nguồn gien vi sinh vật nông nghiệp phương pháp đông khô (349-99) Mehaffey MA, Cook EC, Griffin CW Preparation and stability of freeze-dried Neisseria gonorrhoeae cultures used for external quality control J Clin Microbiol 1984;20(6):1126-1129 doi:10.1128/JCM.20.6.1126-1129.1984 Griffin W, Cook C, Mehaffey A Predicting the Stability of Freeze-Dried Fusobacterium mwtiferum Proficiency Testing Samples by Accelerated Storage Tests’ Cryobiology 1981;18(4):420-425 10 Miyamoto-Shinohara Y, Imaizumi T, Sukenobe J, Murakami Y, Kawamura S, Komatsu Y Survival Rate of Microbes after Freeze-Drying and LongTerm Storage Cryobiology 2000;41(3):251-255 TCNCYH 140 (4) - 2021 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC doi:10.1006/cryo.2000.2282 11 Kandil S, El Soda M Influence of Freezing and Freeze Drying on Intracellular Enzymatic Activity and Autolytic Properties of Some Lactic Acid Bacterial Strains Adv Microbiol 2015;05(06):371-382 doi:10.4236/ aim.2015.56039 12 Morgan CA, Herman N, White PA, Vesey G Preservation of micro-organisms by drying; A review J Microbiol Methods 2006;66(2):183193 doi:10.1016/j.mimet.2006.02.017 13 ISO 13528 Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparison 2015 14 Nguyễn Đồng Tú, Ngơ Tuấn Cường, Lê Thanh Hương Hồn thiện quy trình sản xuất đánh giá độ ổn định mẫu hỗn hợp vi khuẩn đông khô Tạp Chí Học Dự Phịng 2015;XXV:172-173 15 Sakane, T Viabilities of dried cultures of various bacteria after preservation for over 20 years and their prediction by the accelerated storage test Microbiol Cult Coll 1997;13:1-7 Summary PRODUCTION OF LYOPHILYZED BACTERIAL SAMPLE USED IN MICROBIOLOGY QUALITY CONTROL The objective of this study is to design a procedure for producing and distributing lyophilized microbiology quality control specimens to laboratories in Viet Nam for improving laboratory quality The study used Virtis Advantage Pro SP Scientific instrument to lyophilize Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922 and Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 with Skimmilk 20% is cryoprotectant material The final products are assessed for physical property, survival rate, residual moisture content, purity, homogeneity and stability for months All of final products meet the criteria for physical properties, the survival densities are >103 CFU/mL, residual moisture content is