PHÂN lập, KHẢO sát đặc điểm SINH học và tìm HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME của VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS để sản XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khố: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: BÙI THỊ PHI Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 - iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn TS NGUYỄN NGỌC HẢI Sinh viên thực BÙI THỊ PHI Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Tơi xin gửi lịng biết ơn sâu sắc đến: Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, tất Qúy thầy cô truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học trường TS Nguyễn Ngọc Hải, người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên suốt thời gian thực tập hồn thành khố luận tốt nghiệp TS Lê Anh Phụng, BSTY Nguyễn Thị Kim Loan giúp đỡ tạo điều kiện để hồn thành q trình thực tập thời gian vừa qua Phịng Vi sinh truyền nhiễm khoa Chăn ni thú y cho phép tạo điều kiện thuận lợi cho tơi học tập nghiên cứu phịng Các bạn lớp CNSH 29 bên tôi, giúp đỡ, động viên, chia sẻ thời gian thực tập suốt năm học vừa qua Cha mẹ, bậc sinh thành sinh nuôi dưỡng tơi, anh chị em gia đình ln quan tâm, ủng hộ tơi học tập hồn thành khoá luận tốt nghiệp Sinh viên thực Bùi Thị Phi iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TĨM TẮT BÙI THỊ PHI, Đại học Nơng Lâm TP.HCM Tháng 9/2007 "PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME (AMYLASE, PROTEASE) CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC" Giáo viên hƣớng dẫn: TS NGUYỄN NGỌC HẢI Nhằm nâng cao suất chất lượng sản phẩm chăn nuôi để chế phẩm sinh học ứng dụng rộng rãi có tác dụng tốt chăn nuôi, tiến hành thí nghiệm điều kiện ni cấy (sục khí liên tục khơng sục khí), thời gian ni cấy (24 giờ, 48 giờ), ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy, ảnh hưởng pH thời gian nuôi cấy vi khuẩn, nhiệt độ thời gian bảo quản chế phẩm để khảo sát khả sinh enzyme vi khuẩn Bacillus subtilis Kết chúng tơi có được: Phân lập, xác định 10 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục khơng sục khí), thời gian nuôi cấy (nuôi 24 48 giờ) đến khả sinh enzyme (amylase, protease) vi khuẩn Bacillus subtilis chế độ sục khí liên tục ni 48 vi khuẩn phát triển sản sinh enzyme tốt Khảo sát ảnh hưởng môi trường (rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đuờng + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton, TSB + 1% tinh bột) đến hoạt độ enzyme vi khuẩn mơi trường rỉ đường + 2% tinh bột cho hoạt độ enzyme tốt so với loại mơi trường cịn lại Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme chủng Bacillus subtilis pH = thời gian nuôi cấy 48 giờ, hoạt độ enzyme vi khuẩn tốt Nhiệt độ - 100C giữ hoạt độ enzyme tốt nhiệt độ 30 - 370C khảo sát nhiệt độ thời gian bảo quản chế phẩm iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ABSTRACT A survey to define some culture conditions that affect on enzyme (amylase, protease) productivity of Bacillus subtilis isolated strains was carried out and the results had showed: We subdivided and definned 10 strains Bacillus subtilis Bacillus subtilis isolated strains could produce more enzyme (amylase, protease) in oxygen continuous supply conditions at 48 hours incubation The best result obtained for enzyme (amylase, protease) production with sugar rust + 2% starch culture medium in comparing with the others (sugar rust + 1% starch, sugar rust + 1% starch + 0,5% peptone, TSB + 1% starch) and at pH = for 48 hours culture Enzyme activity conserved better in – 100C than in 30 – 370C v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv ABSTRACT .v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC BẢNG ix DANH SÁCH HÌNH x DANH SÁCH SƠ ĐỒ xi Chƣơng 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích đề tài .2 1.3 Yêu cầu đề tài .2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN 2.1 Sơ lược vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1 Lịch sử phát 2.1.2 Đặc điểm phân loại phân bố vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.3 Đặc điểm hình thái 2.1.4 Đặc điểm nuôi cấy 2.1.5 Đặc điểm sinh hoá 2.1.6 Bào tử khả tạo bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.6.1 Cấu tạo bào tử 2.1.6.2 Khả tạo bào tử .6 2.1.7 2.2 Tính chất đối kháng Giới thiệu enzyme amylase enzyme protease .7 2.3.1 Enzyme amylase 2.3.1.1 Lịch sử nghiên cứu 2.3.1.2 Vi sinh vật tạo amylase 2.3.1.3 Đặc tính amylase .8 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.3.1.4 Sinh tổng hợp amylase vi sinh vật 10 2.3.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp amylase .10 2.3.1.6 Ứng dụng amylase vi sinh vật .11 2.3.2 Enzyme protease 11 2.3.2.1 Nguồn thu nhận enzyme protease 11 2.3.2.2 Đặc điểm tính chất protease vi sinh vật 12 2.3.2.3 Chức sinh học protease vi sinh vật .13 2.3.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp protease vi sinh vật .14 2.3.2.5 2.3 Ứng dụng protease vi sinh vật 14 Giới thiệu probiotic 15 2.4.1 Định nghĩa 15 2.4.2 Chức sinh học .15 2.4.3 Một số chế phẩm probiotic thông dụng 15 2.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus subtilis .16 Chƣơng 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài .18 3.1.1 Thời gian .18 3.1.2 Địa điểm 18 3.2 Vật liệu thí nghiệm .18 3.2.1 Đối tượng khảo sát 18 3.2.2 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 18 3.2.2.1 Thiết bị 18 3.2.2.2 Dụng cụ: 18 3.3 Nội dung nghiên cứu 19 3.4 Phương pháp thực đề tài .19 3.4.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 19 3.4.1.1 Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn .19 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.4.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis 19 3.4.1.3 Khảo sát đặc điểm sinh học vi khuẩn phân lập 20 3.4.2 Các thí nghiệm vi khuẩn Bacillus subtilis 21 3.4.2.1 Ảnh hưởng chế độ sục khí thời gian nuôi cấy đến khả sinh enzyme vi khuẩn Bacillus subtilis 21 3.4.2.2 Ảnh hưởng môi trường đến hoạt độ enzyme vi khuẩn Bacillus subtilis .22 3.4.2.3 Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme chủng Bacillus subtilis 23 3.4.3 Thử nghiệm thời gian nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ Bacillus subtilis .25 3.4.3.1 Quy trình thực 25 3.4.3.2 Kiểm tra chế phẩm thời gian bảo quản 25 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .26 4.1 Khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis 26 4.1.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ Bacillus subtilis 26 4.1.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn nghi ngờ Bacillus subtilis 26 4.1.3 Khảo sát đặc điểm sinh hóa 27 4.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng chế độ sục khí thời gian nuôi cấy đến khả sinh enzyme amylase protease chủng vi khuẩn 29 4.3 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng mơi trường đến hoạt độ enzyme vi khuẩn Bacillus subtilis 31 4.4 Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme chủng Bacillus subtilis 33 4.5 Khảo sát thời gian nhiệt độ bảo quản chế phẩm sau sản xuất 34 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Đề nghị .36 PHỤ LỤC 40 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 1: Bố trí thí nghiệm 21 Bảng 2: Bố trí thí nghiệm 23 Bảng 3: Bố trí thí nghiệm 24 Bảng 4.1: Kết thử phản ứng sinh hoá 29 Bảng 4.2: Kết thí nghiệm (Bảng phụ lục 2) 29 Bảng 3: Kết hoạt độ enzyme trung bình chủng vi khuẩn thí nghiệm 31 Bảng 4 Ảnh hưởng môi trường đến hoạt độ enzyme vi khuẩn 32 Bảng Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất 33 Bảng 4.6 Khảo sát thời gian nhiệt độ bảo quản chế phẩm 34 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH HÌNH Hình Vi khuẩn Bacillus subtilis Hình Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis .26 Hình 2: Đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis 27 x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com  B Loại môi trƣờng nuôi cấy Analysis of Variance for PHI2.kqa - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -MAIN EFFECTS A:PHI2.con 2.00000 66667 023 9951 B:PHI2.moitruong 546.00000 182.00000 6.276 0051 INTERACTIONS AB 42.000000 4.6666667 161 9956 RESIDUAL 464.00000 16 29.000000 -TOTAL (CORRECTED) 1054.0000 31 -0 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error Analysis of Variance for PHI2.kqp - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -MAIN EFFECTS A:PHI2.con 32.00000 10.66667 267 8484 B:PHI2.moitruong 832.00000 277.33333 6.933 0033 INTERACTIONS AB 160.00000 17.777778 444 8906 RESIDUAL 640.00000 16 40.000000 -TOTAL (CORRECTED) 1664.0000 31 -0 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple range analysis for PHI2.kqa by PHI2.moitruong Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 14.500000 X 18.500000 X 20.000000 X 26.000000 X contrast difference limits - 7.50000 5.70944 * - 6.00000 5.70944 * - 11.5000 5.70944 * - -1.50000 5.70944 - 4.00000 5.70944 - 5.50000 5.70944 * denotes a statistically significant difference LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Multiple range analysis for PHI2.kqp by PHI2.moitruong -Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -4 20.000000 X 22.000000 X 30.000000 X 32.000000 X -contrast difference limits - 8.00000 6.70539 * - -2.00000 6.70539 - 10.0000 6.70539 * - -10.0000 6.70539 * - 2.00000 6.70539 - 12.0000 6.70539 * -* denotes a statistically significant difference  C Điều kiện pH thời gian nuôi cấy Analysis of Variance for PHI3.kqa - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -MAIN EFFECTS A:PHI3.con 54.00000 18.00000 474 7049 B:PHI3.ph 162.00000 162.00000 4.263 0555 C:PHI3.thigian 162.00000 162.00000 4.263 0555 INTERACTIONS AB 150.00000 50.000000 1.316 3038 AC 150.00000 50.000000 1.316 3038 BC 2.00000 2.000000 053 8239 ABC 54.00000 18.000000 474 7049 RESIDUAL 608.00000 16 38.000000 -TOTAL (CORRECTED) 1342.0000 31 -0 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error Analysis of Variance for PHI3.kqp - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -MAIN EFFECTS A:PHI3.con 198.00000 66.000000 2.200 1278 B:PHI3.ph 50.00000 50.000000 1.667 2150 C:PHI3.thigian 50.00000 50.000000 1.667 2150 INTERACTIONS AB 38.000000 12.666667 422 7396 AC 38.000000 12.666667 422 7396 BC 50.000000 50.000000 1.667 2150 ABC 38.000000 12.666667 422 7396 RESIDUAL 480.00000 16 30.000000 -TOTAL (CORRECTED) 942.00000 31 -0 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Multiple range analysis for PHI3.kqa by PHI3.ph Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 16 29.500000 X 16 34.000000 X contrast difference limits - -4.50000 4.62137 * denotes a statistically significant difference Multiple range analysis for PHI3.kqa by PHI3.thigian Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 24 16 29.500000 X 48 16 34.000000 X contrast difference limits 24 - 48 -4.50000 4.62137 * denotes a statistically significant difference  D Thời gian nhiệt độ bảo quản chế phẩm Analysis of Variance for PHI5.kqa - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -MAIN EFFECTS A:PHI5.con 279.500 93.167 248.444 0000 B:PHI5.nhietdobq 4.000 4.000 10.667 0026 C:PHI5.thoigianbq 31417.000 10472.333 27926.222 0000 INTERACTIONS AB 3.50000 1.166667 3.111 0400 AC 772.50000 85.833333 228.889 0000 BC 2.00000 666667 1.778 1712 ABC 4.50000 500000 1.333 2592 RESIDUAL 12.000000 32 3750000 -TOTAL (CORRECTED) 32495.000 63 -1 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Analysis of Variance for PHI5.kqp - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -MAIN EFFECTS A:PHI5.con 432.000 144.0000 2.250 1015 B:PHI5.nhietdobq 000 0000 000 1.0000 C:PHI5.thoigianbq 17328.000 5776.0000 90.250 0000 INTERACTIONS AB 0000 00000 000 1.0000 AC 1296.0000 144.00000 2.250 0443 BC 0000 00000 000 1.0000 ABC 0000 00000 000 1.0000 RESIDUAL 2048.0000 32 64.000000 -TOTAL (CORRECTED) 21104.000 63 -1 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple range analysis for PHI5.kqa by PHI5.thoigianbq Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 20 16 4.750000 X 30 16 4.750000 X 10 16 5.000000 X 16 56.000000 X contrast difference limits - 10 51.0000 0.44111 * - 20 51.2500 0.44111 * - 30 51.2500 0.44111 * 10 - 20 0.25000 0.44111 10 - 30 0.25000 0.44111 20 - 30 0.00000 0.44111 * denotes a statistically significant difference Multiple range analysis for PHI5.kqa by PHI5.nhietdobq Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 30 32 17.375000 X 32 17.875000 X contrast difference limits - 30 0.50000 0.31191 * * denotes a statistically significant difference LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 2:  Môi trƣờng Trypticase Soya Agar (TSA) Thành phần g/l Soy pepton 15 g Tryptone peptone 5g NaCl 5g Agar 18 g Nước cất 1000 ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30 g bột môi trường TSB + 18 g agar cho vào 1000 ml nước cất, đun sơi cho hịa tan Đem hấp khử trùng nhiệt độ 1210C/ 15 phút  Môi trƣờng Tryticase Soya Broth (TSB) Thành phần g/l Soy pepton 15 g Tryptone peptone 5g NaCl 5g Nước cất 1000 ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30 g bột môi trường TSB cho vào 1000 ml nước cất, đun sơi cho hịa tan Đem hấp khử trùng 1210C/15 phút LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com  Môi trƣờng Clark lubs Thành phần g/l Pepton bột 7g Glucose 5g KH2PO4 5g Nước cất 1000 ml pH 6,7 – 7,1  Môi trƣờng lên men loại đƣờng Thành phần g/l Cao thịt 5g Pepton bột 10 g Đường 10 g Phenol red 0,01 g Nước cất 1000 ml pH 7,4 Hấp khử trùng 1210C/15 phút  Môi trƣờng Simons Citrate Agar Thành phần g/l Sodium citrate 2g K2HPO4 1g MgSO4 0,2 g Brothymol blue 0,08 g NaCl 5g NH4H2PO4 1g Agar 18 g pH 6,9 ± 0,2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com  Môi trƣờng khử Nitrate Thành phần g/l Cao thịt 3g Pepton bột 5g NaNO3 1g Agar 7g Nước cất 1000 ml pH 7,0 ± 0,2  Mơi trƣờng Lịng đỏ trứng Thành phần g/l Cao thịt 1g Pepton bột 10 g Mannitol 10 g NaCl 10 g Phenol red 0,0025 g Agar 15 g Nước cất 1000 ml pH 7,2 ± 0,2 Chia 225 ml mơi trường vào bình tam giác Khử trùng 1210C/15 phút Khi môi trường nguội đến 500C thêm 12,5 ml dung dịch lòng đỏ trứng gà Trộn đổ vào đĩa petri vô trùng Cách pha dung dịch lòng đỏ trứng: rửa trứng, sát trùng trứng bên cồn Dùng kẹp đập trứng, bỏ phần lịng trắng, chuyển phần lịng đỏ vào bucher có chứa 25 - 30 ml nước muối sinh lí vơ trùng Bảo quản dung dịch 40C để dùng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com  Môi trƣờng Rỉ đƣờng + 2% Tinh bột Thành phần g/l KH2PO4 20 g K2HPO4 20 g MgSO4 0,5 g (NH)4SO4 40 g Nước cất 1000 ml Tinh bột 20 g pH 5–6  Môi trường rỉ đường + 1% Tinh bột, môi trường rỉ đường 1% tinh bột + 0,5% peptone tương tự môi trường rỉ đường + 2% tinh bột, thay đổi tỉ lệ tinh bột cho vào  Môi trƣờng TSB + 1% Tinh bột Thành phần g/l Soy pepton 15 g Tryptone peptone 5g NaCl 5g Nước cất 1000 ml Tinh bột 10 g pH 7,3 ± 0,2  Hóa chất Nước muối sinh lí 9%o NaCl 9g Nước cất 1000 ml Dung dịch Iod 0,02N LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Cân g KI hòa tan ml nước cất, lắc cho tan, them nước cất vào 100 ml Dung dịch tinh bột 0,1% Tinh bột 0,1 g Nước cất thêm đến 100 ml Trộn tinh bột với khoảng 10 ml nước cất, thêm tiếp 80 ml nước cất sôi, khuấy đều, để nguội, thêm nước cất đến 100 ml Dung dịch casein 0,1% Casein 0,1 g NaOH 0,1N ml Nước cất 25 ml Đun cách thủy tan hoàn toàn Làm lạnh dùng HCl 0,1N chỉnh pH = Thêm nước cất để đủ 100 ml Nước muối 0,1% Cân 0,1 g muối NaCl hòa tan 100 ml nước cất Dung dịch acid acetic 1% ethanol Acid acetic đặc ml Nước cất 49 ml Ethanol 96% 50 ml Hòa tan acid acetic đặc nước cất ethanol  Phƣơng pháp nhuộm Gram Các bước tiến hành : Phết canh khuẩn lên miếng lam Cố định mẫu cách hơ qua đèn cồn Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn Nhuộm crystal violet phút Rửa nước, thấm khô Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn Cố định màu lugol phút LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Rửa nước, thấm khô Tẩy cồn 960 khoảng 15 giây Rửa nước, thấm khô Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn Nhuộm màu dung dịch Fuchsine kiềm loãng Rửa nước, thấm khơ Xem kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần (vật kính dầu)  Thử phản ứng sinh hóa  Khả lên men đường Chuẩn bị: Môi trường đường: maltose, glucose, saccharose Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Ống nghiệm, ống Durham Cách làm: cho vào ống nghiệm có sẵn mơi trường đường ống Durham hấp khử trùng 1210C/15 phút Sau cấy vi khuẩn vào môi trường ủ 370C/24 Quan sát đổi màu sinh Nếu vi khuẩn có khả lên men đường, chuyển đường thành rượu, rượu lên men thành acid làm pH môi trường giảm, chuyển màu môi trường Kết quả: Phản ứng (-): môi trường có màu hồng đỏ Phản ứng (+): mơi trường có màu vàng  Thử phản ứng Catalase Chuẩn bị: Dung dịch H2O2 30% Lame Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: dung piptte lấy vi khuẩn, phết lên lame kính khơ Sau nhỏ giọt H2O2 30% lên vết vi khuẩn Đọc kết su khoảng 15 giây LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết quả: Phản ứng (-): khơng có hiệ tượng sủi bọt Phản ứng (+): có tượng sủi bọt  Thử phản ứng VP (Voges Proskauer) Chuẩn bị: Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Môi trường Clark lubs α – naphtol 10%, NaOH 40% Cách làm: cấy vi khuẩn vào môi trường Clark lubs, nuôi nhiệt độ 370C/24 Sau nhỏ – giọt NaOH 40% – giọt α – naphtol 10% Sau 15 phút đọc kết Kết quả: Phản ứng VP (-): mơi trường có màu vàng Phản ứng VP (+): mơi trường có màu đỏ  Thử phản ứng MR (Methyl – Red) Chuẩn bị: Môi trường Clark lubs Thuốc thử Methyl Red Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: Dùng que cấy vịng lấy vi khuẩn cấy vào mơi trường Clark lubs, ni nhiệt độ 370C/24 Sau nhỏ – giọt thuốc thử Methyl Red vào canh khuẩn đọc kết Kết quả: Phản ứng MR (-): mơi trường có màu vàng Phản ứng MR (+): mơi trường có màu đỏ  Thử phản ứng khử Nitrate (NO3) Chuẩn bị: Môi trường Nitrate Dung dịch thuốc thử Giess A, Giess B LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn cấy sâu vào môi trường thạch nitrate, nuôi nhiệt độ 370C/24 Sau 24 nhỏ vào môi trường – giọt Giess A, sau nhỏ tiếp – giọt Giess B Kết quả: Phản ứng (-): môi trường có màu vàng Phản ứng (+): mơi trường có màu đỏ  Thử khả sử dụng Citrate Chuẩn bị: Môi trường Citrate Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: cấy vi khuẩn vào môi trường Citrate Nuôi nhiệt độ 370C/24 Kết quả: Phản ứng (-): môi trường có màu xanh mạ non Phản ứng (+): mơi trường có màu xanh dương  Các phƣơng pháp thực  Phương pháp kiểm tra hoạt tính amylase (Phương pháp Wolhgemuth) Phương pháp xác định lượng enzyme phân giải hồn tồn lượng tinh bột với chất thị màu Iodine Một đơn vị Wolhgemuth lượng enzyme mà sau 30 phút 300C, có ion clorine phân giải mg tinh bột đến sản phẩm không tạo màu với Iodine Hoạt tính enzyme biểu diễn