Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae

LỜI MỞ ĐẦU

Trong vài thập kỹ trở lại đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinhhọc, các chế phẩm enzym được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hếttrong các lĩnh vực kinh tế Enzym đã từng bước làm thay đổi và nâng cao một số cácquá trình công nghệ trong chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế đáp ứngnhu cầu ngày càng tăng của xã hội

Trong công nghiệp thực phẩm các chế phẩm enzym được sử dụng với nhiều mụcđích và tác động với nhiều mức độ khác nhau Enzym có thể tham gia cải thiện hoặctiêu chuẩn hóa các quá trình chuyển hóa, từ đó cho phép nhận các sản phẩm mới haycác sản phẩm có chất lượng cao hơn Đặc biệt enzym cũng có thể can thiệp chính vàoquá trình chế biến và đóng vai trò công cụ công nghệ

Hàng năm lượng enzym được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấnvới giá trị trên 500 triệu USD được phân bố trong các lĩnh vực khác nhau

Ngành công nghệ enzym trên thế giới phát triển khá mạnh, đặc biệt là ở các nướcChâu Âu, ở Châu Á có nước Nhật Bản với các chế phẩm enzym khá đa dạng chiếmkhoảng 12-15% thị trường thế giới Việt Nam ngành công nghiệp sản xuất enzym pháttriển chưa mạnh lắm Do vậy, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm enzym là một hướng

đi đầy triển vọng cho ngành công nghiệp sản xuất enzym ở nước ta

Thông thường sản xuất chế phẩm enzym đi từ ba nguồn: động vật, thực vật, và visinh vật Đối với nguồn enzym từ động vật và thực vật ở cuối thế kỷ 19 và 20, người tathường chỉ khai thác những gì có sẵn trong thiên nhiên, chưa đưa ra một quy trìnhcông nghệ theo mô hình công nghiệp hoàn chỉnh Và còn nhiều yếu tố rủi ro, khó khăn

về trang thiết bị

Ngày nay ngành công nghiệp sản xuất enzym từ vi sinh vật rất phát triển Cácproteaza là enzym được sử dụng nhiều nhất hiện nay, tiếp đến là các enzym amylaza,glucoizomeraza, cellulaza, pectinaza Trong vi sinh vật, để sản xuất enzym proteaza

và amylaza thì vi khuẩn và nấm mốc là hay dùng nhất Tuy nhiên ở nấm mốc thì trongcùng điều kiện có thể tổng hợp nhiều enzym cùng một lúc và enzym tạo thành được sửdụng với nhiều mục đích khác nhau

Xuất phát từ tầm quan trọng đó của chế phẩm enzym và được sự hướng dẫn của

cô giáo Th.S Phan Thị Bích Ngọc tôi chọn đề tài: “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến

quá trình sinh tổng hợp hai enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae” Sở dĩ tôi chọn chủng Aspergillus oryzae này là do ở chủng nấm mốc này khả

năng sinh tổng hợp hai enzym amylaza và proteaza đều rất mạnh Hơn nữa enzymproteaza và amylza từ nấm mốc được sử dụng rất nhiều vào ngành công nghiệp thực

phẩm Và trong dân gian đã dùng nấm mốc Aspergillus oryzae để sản xuất nước chấm.

Và ngày nay một số công trình nghiên cứu đang hoàn thiện công nghệ lên men nướcchấm nhờ enzym của nấm mốc Đề tài nghiên cứu của tôi được tiến hành theo hướngsau:

1 Tiến hành phân lập lại chủng nấm mốc Aspergillus oryzae từ Viện Công

Nghiệp Thực Phẩm Hồ Chí Minh

2 Khảo sát khả năng sinh hai enzym proteaza và amylaza của chủng nấm mốc

Aspergillus oryzae.

3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và

amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.

