Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae

Đồ án tốt nghiệp -1- SVTH: Nguyễn Văn Thân LỜI MỞ ĐẦU Trong vài thập kỹ trở lại đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm enzym được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực kinh tế. Enzym đã từng bước làm thay đổi và nâng cao một số các quá trình công nghệ trong chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của xã hội. Trong công nghiệp thực phẩm các chế phẩm enzym được sử dụng với nhiều mục đích và tác động với nhiều mức độ khác nhau. Enzym có thể tham gia cải thiện hoặc tiêu chuẩn hóa các quá trình chuyển hóa, từ đó cho phép nhận các sản phẩm mới hay các sản phẩm có chất lượng cao hơn. Đặc biệt enzym cũng có thể can thiệp chính vào quá trình chế biến và đóng vai trò công cụ công nghệ. Hàng năm lượng enzym được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD được phân bố trong các lĩnh vực khác nhau. Ngành công nghệ enzym trên thế giới phát triển khá mạnh, đặc biệt là ở các nước Châu Âu, ở Châu Á có nước Nhật Bản với các chế phẩm enzym khá đa dạng chiếm khoảng 12-15% thị trường thế giới. Việt Nam ngành công nghiệp sản xuất enzym phát triển chưa mạnh lắm. Do vậy, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm enzym là một hướng đi đầy triển vọng cho ngành công nghiệp sản xuất enzym ở nước ta. Thông thường sản xuất chế phẩm enzym đi từ ba nguồn: động vật, thực vật, và vi sinh vật. Đối với nguồn enzym từ động vật và thực vật ở cuối thế kỷ 19 và 20, người ta thường chỉ khai thác những gì có sẵn trong thiên nhiên, chưa đưa ra một quy trình công nghệ theo mô hình công nghiệp hoàn chỉnh. Và còn nhiều yếu tố rủi ro, khó khăn về trang thiết bị. Ngày nay ngành công nghiệp sản xuất enzym từ vi sinh vật rất phát triển. Các proteaza là enzym được sử dụng nhiều nhất hiện nay, tiếp đến là các enzym amylaza, glucoizomeraza, cellulaza, pectinaza Trong vi sinh vật, để sản xuất enzym proteaza và amylaza thì vi khuẩn và nấm mốc là hay dùng nhất. Tuy nhiên ở nấm mốc thì trong cùng điều kiện có thể tổng hợp nhiều enzym cùng một lúc và enzym tạo thành được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. Đồ án tốt nghiệp -2- SVTH: Nguyễn Văn Thân Xuất phát từ tầm quan trọng đó của chế phẩm enzym và được sự hướng dẫn của cô giáo Th.S Phan Thị Bích Ngọc tôi chọn đề tài: “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp hai enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae”. Sở dĩ tôi chọn chủng Aspergillus oryzae này là do ở chủng nấm mốc này khả năng sinh tổng hợp hai enzym amylaza và proteaza đều rất mạnh. Hơn nữa enzym proteaza và amylza từ nấm mốc được sử dụng rất nhiều vào ngành công nghiệp thực phẩm. Và trong dân gian đã dùng nấm mốc Aspergillus oryzae để sản xuất nước chấm. Và ngày nay một số công trình nghiên cứu đang hoàn thiện công nghệ lên men nước chấm nhờ enzym của nấm mốc. Đề tài nghiên cứu của tôi được tiến hành theo hướng sau: 1. Tiến hành phân lập lại chủng nấm mốc Aspergillus oryzae từ Viện Công Nghiệp Thực Phẩm Hồ Chí Minh. 2. Khảo sát khả năng sinh hai enzym proteaza và amylaza của chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. 3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. Do thời gian làm đề tài có hạn và sự hiểu biết về enzym còn hạn chế. Cho nên đề tài không thể tránh khỏi những thiếu sót, vướng mắc. Tôi rất mong được sự góp ý rất chân thành của các thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn chỉnh hơn. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. Đồ án tốt nghiệp -3- SVTH: Nguyễn Văn Thân CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về vi sinh vật sinh tổng hợp enzym. Người ta thường khai thác enzym amylaza, bromelin, papain từ thực vật, pepsin, chimotripsin, renin từ động vật. Đặc điểm rất dễ nhận thấy ở giới thực vật hay giới động vật là mỗi loài chỉ có thể cho ta một loại enzym nào đó, ví dụ như malt cho enzym amylaza, dứa cho enzym bromelin, đu đủ cho enzym papain Riêng thế giới vi sinh vật cho ta tất cả các enzym đã được biết còn lại. Vi sinh vật là giới sinh vật được xem như nhiều nhất và có khả năng chuyển hóa vật chất trong thiên nhiên mạnh nhất. Hiện nay người ta khai thác enzym nhiều từ vi sinh vật và được ứng dụng rất nhiều trong đời sống, sản xuất. So với nguồn enzym khai thác từ động vật và thực vật, nguồn enzym từ vi sinh vật có những ưu điểm quan trọng sau đây: 1- Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh. Do dó chỉ trong một thời gian ngắn ta có thể thu được một lượng enzym rất lớn. 2- Enzym từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao, có khả năng chuyển hóa một khối lượng vật chất rất lớn. Người ta đã làm thí nghiệm và cho biết rằng chúng có khả năng chuyển hóa một khối lượng vật chất lớn hơn 30-40 lần khối lượng của tế bào vi sinh vật tạo ra chúng. 3- Nguyên liệu dùng để sản xuất enzym rẻ tiền và dễ kiếm. 4- Nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào thời tiết, điều kiện địa lý như nuôi, trồng động vật và thực vật. 5- Hoàn toàn có thể sản xuất theo quy mô công nghiệp và hoàn toàn kiểm soát được quá trình sản xuất. [5, tr 197]. 1.1.1. Vi sinh vật tham gia tổng hợp enzym amylaza. Các nhà khoa học cho biết enzym amylaza được vi khuẩn và nấm sợi tổng hợp nhiều nhất. Ở các loài vi sinh vật khác khả năng này yếu hơn. Các loại enzym amylaza thường gặp khi nuôi cấy vi sinh vật gồm: α -amylaza, β -amylaza, glucoamylaza. Hệ enzym amylaza là một trong những hệ enzym được nghiên cứu sớm nhất và có nhiều công trình nghiên cứu được công bố nhất. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. Đồ án tốt nghiệp -4- SVTH: Nguyễn Văn Thân Các giống được sử dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất enzym amylaza bao gồm: Aspergillus oryzae, Asp. usami, Asp. awamori, Asp. batatae; 1.1.2 Vi sinh vật tham gia tổng hợp enzym proteaza. Proteaza là một loại enzym tham gia phân giải protein để tạo thành các peptit ngắn và cuối cùng tạo thành các axit amin và NH 3 . Enzym proteaza đầu tiên được nghiên cứu không phải là các proteaza của vi sinh vật mà là các proteaza của động vật (chủ yếu là proteaza trong bộ tiêu hóa của động vật). Từ những năm 1950 sau khi hoàn thiện những phương pháp tinh sạch protein, người ta đã thu nhận được những chế phẩm proteaza tinh khiết hơn. Cũng từ đây các nhà khoa học cũng bắt đầu những nghiên cứu proteaza của vi sinh vật. Tuy nhiên trước đó vào năm 1918 - 1919, Wakman đã phát hiện khả năng phân giải protein của xạ khuẩn. Từ đó đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu được công bố theo chiều hướng này. Ngày nay các loại enzym proteaza từ vi sinh vật được sản xuất rất nhiều và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, y học và nông nghiệp. Ưu điểm lớn nhất của proteaza từ vi sinh vật là chúng rất phong phú về chủng loại. [5, tr 201]. 1.2. Nấm mốc và enzym. 1.2.1. Nấm mốc. 1.2.1.1. Đặc điểm chung của nấm mốc. Nấm mốc là tên chung để chỉ các nhóm nấm không phải là nấm men cũng không phải là các nấm lớn có quả thể. Đây là nhóm vi sinh vật có cấu tạo dạng sợi có lông tơ, sợi bông, tạo khuẩn ty ở dạng bột Màu sắc của nấm mốc được xác định bởi các bào tử do nó sinh ra như màu xanh, vàng, trắng, đen, nâu Trong thực phẩm nấm mốc xuất hiện trên bề mặt nước chấm, bánh mỳ để lâu ngày. Mặt khác nấm mốc có thể tham gia vào nhiều quá trình có lợi khác như là tác nhân quan trọng của quá trình sản xuất nước chấm, tương, chao, đường, axit hữu cơ. Nấm mốc hô hấp hiếu khí bắt buộc, có thể phát triển trên một số môi trường mà nấm men và vi khuẩn không thể phát triển được như ở môi trường có áp suất thẩm thấu, độ ẩm và độ axit lớn. [7, tr 57]. 1.2.1.2. Cấu tạo của nấm mốc. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. Đồ án tốt nghiệp -5- SVTH: Nguyễn Văn Thân Nấm mốc có dạng hình sợi phân nhánh hoặc không phân nhánh, có cấu tạo đơn bào hoặc đa bào. Sợi nấm có kích thước bề dày đường kính từ 1- 10 µ m hoặc 20 µ m, chiều dài có thể lên đến vài chục cm. Khi nấm mốc phát triển sẽ tạo thành hệ sợi nấm phát triển trên bề mặt môi trường thì gọi là khuẩn ty ký sinh và ăn sâu vào môi trường thì gọi là khuẩn ty dinh dưỡng hay khuẩn ty cơ chất. Đến giai đoạn trưởng thành từ các khuẩn ty ký sinh sẽ hình thành các cơ quan sinh sản gọi là bào tử. Một số loại nấm mốc đơn bào, bậc thấp như lớp Phycomycetes trong đó điển hình là Mucor, Rhizopus, khuẩn ty thường không có vách ngăn, toàn bộ khuẩn ty được coi là một tế bào phân nhánh, đa nhân. Còn các khuẩn ty có vách ngăn thì tạo nên cơ thể đa bào như Penicillium, Aspergillus. Nấm mốc là loại thực vật không có diệp lục tố, do đó không có khả năng tiến hành quang hợp như các loại cây xanh. Chúng sống nhờ khả năng hấp thụ các thức ăn có sẵn qua bề mặt của các khuẩn ty, đó là các cơ thể ký sinh hoặc hoại sinh. Cấu tạo bên trong của tế bào nấm tương tự vi khuẩn, nấm men có nghĩa là chúng cũng được cấu tạo từ ba phần cơ bản của tế bào sống: Thành tế bào, nguyên sinh chất và nhân.[7, tr 57]. 1.2.1.3. Sinh sản của nấm mốc. Nấm mốc có hai hình thức sinh sản chính đó là: Sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính. Sinh sản vô tính gồm: - Sinh sản bằng khuẩn ty: Tức là bằng sợi nấm. Từ một khuẩn ty riêng rẽ gặp điều kiện thuận lợi dễ dàng phát triển tạo thành một khuẩn ty thể. - Sinh sản bằng bào tử: Sinh sản bằng bào tử nội sinh và bào tử ngoại sinh. + Sinh sản bằng bào tử ngoại sinh gồm ba hình thức chính: Sinh sản bằng bào tử dày, sinh sản bằng bào tử trứng, sinh sản bằng bào tử chồi. + Sinh sản bằng bào tử nội sinh. + Sinh sản bằng bào tử đỉnh. Sinh sản hữu tính gồm các hình thức sau: Sinh sản bằng bào tử tiếp hợp, sinh sản bằng bào tử noãn hay bào tử trứng, sinh sản bằng bào tử túi.[7, tr 58] 1.2.1.4. Phân loại nấm. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. Đồ án tốt nghiệp -6- SVTH: Nguyễn Văn Thân Ngành nấm chia làm 5 lớp: 1- Lớp cổ khuẩn: bao gồm các nấm nguyên thủy nhất, có cấu tạo hình sợi và sinh sản chủ yếu bằng động bào tử. 2- Lớp tảo khuẩn: Gồm nấm hạ đẳng có hình sợi đơn bào. Sinh sản hữu tính bằng noãn giao hay tiếp hợp. Dựa vào đặc tính ấy mà người ta chia thành hai lớp phụ: -Lớp phụ nang khuẩn: Sinh sản tiếp hợp bằng hai tế bào khác giới tính vì thế bào tử của chúng gọi là hợp tử. -Lớp phụ tiếp hợp khuẩn: Sinh sản hữu tính theo lối tiếp hợp, từ hai sợi nấm khác giới tính xích lại gần nhau và tạo thành hợp tử. Tiếp hợp tử này sau một thời gian nảy mầm sẽ tạo thành bào tử nang. Lớp phụ tiếp hợp khuẩn bao gồm nhiều họ. Họ Mucoracea là họ nấm mốc có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm. Họ này gồm hai giống: Mucor và Rhizopus. 3- Lớp nang khuẩn Ascomycetes -Bộ nguyên nang khuẩn: Quan trọng nhất là họ nấm men đường, họ nấm men phi đường. -Bộ cúc khuẩn Plectascales: Gồm các loại nấm mốc thuộc nấm đa bào. Sinh sản chủ yếu bằng đính bào tử, rất ít thấy trường hợp bằng nang bào tử. Những loài thuộc bộ này rất khác nhau về hình dáng, màu sắc, cấu tạo đính bào tử. Bộ cúc khuẩn phân bố trong tự nhiên, thường gặp trong đất, cây cối và thực phẩm. Trong bộ này ta chỉ xét họ Aspergillaceae. Các loại nấm mốc thuộc họ này có ứng dụng rất nhiều trong thực phẩm. Nỗi bật là hai gống Aspergillus và Penicillium. -Họ Aspergillaceae gồm: +Giống Aspergillus: là nấm mốc sinh sản vô tính bằng cách tạo thân quả hoặc cuống bào tử đính. Bào tử đính là tập hợp những khuẩn ty cao xuất phát từ một tế bào lớn. Các nang quả phình to ở bên trên, chổ phình to có dạng hình cầu, hình bầu dục, hình chùy được gọi là túi định. Từ túi định có vô vàng những mầm nhỏ gọi là thể bình mọc ra khắp mọi hướng, ở phần cuối của các mầm này là các bào tử đính. Cơ sở phân loài nấm mốc thuộc giống Aspergillus là đặc điểm cấu tạo, màu sắc của cuống bào tử đính. Ví dụ: Aspergillus niger có bào tử màu đen. Aspergillus oryzae có bào tử màu vàng hoa cau. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. Đồ án tốt nghiệp -7- SVTH: Nguyễn Văn Thân Aspergillus awamori có bào tử màu đen. Aspergillus flavus có bào tử màu xanh. Aspergillus usami có bào tử màu đen nâu. Giống Penicillim: Là nấm mốc có rất rộng rãi trong tự nhiên, gây hư hỏng nhiều quả chín, nhiều sản phẩm thực phẩm khác nhau. 4- Lớp đảm khuẩn. 5- Lớp nấm bất toàn. [7, tr 62]. 1.2.1.5. Giới thiệu chủng Aspergillus oryzae. Hình 1.1: Bào tử của Aspergillus oryzae. Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes (nang khuẩn). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang, chia sợi thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào). Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Asp. oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đặc điểm của giống Asp. oryzae giàu các enzym thủy phân nội bào và ngoại bào (amylaza, proteaaza, pectinaza,…), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo…đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn…Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng…Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. Đồ án tốt nghiệp -8- SVTH: Nguyễn Văn Thân 1.2.2. Enzym amylaza. Amylaza là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzym này thuộc nhóm enzym thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước. R.R’ + H - OH  RH + R’OH Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylaza (enzym nội bào) và exoamylaza (enzyme ngoại bào). Endoamylaza gồm có α-amylaza và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzym khử nhánh này được chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là Pullulanase (hay α-dextrin 6 - glucosidase); Khử gián tiếp là Transglucosylaza (hay oligo-1,6-glucosidaza) và maylo- 1,6-glucosidaza. Các enzym này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide. Exoamylaza gồm có β-amylaza và γ-amylaza. Đây là những enzym thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Cơ chất tác dụng của amylaza là tinh bột và glycogen. Hệ enzym amylaza là một trong số các hệ enzym được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực kinh tế quốc dân. Các enzym amylaza có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của con người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn. Bây giờ người ta thu chủ yếu từ canh trường vi khuẩn, nấm sợi và một số loại nấm men. [4, tr 317]. 1. Đặc tính của enzym α-amylaza. α-amylaza từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-amylaza có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylaza là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng 1/4 tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzym: - α-amylaza có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine. - Trọng lượng phân tử của α-amylaza nấm mốc: 45.000-50.000 Da (Knir 1956; Fisher, Stein, 1960). - Amylaza dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng. - Protein của các α-amylaza có tính acid yếu và có tính chất của globuline. - Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH = 4,2 - 5,7 (Bernfeld P, 1951). Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. Đồ án tốt nghiệp -9- SVTH: Nguyễn Văn Thân - α-amylaza là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylaza đều có chứa 1- 30 nguyên tử gam canxi/mol, nhưng không ít hơn 1- 6 nguyên tử gam/mol canxi tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzym, duy trì hoạt động của enzym (Modolova,1965). Do đó, canxi còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzym khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzym phân giải protein. Nếu phân tử α-amylaza bị loại bỏ hết canxi thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α-amylaza bền với nhiệt độ hơn các enzym khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng canxi trong phân tử và nồng độ Mg 2+ . Tất cả các amylaza đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu 2+ , Ag + , Hg 2+ . Một số kim loại như: Li + , Na + , Cr 3+ , Mn 2+ , Zn 2+ , Co 2+ , Sn 2+ , Cr 3+ , không có ảnh hưởng mấy đến α-amylaza. Hình 1.2: Sơ đồ tác dụng của enzym amylaza lên cơ chất tinh bột. Điều kiện hoạt động của α-amylaza từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylaza từ nấm sợi là 4,0 - 4,8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5- 5,8). Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylaza từ Asp. oryzae trong vùng 5,6 - 6,2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0 - 7,0. Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau. α-amylaza của Asp. oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylaza của malt và vi khuẩn Bac. subtilis. Ở pH = 3,6 và 0 0 C, α-amylaza của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút; α- amylaza vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-amylaza của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu (Fenilxova, Rmoshinoi 1989). Trong dung dịch α- amylaza nấm sợi bảo quản tốt ở pH = 5,0-5,5; α-amylaza dextrin hóa của nấm sợi đen Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. Đồ án tốt nghiệp -10- SVTH: Nguyễn Văn Thân có thể chịu được pH từ 2,5-2,8. Ở 0 o C và pH = 2,5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ. Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylaza từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylaza của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động của nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 50 0 C và bị vô hoạt ở 70 0 C (Kozmina, 1991). Trong dung dịch đệm pH = 4,7, α-amylaza của Asp. oryzae rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 40 0 C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 - 29%, hoạt lực đường hóa còn 27 - 85%. Ở 50 0 C trong 2 giờ, α-amylaza của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn (Miller và cộng sự).[4, tr 157]. 2. Cơ chế tác dụng của enzym α-amylaza. α-amylaza (1,4-α-glucan-glucanhydrolaza). α-amylaza từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylaza có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4- glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylaza không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm. Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylaza là quá trình đa giai đoạn. + Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amyloza và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh). + Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltoza không cho màu với iot. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylaza cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylaza, amyloza bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucoza (vì vậy, người ta cho rằng α-amylaza luôn phân cắt amyloza thành từng đoạn 6-7 gốc glucopiranose 1). + Sau đó, các polyglucoza này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetroza và maltotrioza và maltoza. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amyloza chứa 13% glucoza và 87% maltoza. Tác dụng của α-amylaza lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. [...]... phân đậu tương Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae -21- Đồ án tốt nghiệp Thân SVTH: Nguyễn Văn CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và môi trường Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Đồ án tốt nghiệp Thân... nuôi cấy và bảo quản gống để đưa vào nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp hai enzym proteaza và amylaza từ chủng Aspergillus oryzae 3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza 3.2.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng Để xem xét ảnh hưởng của nguồn cơ chất khác nhau lên khả năng tổng hợp enzym amylaza, proteaza của Aspergillus. .. hoạt lực enzym Hình 2.1 Quy trình nuôi nấm mốc Asp oryzae sinh tổng hợp enzym Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Đồ án tốt nghiệp - 27- SVTH: Nguyễn Văn Thân CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Như chúng ta đã biết sự sinh trưởng và phát triển cũng như sự sinh tổng hợp enzym của nấm mốc phụ thuộc vào nhiều yếu tố như:... vậy để cho nấm mốc sinh trưởng và phát triển tốt, sinh tổng hợp enzym có hoạt lực mạnh chúng ta cần chú ý đến các yếu tố này Với mục đích đó chúng tôi tiến hành thực nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym amylaza và proteaza của chủng nấm mốc Aspergillus oryzae để tìm điều kiện tối ưu cho sự tổng hợp enzym có hoạt lực mạnh nhất, đó là những yếu tố sau: Sự ảnh hưởng của... tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Đồ án tốt nghiệp -15SVTH: Nguyễn Văn Thân Ngoài những nguyên tố đa lượng này cần chú ý thêm với những nguyên tố vi lượng Chẳng hạn như: Coban, kẽm, và các nguyên tố gây ức chế sự tổng hợp enzym amylaza như: đồng, thủy ngân,…[4, tr 340] 1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza từ vi sinh vật Quá trình sinh. .. hợp cho quá trình sinh tổng hợp ở các vi sinh vật khác nhau là khác nhau Ngay cả đối với một vi sinh vật nhất định, sự hiếu khí cũng ảnh hưởng khác nhau Trong một số trường hợp, sự hiếu khí lại kiềm hãm mạnh sự sinh tổng hợp Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Đồ án tốt nghiệp -16SVTH: Nguyễn Văn Thân - Đối với nấm nốc,... tổng hợp enzym proteaza và amylaza Cơ chất Cám gạo Bột đậu tương Khô dầu Bột bắp Hoạt độ enzym (Hđ/g) 3 ngày amylaza proteaza 2.542 33.6 2.406 21 2.328 29.4 2.174 16.8 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Đồ án tốt nghiệp - 32- SVTH: Nguyễn Văn Thân Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của cơ chất đến sự sinh tổng hợp. .. 3.2, hình 3.5, 3.6, 3.7, 3.8 cho thấy chủng nấm mốc Asp oryzae tạo vòng thủy phân khi cho dung dịch Lugol vào môi trường chứa tinh bột và gelatin Như vậy cho thấy chủng nấm mốc Asp oryzae sau khi phân lập có tiết enzym proteaza và amylaza Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Đồ án tốt nghiệp - 31- SVTH: Nguyễn Văn Thân... cám gạo và bột ngô là môi trường thích hợp nhất cho sự sinh tổng hợp enzym amylaza và proteaza, vì có thành phần các chất dinh dưỡng cao nhất cho sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Môi trường cám gạo có tương đối đầy đủ các chất dinh dưỡng và khi làm ẩm sẽ tạo cấu trúc môi trường thuận lợi cho Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus. .. bảng 3.6 Bảng 3.6: Sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza Thời gian nuôi (giờ) 48 Hoạt độ enzym (Hđ/g) amylaza proteaza 2.174 12.6 60 2.261 29.4 72 2.514 48.3 84 2.498 48.3 96 2.393 42 108 2.289 37.8 120 2.236 33.6 134 2.047 21 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae  . Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp hai enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae . Sở dĩ tôi chọn chủng Aspergillus oryzae này là do ở chủng nấm mốc. chấm) đến công nghệ sản xuất bia, phomat [5, tr 201]. 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym amylaza và proteaza. 1.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym. α- amylaza nấm sợi bảo quản tốt ở pH = 5,0-5,5; α -amylaza dextrin hóa của nấm sợi đen Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus