TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ ĐAN SÂM
Cây đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge, thuộc chi Salvia, họ Bạc hà (Lamiaceae)
Cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) còn gọi là huyết sâm, xích sâm, huyết căn là cây cỏ sống lâu năm, cao 30-80 cm, toàn thân mang lông ngắn màu vàng trắng nhạt Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính 0,5-1,5 cm, màu đỏ nâu Thân vuông trên có các gân dọc Lá kép, mọc đối: 3-5 lá chét, đặc biệt có thể có 7 Lá chét mọc giữa thường lớn hơn cả Lá kép có cuống dài, cuống lá chét ngắn có dìa
Lá chét dài 2-7,5 cm, rộng 0,8-5 cm Mép lá chét có răng cưa tù Mặt trên lá chét màu xanh, có các lông mềm màu trắng, mặt dưới màu xanh tro, cũng có lông nhưng dài hơn Gân nổi ở mặt dưới, chia phiến lá thành nhiều múi nhỏ Cụm hoa mọc thành chùm ở đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10-20 cm Hoa mọc vòng, mỗi vòng 3-10 hoa, thường là 5 hoa Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, 2 môi, môi trên trông nghiêng hình lưỡi liềm, môi dưới xẻ 3 thùy, thùy giữa có răng cưa tròn Hai nhị ở môi dưới, bầu có vòi dài lòi ra ở môi trên Quả nhỏ, dài 3 mm, rộng 1,5 mm [1,14]
S miltiorrhiza được phân bố rộng rãi ở miền Bắc Trung Quốc Nó cũng có mặt tại Nhật Bản [31] Cây đan sâm Việt Nam có nguồn gốc Trung Quốc [1] thích hợp với đất cát ẩm, được trồng bằng rễ vào mùa xuân [6] Cây trồng ở trại thuốc Sa
Pa (Viện Dược liệu) tỏ ra thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới vùng núi cao
Cây sinh trưởng phát triển tương đối tốt, ra hoa quả hàng năm, hạt giống thu được đã gieo đi gieo lại nhiều năm Một số cây đưa xuống trại thuốc Tam Đảo (Viện Dược liệu) sinh trưởng kém hơn [1] Cây trồng tốt nhất vào tháng 2-3 để đến tháng
11-12 thu hoạch [1] Mùa hoa từ tháng 5-8 (Tam Đảo), mùa quả tháng 6-9 [14] Thu hoạch rễ từ cuối mùa thu đến đầu mùa xuân [6]
Cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của đan sâm Thành phần hóa học chính là acid phenolic, diterpenoid, flavonoid và một số thành phần khác Bộ phận trên mặt đất của có chứa flavonoid, triterpenoid và monoterpenoid đặc biệt là trong hoa và lá Trong khi đó, diterpenoid và acid phenolic lại được tìm thấy chủ yếu ở rễ [28] a Diterpenoid
Nhóm diterpenoid bao gồm rất nhiều chất có cấu trúc khác nhau được phân thành 4 phân nhóm là abietane diterpenoid, clerodane diterpenoid, pimarane diterpenoid và labdane diterpenoid Chủ yếu là abietane diterpenoid ở trong rễ, clerodane diterpenoid và labdane diterpenoid thì ít hơn [31]
Thành phần chính trong nhóm abietane diterpenoid là các tanshinon như tanshinon I, II và III, sau đó đến isotanshinon I và II, isocryptotanshinon và cryptotanshinon [31] (hình 1.2)
25 R = R 1 = H, Δ 5(10),6(7) 19-21.Tanshinon I, II, III 24 Isocryptotanshinon 22-23 Isotanshinon I, II 25 Cryptotanshinon
Hình 1.2 Cấu trúc một số abietane diterpenoid b Các dẫn xuất của acid phenolic
Các acid phenolic là thành phần chính trong nhóm chất tan được trong nước của đan sâm Thành phần chính của nhóm này là acid rosmarinic và các acid salvianolic từ A - K [35]
Hình 1.3 Cấu trúc một số acid phenolic c Flavonoid
Thành phần có mặt nhiều nhất chính là flavon, flavonol và các dẫn xuất của chúng [35]
- Flavon và aglycon flavon: thành phần chính là apigenin (5,7,4’-trihydroxyflavon) và luteolin (5,7,3’,4’- tetrahydroxyflavon) và các dẫn xuất 6- hydroxylat của chúng
- Flavon và flavonol glycosid: các flavon O-glycosid xuất hiện phổ biến trong các loài thuộc chi Salvia L và nhiều nhất trong số đó là các flavon 7-glycosid như apigenin 7-glucosid (cosmosiin), luteolin 7-glucosid (cinarosid) và các
7-glucuronid tương ứng của chúng
- Các flavonoid khác như: các anthocyanin là thành phần có mặt rất nhiều trong các hoa đỏ hay đỏ tía ở các loài thuộc chi Salvia L d Một số thành phần khác
Triterpenoid phổ biến nhất và được tìm thấy trong đan sâm là acid ursolic và acid oleanolic (hình 1.4) Ngoài ra còn tìm thấy 1 số triterpenoid khác như anagadiol, taraxerol acetate, germanicol (hình 4), navidiol,…[ 31]
Ngoài ra còn có Tanin và một số thành phần khác [35]
1 R=H, R 1 =R 2 =Me, R 3 =H 3 OH OH H Me Me 4
1 Acid ursolic 2 Acid oleanolic 3 Anagadiol 4 Taraxerol 5.Germanicol
Hình 1.4 Cấu trúc một số triterpenoid có trong chi Salvia L
Hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của loài Salvia miltiorrhiza Bunge Các tác dụng đã được chứng minh bao gồm:
- Làm giãn mạch vành, chống huyết khối, chống thiếu máu cục bộ Các tác dụng này do các thành phần tanshinon IIA, acid rosmarinic, danshensuan B, acid salvinolic B, militron và salvinon Ngoài ra, đan sâm còn được chứng minh có tác dụng chống đau thắt ngực [1-2,14,21,25,29]
- Tác dụng làm hạ đường huyết do có chứa thành phần là acid polyphenolic [25]
- Rễ đan sâm có tác dụng hạ lipid máu, ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở tế bào [2,10]
- Tác dụng an thần do thành phần miltiron nên được sử dụng điều trị chứng mất ngủ [7,10]
- Dịch chiết đan sâm có tác dụng chống vi khuẩn, kể cả vi khuẩn
Staphylococus kháng thuốc Các thành phần như dihydrotanshinon I, hydroxytanshinon II-A, cryptotanshinon, methyl tanshinat và tanshinon II-B được chứng minh có tác dụng chống vi khuẩn Staphylococus aureus [10,12,21,36]
- Chống nấm, tốt cho trường hợp nấm ngoài da, mụn trứng cá, rụng tóc, ngứa và mày đay [10]
- Hoạt tính chống viêm do có thành phần tanshinon IIA có tác động trên hệ miễn dịch [11]
- Hoạt tính chống oxy hóa gây bởi dihydrotanshinon I [2], acid salvinolic A,
B, acid rosmarinic [1], và các chất thuộc nhóm polysaccarid [12]
- Mang lại lợi ích cho bệnh nhân suy thận mạn tính [2]
- Tanshinon IIA còn có tác dụng chống ung thư [10-11]
- Đan sâm có tác dụng làm mềm và thu nhỏ thể tích của gan và lá lách khi sưng to do bệnh gan và huyết hấp trùng, có tác dụng an thần, gây ngủ và tác dụng làm giảm các huyết quản nhỏ [7]
- Ngoài ra, tanshinon trong đan sâm còn có tác dụng lên hormon sinh dục: làm tăng nhẹ estrogen và androgen trên chuột [21]
1.1.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền
Tính vị: vị đắng, tính hàn [3]
Quy kinh: quy vào 2 kinh tâm, can [3]
Tác dụng và công dụng:
- Hoạt huyết, trục huyết ứ: dùng để trị vô kinh, hành kinh không đều, đau bụng kinh, bế kinh, sau khi đẻ huyết ứ đọng gây đau bụng; các trường hợp do chấn thương mà cơ gân sưng tấy đau đớn [3]
- Dưỡng tâm an thần: dùng trong các bệnh tâm hồi hộp, mất ngủ, suy nhược thần kinh; dùng trong bệnh co thắt động mạch vành tim, phối hợp với đương quy, táo nhân [1,3] Ngoài ra còn dùng để chữa bệnh nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực, tâm hư phiền nhiệt [2]
- Bổ huyết: có thể dùng đối với các bệnh thiếu máu, đặc biệt đối với các bệnh mặt nhợt nhạt, xanh xao của phụ nữ chưa có chồng Khi dùng với tính chất bổ huyết thì dùng đan sâm dạng không qua chế biến [3,7]
- Bổ can tỳ: dùng trong các trường hợp gan và lá lách bị sưng to, trị bệnh huyết hấp trùng đều có hiệu quả [3,7]
- Giải độc: dùng trong các trường hợp sang lở, mụn nhọt [3]
- Đây còn được xem là thuốc dùng tốt cho trường hợp đau dạ dày hay viêm vú [1,2]
- Đan sâm còn được dùng để điều trị các bệnh viêm gan, xơ gan, suy thận mạn tính, tiểu đường và các biến chứng của tiểu đường [2]
Chú ý: không dùng chung với Lê lô [6].
TỔNG QUAN VỀ TANSHINON IIA
Trong chuyên luận Dược điển của nhiều nước bao gồm Trung Quốc, Anh và Việt Nam, tanshinon IIA là một trong những chất chính được dùng để định tính, có thể định lượng dược liệu đan sâm và cao đan sâm [7][24][34]
Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của tanshinon IIA
1,6,6-trimethyl-8,9-dihydro-7H-naphthol[1,2-g][1]benzofuran-10,11-dion
- Khối lượng phân tử: 294,3444g/mol
- Là bột màu đỏ, rất ít tan trong nước (0,0042 mg/l ở 25 o C), tan tốt trong các dung môi hữu cơ nhất là các dung môi kém phân cực trong methanol (5 mg/ml), ethanol (5mg/ml) ở 25 o C, EtOAc và dimethyl sulfoxit (25mg/ml) [27]
- Tanshinon IIA thuộc nhóm diterpenoid có khung terpenoid, ngoài ra trong phân tử còn có nhóm lacton và xeton Tính chất hóa học của tanshinon IIA có đầy
TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG NGHIÊN CỨU
Tính chất hóa học của tanshinon IIA có đầy đủ tính chất của terpeniod
- Tanshinon IIA không bền vững ở nhiệt độ cao, ánh sáng, độ ẩm và tiếp xúc với oxy Dưới tác động của các tác nhân trên, nó có xu hướng bị phân hủy Đó có thể là lí do chính trong việc giảm hàm lượng tanshinon IIA trong toàn bộ quá trình chiết, cô đặc, xát hạt, sấy khô [27,34]
- Vì có nhân thơm nên có thể sử dụng detector UV-VIS để định tính, định lượng tanshinon IIA Tanshinon hấp thu mạnh UV ở bước sóng từ 254-280 nm [27]
- Các kết quả nghiên cứu in vivo cho thấy tanshinon IIA có tác dụng giảm đáng kể kích thước vùng nhồi máu Cơ chế có thể do khả năng dọn gốc tự do ở màng ty thể tim Tanshinon IIA ức chế quá trình oxi hóa LDL và hoạt động của Angiotensin II, từ đó làm giảm phì đại tế bào cơ tim
1.3 Tổng quan về một số phương pháp hóa lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài 1.3.1 Phương pháp sắc kí cột
Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách các thành phần trong một hỗn hợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh
Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi là
―cột‖ với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp tùy theo khả năng hấp phụ khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để lấy ra lần trước hoặc sau Chất hấp phụ trong sắc ký cột thường dùng là oxid nhôm, silicagel, CaCO 3 , than hoạt tính, polyamide,… Các chất này phải được tiêu chuẩn hóa Dung môi dùng có thể là 1 hoặc 2,3 loại dung môi có tỉ lệ thích hợp Với các chất hấp phụ cổ điển, dung môi sử dụng có độ phân cực tăng dần
1.3.2 Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC)
Dựa vào hệ số phân tách khác nhau của chất cần phân tích giữa 2 pha: pha động và pha tĩnh Chất cần phân tích được hấp phụ (hoặc phân bố, trao đổi ion) trên pha tĩnh, pha động chạy qua pha tĩnh đồng thời kéo theo chất cần phân tích Dựa vào hệ số phân bố khác nhau của mỗi chất đối với pha động và pha tĩnh ta có thể tách riêng từng thành phần trong hỗn hợp phân tích Các thành phần sau khi được phân tách riêng biệt khỏi hỗn hợp được lưu giữ trên pha tĩnh
Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường (nếu các chất phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở các bước sóng 254 nm, 366 nm hoặc phun thuốc thử hiện màu, hoặc quét lên bề mặt bản mỏng thiết bị densitometer, một thiết bị đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả kiến của chất cần phân tích… Tuỳ thuộc bản chất của chất cần phân tích ta có thể sử dụng một trong các phương pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích
- Các đại lượng đặc trưng
+ Hệ số lưu giữ R f Đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ R f Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:
Trong đó: d R là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm) d M là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)
R f có giá trị dao động giữa 0 và 1 + Hệ số lưu giữ tương đối R r
Trong đó: d R,x : là đường đi của chất phân tích (cm) d R,c : là đường đi của chất chuẩn (cm)
(Giá trị R r càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất)
1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) a Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp sắc ký tách các chất ra khỏi hỗn hợp phân tích trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ
- Một số thông số đặc trưng của quá trình sắc ký
Hình 1.6 Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng
- t R: (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó
- t 0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký
- (Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong một điều kiện nhất định)
- W : là chiều rộng đáy pic
- W 1/2 : là chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic
Trong thực nghiệm hệ số dung lượng k ’ được tính theo công thức:
Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha, tức là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tại thời điểm cân bằng Nếu k ’ nhỏ thì t R cũng nhỏ, chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm mẫu do đó làm giảm khả năng tách, nếu k ’ lớn quá thì sẽ dẫn đến doãng pic, độ nhạy thấp và thời gian lưu kéo dài Trong thực tế k ’ nằm trong khoảng 2-5 là tốt nhất
khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng Để tách riêng hai chất thường chọn nằm trong khoảng 1,05 đến 2
Hiệu lực cột được đánh giá thông qua 2 thông số: số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao đĩa lý thuyết (H) Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi tầng sự phân bố chất tan vào hai pha đạt đến một trạng thái cân bằng Mỗi tầng được giả định như một pha tĩnh có chiều cao H
Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết H được tính bằng công thức:
Hệ số bất đối AF (tailing factor):
Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ
W 1/20 : là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic a : là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic
Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 AF 2 Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối
- Độ phân giải đặc trưng cho mức độ tách 2 chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức:
- Độ phân giải cơ bản đạt được khi R S = 1,5 khi đó 2 pic tách khỏi nhau rõ ràng, chỉ xen phủ nhau 0,3 %
R s = 1,0: Hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4 %
R S = 0,75: Hai pic chưa tách nhau b Ứng dụng của phương pháp HPLC:
Dựa vào thời gian lưu, hình dáng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, hoặc chồng phổ của pic thử và pic chuẩn để định tính chất thử
Dùng để kiểm tra tạp chất trong mẫu, trên sắc ký đồ không có pic tại thời gian lưu của tạp chất (dùng chất đối chiếu) khi chạy sắc ký trong cùng điều kiện
Dựa trên nguyên tắc nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng:
- Phương pháp chuẩn hoá diện tích
1.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) a Nguyên tắc
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
Rễ đan sâm sử dụng để nghiên cứu chiết tách được thu hái tại Sapa (Lào Cai) tháng 9/2016 và được TS Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu giám định tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge, họ Bạc hà
(Lamiaceae) Tiêu bản của mẫu nghiên cứu (DS2016.01) được lưu tại Viện Dược liệu và Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
Hình 2.1 Một số hình ảnh cây đan sâm ở huyện Bắc Hà, tỉnh Lào Cai
Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập như ethanol (EtOH), methanol (MeOH), n-hexan, dicloromethan (CH 2 Cl 2 ), chloroform (CHCl 3 ), ethyl acetat (EtOAc), n-Butanol (BuOH) đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp Dung môi dùng cho phân tích: methanol (Merck, Đức), acetonitril (Merck, Đức), nước cất, acid acetic (Merck)
Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silica gel pha thường (0,040 - 0,063 mm, Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản), silica gel pha đảo ODS-A (50μm, YMC Co Ltd.,
Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thường Kieselgel 60 F254 và pha đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch
H 2 SO 4 10 % hơ nóng để phát hiện vết chất
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu
- Năng suất quay cực đo trên máy Jasco DIP-360 digital polarimeter
- Điểm nóng chảy được đo trên máy Stuart SMP3 (Sanyo, Nhật Bản)
- Phổ khối ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy AGILENT
1260 Series LC-MS/MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ)
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một và hai chiều được đo trên máy JEOL ECX 400 (Jeol, Nhật Bản) và sử dụng dung môi CDCl 3 /CD 3 OD, chất nội chuẩn là tetramethylsilan (TMS)
- Phân tích HPLC sử dụng hệ thống sắc ký HPLC Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ).
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Mẫu rễ đan sâm được chiết siêu âm bằng dung môi etanol 80%, 3 lần tại
40 o C và 4 giờ/lần, cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao
- Hòa tan cao và chiết phân bố lỏng-lỏng, cất loại dung môi ở các phân đoạn, chạy sắc ký cột, phân lập được chất
2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc của tanshinon IIA
Trên cơ sở các số liệu đã được công bố trong tài liệu tham khảo, hợp chất được xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp hóa lý gồm:
- Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân NMR
- Phương pháp phổ khối ESI-MS
2.2.3 Phương pháp đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất dựa vào phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
2.2.4 Phương pháp phân tích định lượng bằng HPLC a Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký
Dùng phương pháp HPLC pha đảo để tách, định tính, định lượng tanshinon trong rễ đan sâm Cụ thể, khảo sát các điều kiện sắc lý như nhau:
- Cột sắc ký: Tiến hành khảo sát trên các cột C18 pha đảo
- Pha động: Qua tham khảo tài liệu, khảo sát các loại pha động với thành phần, tỉ lệ, tốc độ dòng khác nhau
- Detector: Lựa chọn sử dụng detector thích hợp trong 3 loại detector UV, FLD, DAD để đảm bảo vừa phát hiện được chất phân tích, vừa tiện lợi cho quá trình phân tích và phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm
- Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất b Tính thích hợp hệ thống
Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn lặp lại 6 lần, thông số độ lệch chuẩn < 2,0 % là hệ thống sắc ký ổn định c Khoảng tuyến tính, đường chuẩn
Chuẩn bị dóy dung dịch chuẩn nồng độ 1-200 àg/ml Tiến hành sắc ký, xõy dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan d Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
- Tiến hành pha loãng mẫu, phân tích sắc ký đồ, giới hạn phát hiện (LOD) có tỷ lệ S/N (chiều cao tín hiệu/nhiễu) đạt 2-3
- Giới hạn phát hiện LOQ = 3,3 x LOD e Độ chính xác Độ chính xác là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt so với giá trị thực khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần Độ chính xác bao gồm độ lặp lại và độ đúng
Tiến hành phân tích 6 mẫu dung dịch tanshinon chuẩn song song, xác định kết quả định lượng theo đường chuẩn, tiến hành trong cùng điều kiện Xác định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa giá trị của các lần định lượng
*Độ đúng Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu thử sao cho nồng độ tanshinon IIA vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát
Tiến hành: Chuẩn bị các dung dịch sau:
1 Dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp
3 Dung dịch thử thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử lượng chính xác chất chuẩn (thêm không quá 40% lượng hoạt chất có sẵn), tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký theo quy trình đã xây dựng Xác định tỷ lệ thu hồi hoạt chất của phương pháp f Độ đặc hiệu
Chuẩn bị các mẫu sau:
2 Mẫu phân tích tanshinon IIA
So sánh các pic trên các sắc ký đồ sau khi tiến hành sắc ký theo chương trình đã khảo sát
2.2.5 Phương pháp phân tích định tính, định lượng mẫu dược liệu đan sâm
Từ đường chuẩn hồi quy tuyến tính và phương pháp nội suy phân tích hàm lượng tanshinon IIA trong cao chiết và dược liệu khô đan sâm Sa Pa
2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu
Dùng toán thống kê để xử lý số liệu các kết quả với phần mềm Microsoft Excel2010 Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả:
- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): 100 xRSD S
