Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactobacillus plantarum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: Th.S Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực : Lê Trần Hồng Xuân MSSV: 1951110191 Lớp: 10DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2014 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học riêng tơi Các số liệu,kết đồán trung thực chưa cơng bố nghiên cứu khác Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2014 Lê Trần Hồng Xuân Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành Đồ án tốt nghiệp mình, em xin chân thành cám ơn thầy Phạm Minh Nhựt tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, truyền đạt cho em nhiều kiến thức suốt trình thực Đồ án Em chân thành cám ơn thầy, cô phụ trách Phịng Thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học, Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm – Môi Trường,Trường Đại Học Công Nghệ Tp HCM tạo điều kiện tốt để em hồn thành Đồ án tốt nghiệp Em xin cám ơn thầy, cô thuộc Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường,Trường Đại Học Công Nghệ Tp HCM tận tình dạy truyền đạt cho em nhiều kiến thức suốt trình học tập trường Tôi xin cám ơn tất bạn làm việc phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học giúp đỡ tơi suốt q trình thực Đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến bố mẹ gia đình ln bênh cạnh, cổ vũ, động viên giúp đỡ gặp khó khăn suốt q trình học tập Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2014 Lê Trần Hồng Xuân Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC TRANG MỤC LỤC i DANH MỤC VIẾT TẮT v DANH SÁCH CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vi khuẩn Lactobacillus plantarum 1.1.1 Đặt điểm chung vi khuẩn L plantarum 1.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng L plantarum 1.1.3 Cơ sở sinh học trình hình thành hợp chất kháng khuẩn vikhuẩn L plantarum 1.2 Hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn L plantarum chế hoạt động 1.2.1 Acid hữu Hydrogen peroxide 1.2.2 Carbon dioxide 1.2.3 Bacteriocin 1.3 Giới thiệu bacteriocin 1.3.1 Lịch sử phát nghiên cứu bacteriocin 1.3.2 Phân loại bacteriocin 10 1.3.3 Cơ chế hoạt động bacteriocin 13 1.4 Tổng quan phương pháp vi gói 14 1.4.1 Khái niệm, đặc điểm, ưu nhược điểm phương pháp vi gói 14 1.4.1.1 Khái niệm vi gói 14 i Đồ án tốt nghiệp 1.4.1.2 Đặc điểm vi gói 15 1.4.1.3 Ưu điểm vi gói 16 1.4.1.4 Nhược điểm phương pháp vi gói 16 1.4.2 Các phương pháp vi gói 16 1.4.2.1 Phương pháp sấy phun 17 1.4.2.2 Phương pháp nhỏ giọt 17 1.4.2.3 Phương pháp polymer hoá liên kết bề mặt 18 1.4.2.4 Phương pháp ngưng tụ polymer hoá 18 1.4.2.5 Phương pháp tách pha đông tụ 18 1.4.3 Vật liệu vi gói, đặc điểm vật liệu vi gói 18 1.4.3.1 Gelatin 18 1.4.3.2 Alginate 21 1.4.3.3 Các hợp chất vi gói khác 23 1.5 Quorum sening trình hình thành bacteriocin 25 1.5.1 Khái niệm quorum sening 25 1.5.2 Vật chất liên lạc, dấu hiệu liên lạc chế tác động quorum sening 26 1.5.3 Ứng dụng hệ thống quorum sening 28 1.5.4 Vai trị quorum sening q trình hình thành bacteriocin 28 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 30 2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 30 2.1.1 Thời gian nghiên cứu 30 2.2 Vật liệu nghiên cứu 30 2.2.1 Vi khuẩn Lactobacillus plantarum 30 2.2.2 Vi khuẩn thị 30 2.2.3 Hoá chất, dụng cụ thiết bị 30 2.2.3.1 Môi trường nuôi cấy phân lập 30 2.2.3.2 Dụng cụ thiết bị 30 2.3 Phương pháp nghiên cứu 31 ii Đồ án tốt nghiệp 2.3.1 Phương pháp pha loãng mẫu 31 2.3.2 Phương pháp tăng sinh 31 2.3.3 Phương pháp bảo quản giữ giống vi sinh vật 32 2.3.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật 32 2.3.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 32 2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 33 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 33 2.4 Bố trí thí nghiệm 34 2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng hình thức ni cấy đến khả sinhhợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum 34 2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn gelatin alginat đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum 35 2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh huổng tỷ lệ cấy giống đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn L plantarum 36 2.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ vi khuẩn thị đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn L plantarum 36 2.4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn L plantarum 37 2.4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng thời gian bảo quản lactose đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn L plantarum 37 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng hình thức ni cấy đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01 38 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn gelatin – alginate đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01 40 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01 42 3.4 Kết đánh giá khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01 mật độ vi khuẩn thị khác 44 iii Đồ án tốt nghiệp 3.5 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01 46 3.6 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian bảo quản lactose 10% đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01 48 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 4.1 Kết luận 51 4.2 Đề nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC VIẾT TẮT LAB Lactic Acid Bacteria (Vi khuẩn lactic) MRS de Man, Rogosa, Sharpe TSA Trypicase soya Agar MRS OPTSC01 Môi trường MRS tối ưu v Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 1.1.Một số chủng Lactobacillus plantarum Hình 1.2.Tế bào vi khuẩn L plantarum Hình 1.3.Cấu trúc gelatin 20 Hình 1.4.Cấu tạo hoá học alginate 22 Hình 1.5.Cấu trúc hố học Kappa – carrageenan 24 Hình 1.6.Cấu trúc hố học Chitosan 25 Hình 1.7.Cơ chế hoạt động quorum sening 27 Hình 2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm 34 Hình 3.1.Tỷ lệ ức chế vi khuẩn thị dịch vi khuẩn L plantarum SC01 điều kiện nuôi cấy khác 38 Hình 3.2.Tỷ lệ ức chế vi khuẩn thị dịch tế bào vi khuẩn L plantarum SC01 cố định tỷ lệ phối trộn alginate – gelatin khác 41 Hình 3.3.Tỷ lệ ức chế vi khuẩn thị tỷ lệ cấy vi khuẩn L plantarum SC01 43 Hình 3.4.Kết đánh giá khả vi khuẩn L plantarum SC01 cố định hỗn hợp alginate 2,5 % - gelatin % ức chế vi khuẩn thị mật độ khác 44 Hình 3.5.Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy L plantarum SC01 cố định hỗn hợp alginate 2,5 % - gelatin % đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01 46 Hình 3.6.Ảnh hưởng thời gian bảo quản lactose 10 % đến khả hình thành hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01 cố định hỗn hợp alginate 2,5 % - gelatin % 48 vi Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Sản phẩm lên men truyền thống sản phẩmphổ biến lâu đời dân tộc giới.Đó loại sản phẩm sản xuất thủ công, mang sắc thái sắc riêng dân tộc, vùng miền.Nước ta có nguồnnơng sản dồi làm tiền đề để sản xuất sản phẩm lên men truyền thống.Đặc biệt sản phẩm lên men chua.Ở nước ta, hệ vi khuẩn lactic diện phong phú chủng loại Vi khuẩn lactic hệ vi sinh vật ứng dụng nhiều lĩnh vực trongchế biến bảo quản thực phẩm sản xuất chế phẩm vi sinh có lợi Trong trình sinh trưởng phát triển, vi khuẩn lactic sản sinh môi trường số hợp chất thứ cấp acid hữu cơ, hydrogen peroxide, carbon dioxie, bacteriocin enzymee làm tăng hương vị, màu sắc kết cấu cho sản phẩm Ngoài việc tăng tính cảm quan cho sản phẩm, hợp chất cịn có khả ngăn chặn phát triển vi khuẩn có hại, giúp cho q trình bảo quản thực phẩm tốt Năm 2013, Lê Ngọc Thuỳ Trang thực nghiên cứu “Tuyển chọn khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sản sinh hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn lactic”, kết phân lập chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01 từ sữa chua lên men truyền thống cho khả sinh hợp chất kháng khuẩn mạnh, đồng thời xác định thành phần môi trường MRS OPTSC01 tối ưu cho sản sinh hợp chất kháng khuẩn L plantarum SC01 Từ nghiên cứu mở hướng nghiên cứu nhằm hoàn thiện đánh giá toàn diện khả sinh hợp chất kháng khuẩn từ chủng vi khuẩn Với ý nghĩa thực tiển ý nghĩa khoa học vậy, tiến hành thực đề tài “Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn Lactobacillus plantarum” Nghiên cứu hy vọng làm tiền đề cho nghiên cứu tiếptheo việc tạo chất bảo quản sinh học đem lại hiệu bảo quản thực phẩm ngày cao Đề tài mang tính kế thừa Đồ án tốt nghiệp 80% a 70% aa aa Tỷ lệ ức chế (%) 60% 50% 40% E coli b bbb b Salmonella c c c cb S aureus B subtilis 30% dd 20% c d d c d L monocytogenes d ee 10% 0% Alginate + Alginate + Alginate + Alginate + Alginate + Gelatin % Gelatin % Gelatin 10 % Gelatin 12% Gelatin 14 % Hình 3.2.Tỷ lệ ức chế vi khuẩn thị dịch tế bào vi khuẩn L plantarum SC01 cố định tỷ lệ phối trộn alginate – gelatin khác Các nghiệm thức mang chữ khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) Khả đánh giá ảnh hưởng tỷ lệ gelatin phối trộn với alginate 2,5% đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn L plantarum SC01 thông qua khả ức chế vi khuẩn thị thể Hình 3.2 Kết cho thấy dịch sau ly tâm trung hoà L plantarum SC01 cố định hỗn hợp gelatin – alginate nghiệm thức tỷ lệ phối trộn gelatin cho kết đối kháng với chủng vi khuẩn tỷ lệ ức chế khác tỷ lệ ức chế chủng vi khuẩn thị thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) Kết cho thấy tỷ lệ phối trộn gelatin – alginate có ảnh hưởng đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01 Trong nghiệm thức khảo sát, L plantarum SC01 cố định hỗn hợpgelatin % - alginate 2,5 % cho kết đối kháng với chủng vi khuẩn thị cao nhấtvà đồng so với nghiệm thức tỷ lệ phối trộn lại (tỷ lệ ức chế E Coli, B subtillis, L monocytogenes gần 70 % tỷ lệ ức chế với Salmonella, S aureus 60 %), thể 41 Đồ án tốt nghiệp khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức lại (P < 0,05) Đối với nghiệm thức plantarum SC01 cố định gelatin 14 % - alginate 2,5 % cho tỷ lệ ức chế vi khuẩn thị thấp Từ kết nghiên cứu cho thấy diện gelatin phối trộn với alginate để cố định L plantarum SC01 tăng dần kết sản sinh hợp chất kháng khuẩn chủng vi khuẩn lại giảm dần Điều nồng độ gelatin tăng lên độ hồ tan dung dịch gelatin – alginate giảm xuống, làm cho khả liên kết với alginate dẫn đến khả tạo gel kém, tạo hạt vi gói có độ bền Đồng thời, tăng nồng độ gelatin, độ nhớt dung dịch tăng lên gây khó khăn q trình vi gói, kích thước hạt không đồng đều, điều ảnh hưởng lớn đến chất lượng vi gói làm ảnh hưởng đến khả bao gói vi khuẩn ảnh hưởng đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn Vì nồng độ tỷ lệ gelatin cao tỷ lệ ức chế vi khuẩn thị thấp Trong thí nghiệm nâng cao chất lượng sữa chua vi gói vi khuẩn lactic, Đỗ Quốc Cường (2009) cho nồng độ gelatin từ 10% trở lên tạo vi gói với alginate 2% nồng độ gelatin cao khả vi gói cao Điều có phần khác biệt với kết thí nghiệm trên, ngun nhân mục đích thực nghiên cứu khơng giống nhau; vi khuẩn chọn vi gói khác nhau; nồng độ alginate sử dụng yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH,…) q trình tiến hành thí nghiệm khơng giống Vì vậy, thí nghiệm đánh giá tỷ lệ gelatin phối trộn với alginate đến khả hình thành hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01, chủng sinh hợp chất kháng khuẩn có hoạt tính ức chế vi khuẩn thị mạnh cố định hỗn hợp gelatin % - alginate2,5 % Kết thí nghiệm sử dụng cho thí nghiệm 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ cấy giốngđến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01 42 Đồ án tốt nghiệp Trong kết nghiên cứu Sahingil ctv (2009) cho thấy khả sinh tổng hợp bacteriocin vi khuẩn phụ thuộc vào mật độ tế bào vi khuẩn môi trường ni cấy Kết thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ cấy giống đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01, trình bày Hình 3.3 70% a a Tỷ lệ ức chế (%) 60% a a a a a a b 50% E coli b b b 40% Salmonella c S aureus b 30% B subtilis c c 20% 10% a L monocytogenes c c d 0% 1% 2% 3% 4% Hình 3.3.Tỷ lệ ức chế vi khuẩn thị tỷ lệ cấy vi khuẩn L plantarum SC01 Các nghiệm thức mang chữ khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (P 0,05) Xét tỷ lệ ức chế chủng vi khuẩn thị, L plantarum SC01 cho khả ức chế mạnh vi khuẩn E Coli (tỷ lệ ức chế gần 70%) mật độE Coli 104 cfu/ml khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) so với mật độ 105, 106, 108 (cfu/ml) Khả ức chế vi khuẩn E Coli thấp nghiệm thức mật độ 107 cfu/ml Đối với chủng vi khuẩn thị lại (Salmonella, S aureus, B subtilis L monocytogenes)dịch vi khuẩn L plantarum SC01 ly tâm sau trung hòa cho khả ức chế vi khuẩn 45 Đồ án tốt nghiệp thị nghiệm thức mật độ vi khuẩn thị khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) Kết khảo sát ảnh hưởng mật độ vi khuẩn thị đến khả hình thành hợp chất kháng khuẩn plantarum SC01 cho thấy mật độ vi khuẩn thị khơng có ảnh hưởng đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01 Kết thí nghiệm khơng tương đồng với kết Lê Ngọc Thuỳ Trang (2013) nghiên cứu L plantarum SC01 dạng tự cho tỷ lệ ức chế vi khuẩn thị thấp mật độ vi khuẩn thị cao Sự khác biệt vi gói tế bào vi khuẩn bảo vệ tốt từ cho khả sinh hợp chất kháng khuẩn cao Từ kết thí nghiệm tiếp tục sử dụng mật độ vi khuẩn thị 106 cfu/ml thí nghiệm 3.5 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L.plantarum SC01 Theo nghiên cứu Zalán ctv (2005), thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn Lactobacillus Kết thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01 trình bày Hình 3.5 46 Đồ án tốt nghiệp 80% Tỷ lệ ức chế (%) 70% 60% E coli 50% Salmonella 40% S aureus 30% B subtilis 20% L monocytogenes 10% 0% 0h 4h 8h 12h 16h 20h 24h 28h 32h 36h 40h 44h 48h Hình 3.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01 Các nghiệm thức mang chữ khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) Dựa vào kết ức chế phát triển vi khuẩn thị Hình 3.5 nhận thấy thời gian ni cấy có ảnh hưởng đến hình thành hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarumSC01 Khả sinh hợp chất kháng khuẩn L plantarumSC01thể tỷ lệ ức chế phát triển củavi khuẩn thị thời gian khác Trong khoảng thời gian từ đến giờ, L plantarumSC01 chưa sản sinh hợp chất kháng khuẩn nên chưa có khả ức chế phát triển chủng vi khuẩn thị E Coli, Salmonella, S aureus, B subtilis L monocytogenes.Đến thời điểm nuôi cấy, L plantarumSC01 bắt đầu sản sinh hợp chất kháng khuẩn, có hoạt tính thấpchỉ có khả ức chế phát triển B subtilis (0,36%)và L monocytogenes (1,36%) khơng có khả ức chế E Coli, Salmonella, S aureus Từ 12 đến 16 giờ, L plantarumSC01 sản sinh hợp chất kháng khuẩn cho khả ức chế Salmonella, S aureus, B subtilis L 47 Đồ án tốt nghiệp monocytogenesnhưng tỷ lệ ức chế thấp chưa có khả ức chếsự phát triển E Coli Từ thời điểm 20 giờ, hợp chất kháng khuẩn L plantarumSC01 sản sinh bắt đầu cho khả ức chế phát triển chủng vi khuẩn thị tỷ lệ ức chế vi khuẩn thị tăng dần từ 20 đến 48 giờ.Tại thời điểm 48 giờ, dịch L plantarumSC01 sau ly tâm chỉnh pH sản sinh hợp chất kháng khuẩn cho tỷ lệ ức chế phát triển chủng vi khuẩn thị cao Kết thí nghiệm tương đồng với kết khảo sát đường cong tăng trưởng L plantarum SC01 Lê Ngọc Thuỳ Trang (2013) Đồng thời phù hợp với kết Zalán ctv (2005) tiến hành khảo sát khả sinh hydrogen peroxide bacteriocin vi khuẩn L plantarum 2142 mốc thời gian 0, 2, 24, 48 72 cách đo đường kính vịng kháng khuẩn Kết nghiên cứu cho thấy phát triển L monocytogenesvà B cereus bị ức chế hydrogenperoxide đệm phosphate L plantarum 2142 sản sinh sau 24 48 nuôi cấy Và kết nghiên cứuL plantarum ST194BZ Todorov Dicks (2005) cho thấy sau nuôi cấy muôi trường MRS lượng bacteriocin tạo thành tương đối thấp (400AU/ml) sau 13giờ - 14 nuôi cấy lượng bacteriocin tạo thành cao (12800 AU/ml) Do điều kiện thí nghiệm khơng thể khảo sát với thời gian cách nên chưa xác định thời điểm L plantarum SC01 sinh hợp chất kháng khuẩn có hoạt tính mạnh Tuy nhiên, kết thí nghiệm có ý nghĩa việc xác định thời điểm mà vi khuẩn L plantarum bắt đầu sản sinh hợp chất kháng khuẩn cố định hỗn hợp gelatin – alginate 3.6 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian bảo quản lactose 10 % đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01 Sau tiến hành khảo sát cácyếu tố ảnh hưởng thời gian sản sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01 cố định Tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian bảo quản lactose đến khả hình 48 Đồ án tốt nghiệp thành hợp chất kháng khuẩn L plantarum SC01 nồng độ lactose chọn làm thí nghiệm 10 %theo thể tích Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian bảo đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩnL plantarum SC01 thông qua khả ức chế vi khuẩn thị trình bày Hình 3.6 90% Tỷ lệ ức chế (%) 80% 70% aa baa aa aa b ba aa c a bb bb 60% 50% c d c c E coli c Salmonella 40% S aureus 30% B subtilis 20% L monocytogenes 10% 0% Tuần Tuần Tuần Tuần Tuần Hình 3.6 Ảnh hưởng thời gian bảo quản lactose 10 % đến khả hình thành hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01 Các nghiệm thức mang chữ khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) Dựa vào kết ức chế phát triển vi khuẩn thị L plantarum SC01 Hình 3.6 nhận thấy thời gian bảo quản có ảnh hưởng đến khả hình thành hợp chất kháng khuẩn L plantarum SC01 Dịch vi khuẩn L plantarum SC01 sau ly tâm điềuchỉnh pH nghiệm thức cho kết ức chế chủng vi khuẩn thị tỷ lệ ức chế khác tỷ lệ ức chế chủng vi khuẩn thị thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) Đồng thời, tỷ lệ ức chế vi khuẩn thị giảm dần theo thời gian khảo sát giảm mạnh tuần thứ Trong nghiệm thức thời gian bảo quản, thời điểm vừa cố định vi khuẩn L.plantarum SC01khả sinhhợp chất kháng khuẩn chúngcó hoạt tính ức chế cao với vi khuẩn thị Sau tuần bảo quản lactose 10% nhiệt độ 40C hoạt tính ức chế hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn giảm 49 Đồ án tốt nghiệp không đáng kể(1,37 %) Tại thời điểm tuần bảo quản, hoạt tính hợp chất giảm dần với tỷ lệ giảm tỷ lệ ức chế 4,66 % 6,25 % Tuy nhiên, đến thời gian bảo quản tuần, tế bào L plantarum SC01 cố định sinh hợp chất kháng khuẩn có tỷ ức chế vi khuẩn thị đạt 57,49 % tỷ lệ ức chế giảm đến 37,35 % so với thời điểm ban đầu Kết thí nghiệm cho thấy thời gian bảo quản có ảnh hưởng đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn L plantarum SC01, thời gian bảo quản lâu khả sinh hợp chất kháng khuẩn L plantarum SC01 giảm.Điều trình bảo quản, thường sử dụng nhiệt độ lạnh nhằm để kìm hãm phát triển vi sinh vật để tránh cho vi sinh vật vào phase tử vong Do đó, thời gian đầu sau bảo quản, tế bào vi khuẩn giữ hoạt tính thời gian bảo quản dài (4 tuần), hoạt tính tế bào vi khuẩn bị ảnh hưởng donhững tác nhân vật lý q trình bảo quản làm vỡ lớp vi gói, giải phóng tế bào ngồi; thời gian bảo quản lâu, nguồn dinh dưỡng cạn kiệt dẫn đến cạnh tranh dinh dưỡng vi khuẩn làm số lượng vi khuẩn bị giảm đáng kể tế bào bị già chết Từ kết nghiên cứu này, việc bảo quản vi khuẩn L.plantarum SC01 môi trường đường lactose 10% thật có hiệu việc đảm bảo tỷ lệ sống hoạt tính chúng Tuy nhiên, việc bảo quản nên thực thời gian định (từ tuần đến tuần) nhằm đảm bảo giữ nguyên hoạt tính vi khuẩn Kết thí nghiệm có ý nghĩa lớn, đặc biệt ứng dụng trình sản xuất tiết kiệm nhiều thời gian chi phí cho q trình chuẩn bị vi khuẩn trước đưa vào giai đoạn sản xuất Tóm lại, từ kết thí nghiệm tiến hành khảo sát khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01, nhận thấy khả sinh hợp chất kháng khuẩn chủng tốt dù cố định hỗn hợp alginate – gelatin nuôi cấy dạng tự (Lê Ngọc Thùy Trang, 2013) Đồng thời xác định yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn chúng điều kiện bảo quản vi khuẩn cố 50 Đồ án tốt nghiệp định hỗn hợp alginate – gelatin Các kết nghiên cứu có ý nghĩa nhằm hướng đến khả ứng dụng hợp chất kháng khuẩn thân sinh khối vi khuẩn L plantarum SC01 lĩnh vực bảo quản thực phẩm, sản xuất chế phẩm vi sinh chăn nuôi, thủy sản hay ứng dụng ủ chua thức ăn xanh cho gia súc 51 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận - Tế bào vi khuẩn L planarum SC01 cố định hỗn hợp sinh gelatin – alginate cho khả sinh hợp chất kháng khuẩn cao - Tế bào vi khuẩn L planarum SC01 cố định gelatin 6% alginate 2,5% cho khả sinh hợp chất kháng khuẩn cho tỷ lệ ức chế vi khuẩn thị cao - Vi khuẩn L plantarum cố định cho khả sinh hợp chất kháng khuẩn cao với tỷ lệ cấy giống3 % theo thể tích - Khả sinh hợp chất kháng khuẩn L plantarum SC01 không bị ảnh hưởng mật độ vi khuẩn thị khác - Xác định thời điểm L plantarumSC01 bắt đầu sinh hợp chất kháng khuẩn nuôi cấy 48 vàcho khả sinh hợp chất kháng khuẩn cao thời điểm 48 - Vi khuẩn L plantarum SC01 cố định bảo quản môi trường lactose 10% thời gian định (1 đến tuần) cho khả sinh hợp chất kháng khuẩn tốt 4.2 Đề nghị - Đánh giá yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L planarum SC01 cố định alginate 2,5 % - gelatin % - Khảo sát lại ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum với khoảng thời gian ngắn - Ứng dụng hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum SC01 sản sinh vào trình bảo quản thực phẩm - Tách, chiết tinh bacteriocin tạo chế phẩm sinh học cho hiệu bảo quản thực phẩm cao 52 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Cái Ngọc Bảo Anh, Võ Đăng Bảo Quốc 2012 Đặc tính điều trị chủng vi khuẩn acid lactic.http://menvisinh.org/content/dac-tinh-dieu-tri-cua-chung-vi-khuansinh-axit-lactic Cao Thị Huỳnh Châu 2007 Đáng giá chất lượng gelatin da cá tra Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ thực phẩm, Đại Học Cần Thơ Đỗ Quốc Cường 2009.Nâng cao chất lượng sữa chua phương pháp vi gói vi khuẩn lactic Khố luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại Học Công Nghệ Tp HCM Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp Giới thiệu số kỹ thuật bảo quản visinhvật.03/03/2007.http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/kythu atbaoquanvisinhvat.htm Nguyễn Hoài Hương, Dương Thúy Vy, Trần Linh Châu, Đoàn Kim Như 2012 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic từ nem chua truyền thống làm giống khởi động lên men nem chua probiotic Hội nghị Công nghệ Sinh học tồn quốc khu vực phía Nam lần thứ II: – 11 Đặng Phương Nga, Nguyễn Thị Yên, Đỗ Thu Phương, Nguyễn Bá Tú, Lại Thuý Hiền, 2007.Khả ức chế vi khuẩn gây bệnh Vibrio nước nuôi tôm Baclillus subtilis HY1 Lactococcus lactis CC4K Tạp chí cơng nghệ sinh học 5(3): 383 – 390 Phạm Minh Nhựt 2010 Đáng gía tính đối kháng vi khuẩn Vibrio spp nghiên cứu nâng cao tỉ lệ sống ấu trùng cá chẽm (Lates calcarifer) chủng vi khuẩn phân huỷ N- Hexanoyl Homoserine Lactone Luận văn Thạc Sỹ Khoa Học Nông Nghiệp, Đại Học Nâm Lâm Tp HCM Phạm Minh Nhựt 2010 Thực hành vi sinh đại cương Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp HCM 53 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh 2012 Khả ức chế trình phát sáng sinh học Vibrio harveyi enzymee AHL - lactonase tái tổ hợp Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II Lê Ngọc Thùy Trang 2013 Phân lập khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn Lactobacillus plantarum Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại Học Công Nghệ Tp HCM Lê Thị Hồng Vân 2008 Phân lập chủng vi khuẩn lactic khảo sát khả sinh tổng hợp bacteriocin Luận văn tốt nghiệp đại học, Khoa kỹ thuật hoá học, Đại Học Bách Khoa Tp HCM TÀI LIỆU TIẾNG ANH Adlam K., 2013 Lactobacillus plantarum and it’s biological implications.http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Lactobacillus_plantaru m_and_its_biological_implications Amed T., Kanwal R., 2004 Biochemical Characteristics of Lactic Acid Producing Bacteria And Preparation of Camel Milk Cheese By Using Starter Culture Pakistan Veterinary Journal 24 (2): 87 – 91 Ammor S., Tauveron G., Dufour E., Chevallier I, 2005 Antibacterial activity of lactic acid bacteria against spoilage and pathogenic bacteria isolated from the same meat small-scale facility 1—Screening and characterization of the antibacterial compounds Food Control 17(2006): 454 – 461 De Vries M.C., Vaughan E.E., Kleerebezem M., De Vos W.M., 2005.Lactobacillus plantarum – survival, functional and potential probiotic properties in the human intestinal tract.International Dairy Journal16: 1018 – 1028 Heng N.C.K., Wescombe P.A., Burton J.P., Jack R.W., Tagg J.R., 2007.The Diversity Of Bacteriocins In Gram – Positive Bacteria In: Bacteriocins: Ecology and Evolution(Eds Riley M.A., Chavan M.A.), University of Massachusetts Biology Department, Amherst, USA Kuiper O.P, De Ruyter P.G.G.A, De Vos W.M, 1998 Quorum sensing – controlled gene expression in lactic acid bacteria.Journal of Biotechnology64: 15 – 21 54 Đồ án tốt nghiệp Nilsang S., 2010 Bacteriocin Production by Lactic Acid Bacteria Encapsulated in Calcium Alginate Beads KKU Research Journal of Humanities and Social Sciences 15(9): 889 – 896 Rattanachaikunsopon P., Phumkhachorn P., 2010 Lactic acid bacteria: their antimicrobial compounds and their uses in food production Annals of Biological Research1(4): 218 – 228 Sabbah M., Legowo A.M., Pramono Y.B., 2012 The effect of different ratio of bacteria (Lactobacillus bulgaricus + Streptococcus thermophilus and Bifidobacterum longum ATCC15707) on characteristics of yogurt at different storage period Journal of Applied Food Technology (2): 32 – 38 Sahingil D., Isleroglu H., Yildirm Z., Akcelik M., Yildirim M., 2009.Characterization of lactococcin BZ produced by Lactococcus lactis subsp lactis BZ isolated from boza Turkish Journal Of Biology35: 21 - 33 Sukovic J., Kos B., Beganovic J., Pavunc A.L., Habianic K., Matosic S., 2010.Antimicrobial Activity – The Most Important Property of Probiotic and Starter Lactic Acid Bacteria.Food Technology And Biotechnology48 (3): 296 – 307 Todorov S.D, Dicks L.M.T, 2005 Effect of Growth Medium on Bacteriocin Production by Lactobacillus plantarum ST194BZ, a Strain Isolated from Boza.Food Technology And Biotechnology 43: 165 – 173 Wilson N., Shah N.P., 2007 Microencapsulation of Vitamins.ASEAN Food Journal 14 (1): – 14 Zalán Z., Németh E., Baráth Á., Halász A., 2005 Influence of Growth Medium on Hydrogen Peroxide and Bacteriocin Production of Lactobacillus Strains.Food Technology AndBiotechnology 43 (3): 219 – 225 55 ... cấy đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn L plantarum - Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ phối trộn chất vi gói đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn L plantarum - Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ vi khuẩn, mật độ vi khuẩn. .. đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn L plantarum - Khảo sát ảnh hưởng thời gian bảo quản đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn L plantarum Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu tiến hành khảo sát yếu tố ảnh. .. 5: Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn L plantarum 37 2.4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng thời gian bảo quản lactose đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn L plantarum