số đơn vị Wolhgemuth ml dịch môi trường ml dung dịch chiết enzyme Thiết bị, vất liệu hóa chất: Bình tam giác hay bình cầu Ống nghiệm Máy ly tâm hay máy lọc Pipette LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Dung dịch enzyme: Nghiền cẩn thận mơi trường thạch có chưa vi sinh vật, cân 20 – 100 g cho vào bình tam giác hay bình cầu, thêm 500 – 1000 ml dung dịch NaCl 1%, lắc liên tục từ – lắc nhiệt độ phòng Lọc ly tâm để thu dịch chiết suốt Nếu môi trường nuôi cấy dịch thể cần ly tâm tách sinh khối sử dụng phần chất lỏng suốt thu để phân tích Dung dịch tinh bột 0,1% Dung dịch NaCl 0,1% Dung dịch iod 0,02%  Cách tiến hành: Chuẩn bị 10 ống nghiệm, cho vào óng ml dung dịch NaCl 0,1% Thêm vòa ống thứ ml enzyme ròi lắc đều, lấy ml chuyển sang ống thứ hai lại lắc lấy ml chuyển sang ống thứ ba… Cứ ống thứ 10, sau lấy ml ống thứ 10 bỏ Cho vào ống ml dung dịch tinh bột 0,1%, lắc đều, giữ 300C 30 phút Làm lạnh, cho vào mooyj giọt dung dịch Iodine 0,02 N Ghi nhận ống có độ pha lỗng lớn mà khơng cho tạo màu với Iodine Ví dụ: Các ống từ đến không tạo màu, ống thứ trở có màu hoạt tính enzyme ml dung dịch enzyme 16 x = 32 đơn vị Trong 16 độ pha lỗng dung dịch enzyme ống thứ tư, số mg tinh bột ống nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com  Phương pháp kiểm tra hoạt tính protease (Phương pháp Gross Fluld) Trong mơi trường kiềm yếu, casein bị hịa tan thêm acid acetic ethanol, casein bị kết tủa Trái lại, sản phẩm thủy phân casein lại không bị kết tủa điều kiện Phương pháp Gross Fluld dựa sở xác định lượng enzyme cần thiết để phân giải mg casein đến mức không bị kết tủa acid acetic ethanol Một đơn vị hoạt động lượng enzyme 1ml dung dịch nghiên cứu có khả phân giải mg casein 380C thời gian 30 phút  Thiết bị, vật liệu hóa chất Bể điều nhiệt hay tủ ấm (380C) Máy lắc ống nghiệm (vortex mixer) Ống nghiệm Dung dịch casein 0,1% Dung dịch acid acetic 1% ethanol  Cách tiến hành: Chuẩn bị 12 ống nghiệm sạch, khô Cho vào ống 1ml nước cất, trừ ống thứ Cho vào ống thứ ống thứ hai ống ml dịch chứa enzyme, lắc Chuyển ml dung dịch ống thứ hai vào ống thứ ba, lắc Chuyển ml dung dịch ống thứ ba vào ống thứ tư, lắc Cứ ống thứ 12 Kaays ml từ ống thứ 12 bỏ Như thể tích chất lỏng tất ống ml Tăng nhiệt độ ống đến nhiệt độ 380C cách đặt chúng vào bể điều nhiệt cài 380C từ 10 – 15 phút Thêm vào ống ml dung dịch casein 0,1% có nhiệt độ 380C, lắc Giữ 380C 30 phút Đúng 30 phút làm lạnh nước đá để ngừng phản ứng Nhỏ theo vách ống vài giọt dung dịch acid acetic dung dịch ethanol LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nếu thấy tất ống có kết tủa trắng, chứng tỏ lượng enzyme không đủ để phân giải hết casein Cần phải chuẩn bị lại dụng dịch enzyme có nồng độ cao Còn tất ống không xuất kết tủa cần phải pha lỗng dung dịch enzyme đem phân tích Trong trường hợp có số ống xuất kết tủa, số cịn lại khơng kết tủa chọn lấy ống khơng kết tủa cuối (đứng trước ống bắt đầu cho kết tủa) ống có lượng enzyme bé có khả phân giải hồn tồn mg casein Ví dụ: ống thứ ống cuối không cho kết tủa, lượng enzyme ban đầu pha loãng 64 lần ống này, tương đương với 0,0156 ml dung dịch enzyme ban đầu, ml dung dịch enzyme ban đầu có hoạt độ 2/0,0156 = 128 đơn vị Từ tính hoạt độ enzyme g chế phẩm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... Đại học Nông Lâm TP.HCM Tháng 9/2007 "PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME (AMYLASE, PROTEASE) CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH. .. tiến hành thực đề tài: ? ?Phân lập, khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis tìm hiểu khả sinh enzyme (protease, amylase) vi khuẩn để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học? ?? LUAN VAN CHAT LUONG... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS