Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn bacillus subtilis natto​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis Natto Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS NGUYỄN NHƯ NHỨT ThS PHAN TRUNG HẢI Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ MINH TRANG MSSV: 1211100022 TP Hồ Chí Minh, 2016 Lớp: 12DSH01 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học ThS Nguyễn Như Nhứt ThS Phan Trung Hải Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa cơng bố hình thức trước Những số liệu bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá tác giả thu thập từ nguồn khác có ghi rõ phần tài liệu tham khảo Ngoài ra, đồ án sử dụng số nhận xét, đánh số liệu tác giả khác, quan tổ chức khác có trích dẫn thích nguồn gốc Nếu phát có gian lận Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung đồ án TP Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực tập NGUYỄN THỊ MINH TRANG LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình học tập trường Đại học Cơng Nghệ TP.HCM, quan tâm giúp đỡ tận tình q thầy khơng quản cơng lao khó nhọc trang bị kiến thức cần thiết cho chúng em, tạo điều kiện cho chúng em có hội áp dụng kiến thức vào thực tiễn thơng qua đợt thực tập Tuy thời gian thực tập ngắn ngủi trang bị cho em nhiều kiến thức thực tiễn bổ ích cho cơng việc sau Em xin chân thành biết ơn: - Ban giám hiệu toàn thể giáo viên giảng dạy trường Đại học Cơng Nghệ TP.HCM nói chung thầy khoa Cơng nghệ sinh học nói riêng cho em có hội thực tập Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Nguyễn Như Nhứt, người tạo điều kiện, hướng dẫn giúp em hoàn thành tốt đồ án - Em xin cảm ơn ThS Phan Trung Hải hướng dẫn hỗ trợ em hoàn thành đồ án Em xin tri ân giúp đỡ tận tình của: Các anh, chị phịng thí nghiệm Chi nhánh Cơng ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương tồn thể anh, chị phịng ban Cơng ty tạo điều kiện hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian thực tập để hoàn thành luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn đến người bạn tôi, chia sẻ, giúp đỡ động viên tơi học tập ngồi sống Sinh viên thực tập NGUYỄN THỊ MINH TRANG Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH vi MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết .1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước Mục tiêu nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu .3 Kết đạt Kết cấu đề tài nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược Bacillus subtilis Natto .5 1.1.1 Hệ thống phân loại Bacillus subtilis Natto 1.1.2 Lịch sử phát 1.1.3 Phân bố 1.1.4 Đặc điểm Bacillus subtilis Natto 1.2 Enzyme protease 10 1.2.1 Khái niệm protease 10 1.2.2 Phân loại 11 1.2.3 Nguồn thu nhận 12 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp protease Bacillus subtilis .14 1.4 Ứng dụng protease 18 1.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất protease 19 i Đồ án tốt nghiệp 1.5.1.Trên giới 19 1.5.2 Tại Việt Nam 20 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Địa điểm thời gian thực thí nghiệm 22 2.1.1 Địa điểm 22 2.1.2 Thời gian nghiên cứu 22 2.2 Vật liệu thí nghiệm 22 2.2.1 Nguồn vi sinh vật 22 2.2.2 Cơ chất dùng thí nghiệm 22 2.2.3 Hóa chất thiết bị sử dụng 23 2.3 Môi trường nuôi cấy 23 2.3.1 Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton agar (MT1) 23 2.3.2 Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton (MT2) 23 2.3.3 Mơi trường định tính khả sinh tổng hợp protease (MT3) 24 2.3.4 Môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease (MT4) .24 2.4 Phương pháp tiến hành 25 2.4.1 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 25 2.4.2 Phương pháp tăng sinh 25 2.4.3 Phương pháp xác định mật độ tế bào 25 2.4.4 Phương pháp định tính khả tổng hợp protease 26 2.4.5 Phương pháp nuôi cấy bán rắn 27 2.4.6 Phương pháp thu nhận dịch chiết từ nuôi cấy bán rắn 27 2.4.7 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease 27 2.4.8 Phương pháp tủa enzyme protease 30 2.4.9 Phương pháp xử lý thống kê 30 2.5 Phương pháp nghiên cứu 30 2.5.1 Sàng lọc chủng Bacillus subtilis Natto có khả tổng hợp enzyme protease cao 30 ii Đồ án tốt nghiệp 2.5.2 Khảo sát khả tổng hợp enzyme protease chủng Bacillus subtilis Natto môi trường bán rắn có thành phần chất khác .30 2.5.3 Khảo sát số điều kiện ảnh hưởng đến khả tổng hợp enzyme protease chủng Bacillus subtilis Natto 31 2.5.4 Khảo sát ảnh hưởng pH lên khả xúc tác protease chủng Bacillus subtilis Natto 32 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Sàng lọc chủng B subtilis Natto có khả tổng hợp protease cao 33 3.2 Khảo sát hoạt độ protease chủng B subtilis Natto BN2.1 môi trường bán rắn có thành phần chất khác 35 3.3 Khảo sát số điều kiện ảnh hưởng đến khả sinh protease chủng B subtilis Natto BN2.1 37 3.3.1 Ảnh hưởng tỉ lệ chất môi trường bán rắn lên khả tổng hợp protease 37 3.3.2 Ảnh hưởng độ ẩm lên khả tổng hợp protease 39 3.3.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả tổng hợp protease 41 3.4 Khảo sát ảnh hưởng pH lên khả xúc tác protease chủng B.subtilis Natto BN2.1 43 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1 Kết luận 45 4.2 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A candidus Aspergillus candidus A.oryzae Aspergillus oryzae B Bacillus B subtilis Bacillus subtilis BDN Bã đậu nành CB Cám bắp CG Cám gạo CM Cám mì CFU Colony Foming Unit DX Đậu xanh kDa kiloDalton nKat nanoKatal OD Optical Density pI Điểm đẳng điện protein P roquerti Penicillium roqueforti UI Đơn vị hoạt độ SPSS Phần mềm xử lý thống kê (Statistical Package for the Social Science) Trọng lượng phân tử TLPT iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Kết phản ứng sinh hóa chủng B subtilis Bảng 1.2 Ảnh hưởng nguồn carbon lên hoạt độ protease chủng Bacillus licheniformis N-2 15 Bảng 1.3 Ảnh hưởng nguồn nitrogen vô lên hoạt độ protease chủng Bacillus licheniformis N-2 16 Bảng 1.3 Ảnh hưởng nguồn nitrogen hữu lên hoạt độ protease chủng Bacillus licheniformis N-2 17 Bảng 2.1 Danh sách chủng nghiên cứu 22 Bảng 2.2 Dựng đường chuẩn Tyrosine 28 Bảng 2.3 Xác định lượng Tyrosine dung dịch nghiên cứu 29 Bảng 2.4 Thành phần khối lượng chất môi trường bán rắn 31 Bảng 3.1 Kích thước đường kính vịng phân giải casein chủng B subtilis Natto 34 Bảng 3.2 Hoạt độ enzyme protease chủng BN2.1 sử dụng thành phần nuôi cấy khác 35 Bảng 3.3 Ảnh hưởng tỉ lệ BDN:CB môi trường bán rắn lên hoạt độ protease 38 Bảng 3.4 Ảnh hưởng độ ẩm lên khả tổng hợp protease 40 Bảng 3.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả tổng hợp protease 41 Bảng 3.6 Ảnh hưởng pH phản ứng lên khả xúc tác protease .43 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1 Sản phẩm Natto Hình 1.2 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis Natto Hình 1.3 Phản ứng thủy phân liên kết peptide 10 Hình 1.4 Cấu trúc khơng gian enzyme protease 11 Hình 3.1 Khả phân giải casein môi trường thạch đĩa chủng Bacillus subtilis Natto 33 Biểu đồ 3.1 Kích thước đường kính vịng phân giải casein chủng B subtilis Natto 34 Biểu đồ 3.2 Hoạt độ enzyme protease chủng B subtilis Natto BN2.1 sử dụng thành phần nuôi cấy khác 36 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng tỉ lệ BDN:CB môi trường bán rắn lên hoạt độ protease 38 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng độ ẩm lên khả tổng hợp protease 40 Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy môi trường bán rắn lên hoạt độ protease 42 Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng pH phản ứng lên khả xúc tác protease .43 vi Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Một số lồi vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzyme protease ứng dụng nhiều vi khuẩn thuộc chi Bacillus [40] Bacillus subtilis Natto chủng vi khuẩn có ích, phổ biến tự nhiên Chúng có khả phát triển nhanh sinh tổng hợp nhiều loại enzyme thủy phân amylase, protease, phytase, hemicellulase, glucannase… Chủng vi khuẩn sử dụng ăn truyền thống Nhật Bản từ lâu Khi ủ ấm với hạt đậu nành, chúng sản sinh enzyme nattokinase hoạt huyết mạnh, có khả phòng chữa bệnh chống viêm, ngừa bệnh tả [54] Nhiều nghiên cứu B subtilis Natto tiến hành kết cho thấy chủng vi khuẩn có khả sinh nhiều enzyme nhóm protease nattokinase [33] , elastase [32] , bacillopeptidase F [45] … Chủng vi khuẩn đáp ứng nhu cầu lớn protease ngành chăn nuôi nuôi trồng thủy sản lĩnh vực chế biến thức ăn chăn ni, bổ sung men tiêu hóa, giúp vật nuôi nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn tạo sản phẩm protease Việt Nam chưa nhiều Do nhóm nghiên cứu tiến hành thực đề tài: “Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp protease vi khuẩn Bacillus subtilis Natto” Ý nghĩa đề tài nghiên cứu: - Về khoa học: Cung cấp thông tin khả sinh tổng hợp protease Bacillus subtilis Natto môi trường nuôi cấy bán rắn với thành phần phế phụ liệu ngành nông nghiệp Việt Nam - Về thực tiễn: Góp phần xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm giàu protease, giúp đa dạng hóa sản phẩm Đồ án tốt nghiệp PHỤC LỤC E: Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ chất môi trường bán rắn ONEWAY HD BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN DUNNETT ALPHA(0.05) Oneway [DataSet0] Descriptives HD N 3 3 Total 21 ANOVA HD Between Groups Within Groups Total Đồ án tốt nghiệp Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:HD (I) N Dunnett t a (2-sided) a Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it * The mean difference is significant at the 0.05 level Homogeneous Subsets NT Duncan a Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC F: Khảo sát ảnh hưởng độ ẩm lên khả tổng hợp enzyme protease ONEWAY HD BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN DUNNETT ALPHA(0.05) Oneway [DataSet0] Descriptives HD N Mean 0207 3780 3 7913 5677 Total HD Between Groups Within Groups 12 4394 Total Đồ án tốt nghiệp Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:HD Dunnett t (2-sided) a a Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it * The mean difference is significant at the 0.05 level Homogeneous Subsets NT Duncan a Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC G: Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả tổng hợp enzyme protease ONEWAY HD BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN DUNNETT ALPHA(0.05) Oneway [DataSet0] Descriptives HD N 3 3 3 21 Total HD Between Groups Within Groups Total 10 Đồ án tốt nghiệp Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable: HD (I) NT Dunnett t a (2-sided) a Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it * The mean difference is significant at the 0.05 level Homogeneous Subsets Duncan a Means for groups in homogeneous a Uses Harmonic Mean Sample Si 11 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC H: Khảo sát ảnh hưởng pH phản ứng lên khả xúc tác enzyme protease ONEWAY HD BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN DUNNETT ALPHA(0.05) Oneway [DataSet0] Descriptives HD N 3 3 Total HD Between Groups Within Groups Total 15 12 Đồ án tốt nghiệp Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:HD Dunnett t (2sided) a a Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it * The mean difference is significant at the 0.05 level Homogeneous Subsets HD Duncan a Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 13 ... .30 2.5.3 Khảo sát số điều kiện ảnh hưởng đến khả tổng hợp enzyme protease chủng Bacillus subtilis Natto 31 2.5.4 Khảo sát ảnh hưởng pH lên khả xúc tác protease chủng Bacillus subtilis Natto... nhiên, vi? ??c nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn tạo sản phẩm protease Vi? ??t Nam chưa nhiều Do nhóm nghiên cứu tiến hành thực đề tài: ? ?Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp protease vi khuẩn. .. tổng hợp lúc nhiều loại enzyme khác [9] 13 Đồ án tốt nghiệp 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp protease Bacillus subtilis [7],[16] Q trình tổng hợp enzyme nói chung tổng hợp protease vi sinh