Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học chứa trichobrachin để phòng trừ một số loài nấm bệnh gây hại trên cây trồng giai đoạn 1

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM ƢƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA Trichobrachin ĐỂ PHÕNG TRỪ MỘT SỐ LOÀI NẤM BỆNH GÂY HẠI TRÊN CÂY TRỒNG (GIAI ĐOẠN 1) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2017 BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM ƢƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO TĨM TẮT NHIỆM VỤ KHOA HỌC CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA Trichobrachin ĐỂ PHÕNG TRỪ MỘT SỐ LOÀI NẤM BỆNH GÂY HẠI TRÊN CÂY TRỒNG (GIAI ĐOẠN 1) CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) CHỦ NHIỆM (Ký ghi rõ họ tên) Nguyễn Duy Long THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2017 MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Mục tiêu Giới hạn nghiên cứu CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu nấm Trichoderma 1.2 Giới thiệu Trichobrachin 1.3 Tình hình nghiên cứu nƣớc giới CHƢƠNG II 15 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nội dung nghiên cứu 15 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 15 2.3 Vật liệu nghiên cứu 15 Đối tƣợng nghiên cứu: 15 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Sàng lọc chủng Trichoderma chứa Trichobrachin xác định hoạt tính kháng số loại nấm phịng thí nghiệm (giai đoạn 1) 17 2.4.2 Xác định thành phần, yếu tố tác động đến hoạt tính kháng nấm phƣơng pháp sắc kí 19 2.4.3 Giai đoạn 2: Xác định hoạt tính kháng nấm bệnh Trichobrachin Thanh Long 35 2.5 Phƣơng pháp phân tích số liệu 19 CHƢƠNG III 20 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 Sàng lọc chủng Trichoderma có khả sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm Trichobrachin 20 1.1 Quan sát hình thái chủng Trichoderma môi trƣờng PDA 20 1.2 Tách chiết Trichobrachin khảo sát hoạt tính kháng nấm bệnh gây hại trồng phịng thí nghiệm 22 1.2.1 Quá trình tách chiết Trichobrachin từ chủng Trichoderma 22 1.2.2 Khảo sát hoạt tính kháng nấm bệnh gây hại trồng phịng thí nghiệm 25 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31 4.1 Kết luận 31 4.2 Kiến nghị 31 DANH MỤC HÌNH Hình 1 Hình thái màu sắc chủng Trichoderma Hình Sơ đồ tách chiết Trichobrachin 18 Hình Hình thái chủng nấm Trichodema mọc mơi trƣờng thạch đĩa PDA 20 Hình Các chủng nấm Trichodema ni cấy môi trƣờng lỏng PD máy lắc (250C, 160v/p), sau ngày nuôi cấy 21 Hình 3 dịch canh trƣờng Trichoderma đƣợc lọc qua hệ thống lọc tiếp tuyến 22 Hình Thu nhận hỗn hợp Trichobrachin máy cô quay chân không chiết suất với butanol 23 Hình Nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum mọc mơi trƣờng PDA có chứa dịch chiết Trichoderma từ nồng độ thêm vào theo độ pha loãng (đối chứng, 2X, 4X, 6X, 8X) sau ngày nuôi cấy 26 DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Một số trình tự amino acid peptid TB IIb Bảng Các chủng Trichoderma sp sƣu tập giống đại học HUTECH 16 Bảng Khối lƣợng Trichobrachin thu đƣợc 20 chủng nấm trichoderma khác sau cô quay máy cô quay chân không 24 Bảng Tỉ lệ ức chế sinh trƣởng nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum môi trƣờng PDA có chứa dịch chiết Trichobrachin từ chủng Trichoderma theo độ pha loãng (2X, 4X, 6X, 8X) 25 Bảng 3 Tỉ lệ ức chế sinh trƣởng nấm bệnh Fusarium mơi trƣờng PDA có chứa Trichoderma từ nồng độ thêm vào theo độ pha loãng (2X, 4X, 6X, 8X) 28 TÓM TẮT Nhiệm vụ KHCN cấp sở “ Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học chứa Trichobrachin để phòng trừ số loại nấm bệnh gây hại trồng” gồm giai đoạn Giai đoạn thực sàng lọc chủng Trichoderma chứa Trichobrachin xác định hoạt tính kháng số loại nấm phịng thí nghiệm xác định thành phần, yếu tố tác động đến hoạt tính kháng nấm phƣơng pháp sắc kí (năm 2017) Giai đoạn thực xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm Trichobrachin xác định hoạt tính kháng nấm bệnh Trichobrachin Thanh Long (năm 2018) Giai đoạn đƣợc thực từ tháng 1/2017 đến tháng 12/2017 Trung tâm Ƣơm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao thu đƣợc kết sau: từ 20 chủng Trichoderma sp đƣợc sƣu tầm sƣu tập giống trƣờng Đại học Công nghệ Tp Hồ Chí Minh – HUTECH chúng tơi sàng lọc đƣợc chủng nấm TC8, TC15, TC25 cho hàm lƣợng Trichobrachin sau tách chiết từ 300ml dịch nuôi nấm lần lƣợt là: 0,9 gram, 1,1gram, 1,15 gram Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết Trichobrachin: nhân ni Trichoderma đĩa petri (môi trƣờng PDA, nuôi ngày, 260C), sau cấy chuyển sang 300 ml mơi trƣờng PD lỏng lắc (nuôi ngày, tốc độ lắc:160 vòng/ phút) Tiếp theo loại bỏ tế bào lọc tiếp tuyến thu 250ml dịch lọc, đem kết tủa với 750ml butanol để 48 nhiệt độ phịng Sau phân đoạn 750 ml butanol đƣợc thu ống chiết cô máy cô quay chân không (áp suất chân không 50mbar, tốc độ quay 50 vòng/phút, nhiệt độ 60 0C) để thu đƣợc chiết xuất thô làm bay để thu đƣợc phân đoạn dạng khô dịch chiết Trichobrachin Dịch chiết Trichobrachin đƣợc bổ sung vào tích mơi trƣờng PDA theo tỉ lệ 2X, 4X, 6X, 8X cho kết đối kháng cao với chủng nấm bệnh Thanh long chủng TC25 với tỉ lệ bổ sung vào tích mơi trƣờng PDA tốt 2X với tỉ lệ ức chế nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum 93,7% tỉ lệ ức chế nấm Fusarium đạt 93,1% THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học chứa Trichobrachin để phòng trừ số loại nấm bệnh gây hại trồng Chủ nhiệm Họ tên: Nguy n Duy Long Năm sinh: 1981 Học vị: Thạc sĩ Nam/N : nam Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Năm đạt học vị: 2010 Chức vụ: Phó trƣởng phịng Hỗ trợ cơng nghệ vi sinh Tên quan công tác: Trung tâm Ƣơm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao Địa quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp.HCM Điện thoại quan: 08 62646103 Fax: 08 62646104 Địa nhà riêng: 201, Nguy n Văn Khạ, ấp Cây Trắc, xã Phú Hịa Đơng, huyện Củ Chi, TP.HCM Điện thoại: 0909.909.776 Email: duylong@abi.com.vn Cơ quan chủ trì Trung tâm Ƣơm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao Điện thoại: 08.62646103 Fax: 08.62646104 E-mail: info@abi.com.vn Website: www.abi.com.vn Địa chỉ: ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp HCM Văn phòng giao dịch: 499, Cách mạng Tháng 8, phƣờng 13, quận 10, Tp HCM Thời gian thực hiện: từ tháng 1/2017 đến tháng 12/2018 Kinh phí đƣợc duyệt: 141.345.900 đồng Nội dung Giai đoạn - Sàng lọc chủng Trichoderma chứa Trichobrachin xác định hoạt tính kháng số loại nấm phịng thí nghiệm (năm 2017) - Xác định thành phần, yếu tố tác động đến hoạt tính kháng nấm phƣơng pháp sắc kí (năm 2017) Giai đoạn - Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm Trichobrachin - Xác định hoạt tính kháng nấm bệnh Trichobrachin Thanh Long Kết Tuyển chọn đƣợc chủng Trichoderma chứa Trichobrachin Xác định đƣợc hoạt tính kháng nấm bệnh Thanh Long: Neoscytalidium dimidiatum Fusarium Chạy dịch Trichobrachin máy sắc ký lỏng cao áp, xác định thành phần hợp chất có dịch thu đƣợc Phụ lục xử lý số liệu thống kê Kết xử lý thống kê thí nghiệm nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum nồng độ khác 2X 14:38 Thursday, December 21, 2017 16 The ANOVA Procedure Class Level Information Class 2X Levels Values K 123 T TC15 TC25 TC8 Number of Observations Read Number of Observations Used 14:38 Thursday, December 21, 2017 17 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Model Error Corrected Total Squares Mean Square 53.38644444 0.56484444 F Value 13.34661111 94.52 0.14121111 53.95128889 R-Square Coeff Var Root MSE 0.989530 0.411549 0.375781 Y Mean 91.30889 Pr > F 0.0003 Source Alpha DF Anova SS Mean Square F Value K 1.32495556 0.66247778 4.69 T 52.06148889 26.03074444 184.34 0.0893 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.141211 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 0.8519 Means with the same letter are not significantly different t Grouping 4X Mean N T A 93.8633 TC25 B 91.9767 TC15 C 88.0867 TC8 14:38 Thursday, December 21, 2017 22 The ANOVA Procedure Class Level Information Class 4X Levels Values K 123 T TC15 TC25 TC8 Number of Observations Read Number of Observations Used 14:38 Thursday, December 21, 2017 23 Pr > F 0.0001 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Model Error Mean Square 2793.490333 1964.11 F 0.8108 0.05 t Grouping Pr > F 0.355567 R-Square Source F Value 698.372583 1.422267 Corrected Total Alpha Squares F 0.0029 0.72174444 92.46515556 R-Square Coeff Var Root MSE 0.968778 2.719641 0.849555 DF F Value Anova SS Y Mean 31.23778 Mean Square F Value Pr > F K 0.06642222 0.03321111 0.05 T 89.51175556 44.75587778 62.01 Alpha 0.9555 0.0010 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.721744 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 1.9259 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A Mean N T 33.8133 TC25 A 33.1033 TC15 B 26.7967 TC8 A 8X 14:38 Thursday, December 21, 2017 28 The ANOVA Procedure Class Level Information Class 4X Levels Values K 123 T TC15 TC25 TC8 Number of Observations Read Number of Observations Used 14:38 Thursday, December 21, 2017 29 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Model Error Mean Square 182.8433333 152.82 Root MSE 0.993499 3.244506 0.546916 Anova SS K 0.1712667 T 182.6720667 Y Mean 16.85667 Mean Square F Value 0.0856333 0.29 91.3360333 305.35 Error Degrees of Freedom Error Mean Square F 0.7652 0.05 t Grouping 0.0001 184.0398000 Coeff Var DF Pr > F 0.2991167 R-Square Source F Value 45.7108333 1.1964667 Corrected Total Alpha Squares Kết xử lý thống kê thí nghiệm nấm bệnh Fusarium nồng độ khác 4X 14:38 Thursday, December 21, 2017 34 The ANOVA Procedure Class Level Information Class 4X Levels Values K 123 T TC15 TC25 TC8 Number of Observations Read Number of Observations Used 14:38 Thursday, December 21, 2017 35 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Model Error Squares 2678.313444 Corrected Total Mean Square 2.153244 669.578361 F Value 1243.85 F Y Mean 78.94111 Source Alpha DF Anova SS K 5.492022 T 2672.821422 Mean Square 2.746011 1336.410711 F Value 5.10 0.0793 2482.60 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.538311 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 1.6633 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A Mean N T 91.2100 TC25 A 91.0433 TC15 B 54.5700 TC8 A 4X 14:38 Thursday, December 21, 2017 37 The ANOVA Procedure Class Level Information Class K 4X Levels Values 123 14:38 Thursday, December 21, 2017 31 The ANOVA Procedure Class Level Information Class K Levels Values 123 Pr > F F 0.29266667 R-Square Source F Value 16.53508333 1.17066667 Corrected Total Alpha Squares Anova SS Y Mean 91.38333 Mean Square F Value K 0.57526667 0.28763333 0.98 T 65.56506667 32.78253333 112.01 0.4496 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Pr > F 0.292667 2.77645 Least Significant Difference 1.2264 Means with the same letter are not significantly different 0.0003 t Grouping Mean A 94.0833 B 92.3700 TC15 C 87.6967 TC8 T 4X N T TC25 TC15 TC25 TC8 Number of Observations Read Number of Observations Used 14:38 Thursday, December 21, 2017 31 The ANOVA Procedure Class Level Information Class 4X Levels Values K 123 T TC15 TC25 TC8 Number of Observations Read Number of Observations Used 14:38 Thursday, December 21, 2017 32 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model Error 66.14033333 1.17066667 Corrected Total Root MSE 0.982608 0.591997 0.540987 Anova SS Y Mean 91.38333 Mean Square F Value K 0.57526667 0.28763333 0.98 T 65.56506667 32.78253333 112.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.292667 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 1.2264 Means with the same letter are not significantly different 4X Mean N T A 94.0833 TC25 B 92.3700 TC15 C 87.6967 TC8 14:38 Thursday, December 21, 2017 37 The ANOVA Procedure Pr > F 0.4496 0.05 t Grouping 0.0009 67.31100000 Coeff Var DF 56.50 0.29266667 R-Square Source Alpha 16.53508333 0.0003 Class Level Information Class 4X Levels Values K 123 T TC15 TC25 TC8 Number of Observations Read Number of Observations Used 14:38 Thursday, December 21, 2017 38 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Model Error Mean Square 94.85164444 40.19 0.0017 97.21182222 Coeff Var Root MSE 0.975721 2.485454 0.768144 DF Pr > F 0.59004444 R-Square Source F Value 23.71291111 2.36017778 Corrected Total Alpha Squares Anova SS Y Mean 30.90556 Mean Square F Value K 2.65775556 1.32887778 2.25 T 92.19388889 46.09694444 78.12 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.590044 Pr > F 0.2212 0.0006 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 1.7413 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A Mean N T 33.5333 TC25 A 32.7833 TC15 B 26.4000 TC8 A 4X 14:38 Thursday, December 21, 2017 40 The ANOVA Procedure Class Level Information Class 4X Levels Values K 123 T TC15 TC25 TC8 Number of Observations Read Number of Observations Used 14:38 Thursday, December 21, 2017 41 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model Error 186.5635111 0.5795778 Corrected Total 187.1430889 Coeff Var Root MSE 0.996903 2.284662 0.380650 DF 321.90