Do thời gian làm đề tài có hạn và sự hiểu biết về enzym còn hạn chế Cho nên đềtài không thể tránh khỏi những thiếu sót, vướng mắc Tôi rất mong được sự góp ý rấtchân thành của các thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn chỉnh hơn

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về vi sinh vật sinh tổng hợp enzym

Người ta thường khai thác enzym amylaza, bromelin, papain từ thực vật, pepsin,chimotripsin, renin từ động vật Đặc điểm rất dễ nhận thấy ở giới thực vật hay giớiđộng vật là mỗi loài chỉ có thể cho ta một loại enzym nào đó, ví dụ như malt choenzym amylaza, dứa cho enzym bromelin, đu đủ cho enzym papain

Riêng thế giới vi sinh vật cho ta tất cả các enzym đã được biết còn lại Vi sinh vật

là giới sinh vật được xem như nhiều nhất và có khả năng chuyển hóa vật chất trongthiên nhiên mạnh nhất Hiện nay người ta khai thác enzym nhiều từ vi sinh vật và đượcứng dụng rất nhiều trong đời sống, sản xuất

So với nguồn enzym khai thác từ động vật và thực vật, nguồn enzym từ vi sinhvật có những ưu điểm quan trọng sau đây:

1- Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh Do dó chỉ trong một thời gian ngắn

ta có thể thu được một lượng enzym rất lớn

2- Enzym từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao, có khả năng chuyển hóa một khốilượng vật chất rất lớn Người ta đã làm thí nghiệm và cho biết rằng chúng có khả năngchuyển hóa một khối lượng vật chất lớn hơn 30-40 lần khối lượng của tế bào vi sinhvật tạo ra chúng

3- Nguyên liệu dùng để sản xuất enzym rẻ tiền và dễ kiếm

4- Nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào thời tiết, điều kiện địa lý như nuôi,trồng động vật và thực vật

5- Hoàn toàn có thể sản xuất theo quy mô công nghiệp và hoàn toàn kiểm soátđược quá trình sản xuất [5, tr 197]

1.1.1 Vi sinh vật tham gia tổng hợp enzym amylaza.

Các nhà khoa học cho biết enzym amylaza được vi khuẩn và nấm sợi tổng hợpnhiều nhất Ở các loài vi sinh vật khác khả năng này yếu hơn

Các loại enzym amylaza thường gặp khi nuôi cấy vi sinh vật gồm: amylaza, amylaza, glucoamylaza Hệ enzym amylaza là một trong những hệ enzym được nghiêncứu sớm nhất và có nhiều công trình nghiên cứu được công bố nhất

-Các giống được sử dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất enzym amylaza bao

gồm: Aspergillus oryzae, Asp usami, Asp awamori, Asp batatae;

1.1.2 Vi sinh vật tham gia tổng hợp enzym proteaza.

Proteaza là một loại enzym tham gia phân giải protein để tạo thành các peptitngắn và cuối cùng tạo thành các axit amin và NH3

Enzym proteaza đầu tiên được nghiên cứu không phải là các proteaza của vi sinhvật mà là các proteaza của động vật (chủ yếu là proteaza trong bộ tiêu hóa của độngvật)

Từ những năm 1950 sau khi hoàn thiện những phương pháp tinh sạch protein,người ta đã thu nhận được những chế phẩm proteaza tinh khiết hơn Cũng từ đây cácnhà khoa học cũng bắt đầu những nghiên cứu proteaza của vi sinh vật Tuy nhiên trước

đó vào năm 1918 - 1919, Wakman đã phát hiện khả năng phân giải protein của xạkhuẩn Từ đó đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu được công bố theo chiều hướng này.Ngày nay các loại enzym proteaza từ vi sinh vật được sản xuất rất nhiều và được

sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, y học và nông nghiệp

Ưu điểm lớn nhất của proteaza từ vi sinh vật là chúng rất phong phú về chủngloại [5, tr 201]

1.2 Nấm mốc và enzym.

1.2.1 Nấm mốc.

1.2.1.1 Đặc điểm chung của nấm mốc.

Nấm mốc là tên chung để chỉ các nhóm nấm không phải là nấm men cũng khôngphải là các nấm lớn có quả thể Đây là nhóm vi sinh vật có cấu tạo dạng sợi có lông tơ,sợi bông, tạo khuẩn ty ở dạng bột Màu sắc của nấm mốc được xác định bởi các bào

tử do nó sinh ra như màu xanh, vàng, trắng, đen, nâu

Trong thực phẩm nấm mốc xuất hiện trên bề mặt nước chấm, bánh mỳ để lâungày Mặt khác nấm mốc có thể tham gia vào nhiều quá trình có lợi khác như là tácnhân quan trọng của quá trình sản xuất nước chấm, tương, chao, đường, axit hữu cơ.Nấm mốc hô hấp hiếu khí bắt buộc, có thể phát triển trên một số môi trường mà nấmmen và vi khuẩn không thể phát triển được như ở môi trường có áp suất thẩm thấu, độ

ẩm và độ axit lớn [7, tr 57]

1.2.1.2 Cấu tạo của nấm mốc.

Nấm mốc có dạng hình sợi phân nhánh hoặc không phân nhánh, có cấu tạo đơnbào hoặc đa bào Sợi nấm có kích thước bề dày đường kính từ 1- 10 m hoặc 20 m,chiều dài có thể lên đến vài chục cm Khi nấm mốc phát triển sẽ tạo thành hệ sợi nấmphát triển trên bề mặt môi trường thì gọi là khuẩn ty ký sinh và ăn sâu vào môi trườngthì gọi là khuẩn ty dinh dưỡng hay khuẩn ty cơ chất Đến giai đoạn trưởng thành từ cáckhuẩn ty ký sinh sẽ hình thành các cơ quan sinh sản gọi là bào tử Một số loại nấm

mốc đơn bào, bậc thấp như lớp Phycomycetes trong đó điển hình là Mucor, Rhizopus,

khuẩn ty thường không có vách ngăn, toàn bộ khuẩn ty được coi là một tế bào phânnhánh, đa nhân Còn các khuẩn ty có vách ngăn thì tạo nên cơ thể đa bào như

tử dày, sinh sản bằng bào tử trứng, sinh sản bằng bào tử chồi

+ Sinh sản bằng bào tử nội sinh

+ Sinh sản bằng bào tử đỉnh

Sinh sản hữu tính gồm các hình thức sau:

Sinh sản bằng bào tử tiếp hợp, sinh sản bằng bào tử noãn hay bào tử trứng, sinhsản bằng bào tử túi.[7, tr 58]

Mucoracea là họ nấm mốc có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm Họ này gồm hai giống: Mucor và Rhizopus.

3- Lớp nang khuẩn Ascomycetes

-Bộ nguyên nang khuẩn: Quan trọng nhất là họ nấm men đường, họ nấm menphi đường

-Bộ cúc khuẩn Plectascales: Gồm các loại nấm mốc thuộc nấm đa bào Sinh sảnchủ yếu bằng đính bào tử, rất ít thấy trường hợp bằng nang bào tử Những loài thuộc

bộ này rất khác nhau về hình dáng, màu sắc, cấu tạo đính bào tử Bộ cúc khuẩn phân

bố trong tự nhiên, thường gặp trong đất, cây cối và thực phẩm Trong bộ này ta chỉ xét

họ Aspergillaceae Các loại nấm mốc thuộc họ này có ứng dụng rất nhiều trong thực phẩm Nỗi bật là hai gống Aspergillus và Penicillium.

-Họ Aspergillaceae gồm:

+Giống Aspergillus: là nấm mốc sinh sản vô tính bằng cách tạo thân quả

hoặc cuống bào tử đính Bào tử đính là tập hợp những khuẩn ty cao xuất phát từ một tếbào lớn Các nang quả phình to ở bên trên, chổ phình to có dạng hình cầu, hình bầudục, hình chùy được gọi là túi định Từ túi định có vô vàng những mầm nhỏ gọi là thểbình mọc ra khắp mọi hướng, ở phần cuối của các mầm này là các bào tử đính Cơ sở

phân loài nấm mốc thuộc giống Aspergillus là đặc điểm cấu tạo, màu sắc của cuống

bào tử đính

Ví dụ: Aspergillus niger có bào tử màu đen.

Aspergillus oryzae có bào tử màu vàng hoa cau.

Aspergillus awamori có bào tử màu đen.

Aspergillus flavus có bào tử màu xanh.

Aspergillus usami có bào tử màu đen nâu.

Giống Penicillim: Là nấm mốc có rất rộng rãi trong tự nhiên, gây hư hỏng nhiều

quả chín, nhiều sản phẩm thực phẩm khác nhau

4- Lớp đảm khuẩn

5- Lớp nấm bất toàn [7, tr 62].

1.2.1.5 Giới thiệu chủng Aspergillus oryzae.

Hình 1.1: Bào tử của Aspergillus oryzae.

Asp oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes (nang

khuẩn) Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiềungang 5-7µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang, chia sợi thành nhiều bao tế bào(nấm đa bào) Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thẳng gọi là

cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính Cuống đính bào tử của Asp oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường Phía đầu cuống đính

bào tử phồng lên gọi là bọng Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn,dài, gọi là những tế bào hình chai Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào

tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử Đặc điểm của giống Asp oryzae giàu các

enzym thủy phân nội bào và ngoại bào (amylaza, proteaaza, pectinaza,…), ta rất haygặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo…đã hết nhưng

không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn…Chúng mọc và pháttriển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng…Màu do các bào tử già có màu sắc.Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽmọc thành mốc mới.

1.2.2 Enzym amylaza.

Amylaza là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các enzym nàythuộc nhóm enzym thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhómpolysaccharide với sự tham gia của nước

Exoamylaza gồm có β-amylaza và γ-amylaza Đây là những enzym thủy phântinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

Cơ chất tác dụng của amylaza là tinh bột và glycogen

Hệ enzym amylaza là một trong số các hệ enzym được sử dụng rộng rãi nhấttrong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực kinh tế quốc dân Các enzym amylaza cótrong nước bọt, dịch tiêu hóa của con người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi,

xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn Bây giờ người ta thu chủ yếu từ canh trường vikhuẩn, nấm sợi và một số loại nấm men [4, tr 317]

1 Đặc tính của enzym α-amylaza

α-amylaza từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗiloại α-amylaza có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α-amylaza là một protein giàutyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic Các glutamic acid và aspartic acidchiếm khoảng 1/4 tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzym:

- α-amylaza có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine

- Trọng lượng phân tử của α-amylaza nấm mốc: 45.000-50.000 Da (Knir 1956;Fisher, Stein, 1960).

- Amylaza dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng

- Protein của các α-amylaza có tính acid yếu và có tính chất của globuline

- Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH = 4,2 - 5,7 (Bernfeld P, 1951)

- α-amylaza là một metaloenzyme Mỗi phân tử α-amylaza đều có chứa 1- 30nguyên tử gam canxi/mol, nhưng không ít hơn 1- 6 nguyên tử gam/mol canxi tham giavào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzym, duy trì hoạt động của enzym(Modolova,1965) Do đó, canxi còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzym khi bị tácđộng bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzym phân giải protein Nếuphân tử α-amylaza bị loại bỏ hết canxi thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủyphân cơ chất α-amylaza bền với nhiệt độ hơn các enzym khác Đặc tính này có lẽ liênquan đến hàm lượng canxi trong phân tử và nồng độ Mg2+ Tất cả các amylaza đều bịkiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+ Một số kim loại như: Li+, Na+,

Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, không có ảnh hưởng mấy đến α-amylaza

Hình 1.2: Sơ đồ tác dụng của enzym amylaza lên cơ chất tinh bột.

Điều kiện hoạt động của α-amylaza từ các nguồn khác nhau thường khônggiống nhau pH tối thích cho hoạt động của α-amylaza từ nấm sợi là 4,0 - 4,8 (có thểhoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5- 5,8) Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho

hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylaza từ Asp oryzae trong vùng

5,6 - 6,2 Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của

nó là 6,0 - 7,0

Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau α-amylaza của Asp oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylaza của malt và vi khuẩn Bac subtilis.

Ở pH = 3,6 và 00C, amylaza của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút; amylaza vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-amylaza của nấmsợi hình như không giảm bao nhiêu (Fenilxova, Rmoshinoi 1989) Trong dung dịch α-amylaza nấm sợi bảo quản tốt ở pH = 5,0-5,5; α-amylaza dextrin hóa của nấm sợi đen

α-có thể chịu được pH từ 2,5-2,8 Ở 0oC và pH = 2,5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1giờ

Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylaza từ các nguồn khác nhaucũng không đồng nhất, α-amylaza của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động củanhiệt Nhiệt độ tối thích của nó là 500C và bị vô hoạt ở 700C (Kozmina, 1991)

Trong dung dịch đệm pH = 4,7, α-amylaza của Asp oryzae rất nhạy với tác

động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 400C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn

22 - 29%, hoạt lực đường hóa còn 27 - 85% Ở 500C trong 2 giờ, α-amylaza của nấmsợi này bị vô hoạt hoàn toàn (Miller và cộng sự).[4, tr 157]

2 Cơ chế tác dụng của enzym α-amylaza

α-amylaza (1,4-α-glucan-glucanhydrolaza) α-amylaza từ các nguồn khác nhau

có nhiều điềm rất giống nhau α-amylaza có khả năng phân cắt các liên kết glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cáchngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả α-amylaza không chỉ thủy phân hồ tinh bột

α-1,4-mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylaza là quá trình đa giai đoạn

+ Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủyphân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bộtgiảm nhanh (các amyloza và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh)

+ Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bịthủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltoza không cho màu với iot Các chất này bịthủy phân rất chậm bởi α-amylaza cho tới disaccharide và monosaccharide Dưới tácdụng của α-amylaza, amyloza bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7gốc glucoza (vì vậy, người ta cho rằng α-amylaza luôn phân cắt amyloza thành từngđoạn 6-7 gốc glucopiranose 1)

+ Sau đó, các polyglucoza này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạchpolyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetroza và maltotrioza

và maltoza Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amyloza chứa13% glucoza và 87% maltoza Tác dụng của α-amylaza lên amylopectin cũng xảy ratương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánhtrong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoàicác đường nói trên (72% maltoza và 19% glucoza) còn có dextrin phân tử thấp vàisomaltoza 8%

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylaza, tinh bột có thể chuyển thànhmaltotetroza, maltoza, glucoza và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-amylaza chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màuvới iot và một ít maltoza Khả năng dextrin hóa cao của α-amylaza là tính chất đặctrưng của nó Vì vậy, người ta thường gọi loại α-amylaza này là α-amylaza dextrin hóahay α-amylaza dịch hóa

Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylaza:

+ Giai đoạn dextrin hóa:

Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp

+ Giai đoạn đường hóa:

Dextrin tetra và trimaltoza di & monosaccharide

Amyloza oligosacharide poliglucoza

Maltoza maltotrioza maltotetroza.[3, tr 321].Phức hệ enzym amylaza từ các nguồn khác nhau đều có đặc điểm riêng Đối với

nấm sợi Aspergillus, trong canh trường của chúng có các enzym sau: α-amylaza, glucoamylaza, glucoziltransferaza Đa số các chủng của loài Asp oryzae tạo nhiều α- amylaza song tạo ít glucoziltransferaza, ngoài amylaza canh trường bề mặt của Asp oryzae còn proteaza axit và trung tính (Oresenko 1963).[4, tr 320].

Ngày nay các loại enzym proteaza từ vi sinh vật được sản xuất rất nhiều và được

sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, y học và nông nghiệp

Ưu điểm lớn nhất của enzym proteaza từ vi sinh vật là chúng rất phong phú vềchủng loại Năm 1960, Hartley chia proteaza ra bốn nhóm dựa trên thành phần cấu tạocủa trung tâm hoạt động trong enzym này

-Proteaza nhóm 1: Nhóm này bao gồm các loại proteaza có serin trong trungtâm hoạt động (bao gồm các loại enzym tripsin; kimotripsin; eslastase; subtilizi; cácenzym xúc tác làm đông máu; acrozin)

-Proteaza nhóm 2: Bao gồm các proteaza có nhóm SH trong trung tâm hoạtđộng (bao gồm bromelin, papain, fixin)

-Proteaza nhóm 3: Bao gồm các proteaza có kim loại trong trung tâm hoạt động

và trực tiếp tham gia các quá trình xúc tác (bao gồm các proteza trung tính của

Bacillus hoặc colagenase).

-Proteaza nhóm 4: Bao gồm các proteaza có nhóm α-cacboxil trong trung tâmhoạt động Nhóm này gồm pepsin, renin, proteaza axit của vi sinh vật

Như vậy tùy theo từng vùng hoạt động pH của enzym proteaza mà các proteazatồn tại ở dạng proteaza axit, proteaza trung tính, proteaza kiềm

Khác với thực vật và động vật vi sinh vật vừa rất giàu proteaza, vừa có nhiều loạiproteaza Ngoài ra đối với sinh lý vi sinh vật, proteaza đóng vai trò rất quan trọng Đốivới thực tiễn sản xuất và đời sống, proteaza được ứng dụng rất rộng rãi, từ công nghệthực phẩm đến công nghệ làm sạch môi trường, từ công nghệ làm sạch da thú đến cácloại tẩy rửa, từ công nghệ lên men truyền thống (làm tương chao, nước mắm, nướcchấm) đến công nghệ sản xuất bia, phomat [5, tr 201]

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym amylaza và proteaza.

1.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym amylaza 1.3.1.1 Ảnh hưởng các nguồn nitơ dinh dưỡng.

Nguồn dinh dưỡng nitơ hết sức quan trọng Khi chuẩn bị môi trường dinh

dưỡng để nuôi nấm mốc Asp oryzae để tạo enzym α-amylaza, người ta dùng muối vô

cơ Natri nitrat là nguồn nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi tạo α-amylaza

Hàm lượng thường sử dụng là 0,91% Nari nitrat và Amoni nitrat có hiệu quả hơn sovới các loại muối khác (Kali nitrat, Magie nitrat, Amoni sunfat…) Cho nguồn nitơnhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylaza này và ức chế tổng hợpamylaza khác.Ví dụ: Kết quả thí nghiệm Fenikvova và cộng tác viên về việc sử dụngcác nguồn nitơ từ những muối khác nhau.

Bảng 1.3: Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp các enzym [4].

Nguồn Nitơ

Liều lượng muối, % theo N

Hoạt động enzyme sau 6 ngày nuôi đối với 100ml.

Ngoài ra cũng cần phải xác định tỷ lệ giữa nguồn cacbon và nitơ trong môi

trường phù hợp cho mốc Asp oryzae phát triển Tính cân bằng của môi trường dinh

dưỡng về cacbon và nitơ có ý nghĩa lớn đối với sự sinh tổng hợp sinh khối của nấm

Asp oryzae và sự tạo thành amylaza.

1.3.1.2 Ảnh hưởng của Amino acid.

Amino acid là những cấu tử hợp thành phân tử enzym, trong đó có một số cácamino acid không đồng nhất về giá trị dinh dưỡng nên sử dụng hỗn hợp amino acid sẽ

có giá trị lớn hơn cho những chất lượng mới

Amino acid có ảnh hưởng tốt tới sinh lý của nấm mốc cũng như việc sinh tổnghợp enzym amylaza do những nguyên nhân sau:

-Amino acid có thể đồng thời vừa là nguồn carbon, nguồn nitơ vừa là nguồnnăng lượng

-Một số amino acid riêng lẻ (Glutamic acid, Aspatic acid….) đóng vai trò vôcùng quan trọng trong trao đổi amino acid cụ thể là sinh tổng hợp nhiều amino acidkhác trong quá trình chuyển amin hóa

Nhờ một số amino acid trước hết là glutamic acid, aspatic acid mà thực hiệnđồng hóa dị dưỡng CO2 (Araiet al,1968).

-Nhiều amino acid tham gia vào thành phần của các vitamin tan trong nướcnhư: Pantotenic acid, biotin, folic acid, …Các vitamin này có ý nghĩa sinh học rất lớn.Ngoài ra còn có những nhận xét cho rằng sự tổng hợp ARN trong tế bào một số vi sinhvật phụ thuộc vào sự có mặt của amino acid trong môi trường nuôi (Kurland, Marloe,1962)

-Amino acid có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kiềm chế sinh tổng hợpenzym Một số amino acid kích thích và làm tăng cường sinh tổng hợp các enzymamylaza, một số lại có tác dụng ức chế ngược lại và một số khác thì không có ảnhhưởng gì cả

1.3.1.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng.

Các yếu tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp

các enzym, α-amylaza ở nấm mốc Asp oryzae.

-Mg2+ có ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của enzym Thiếu MgSO4 sẽ có ảnh hưởngxấu đến sự tổng hợp mọi amylaza bởi nấm sợi Khi đó sự tổng hợp α-amylaza bị ứcchế hoàn toàn (Fenikxova, Muxaeva, 1967) Nồng độ tối ưu của muối này cho tổnghợp α-amylaza là 0,05%

-Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất (nucleicphospholipide acid) và nhiều coenzym, đồng thời để phosphoril hóa glucide trong quátrình oxy hóa sinh học Phospho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh sản của nấm sợi, do vậy

mà tăng cường tổng hợp enzym Các muối phosphate thường được dùng với nồng độcao tới 0.15M Hoạt độ của α-amylaza tăng cao khi có 0,1% KH2PO4

-Canxi cần cho tổng hợp và ổn định α-amylaza hoạt động vì nó là cấu tử khôngthể thiếu được của enzym này Canxi còn có tác dụng bảo vệ amylaza khỏi tác độngcủa proteaza (Hsiu et amiloza, 1964) Muốn tích lũy nhiều α-amylaza cấn có lượngCanxi trong môi trường là 0,01-0,05%

-Lưu huỳnh kích thích sự tạo amylaza (S có trong thành phần của các aminoacid quan trọng: Methionine, cystein, cystine) Lưu huỳnh với hàm lượng 0.04g/ml

môi trường là thích hợp nhất cho Asp oryzae tạo amylaza.

Ngoài những nguyên tố đa lượng này cần chú ý thêm với những nguyên tố vilượng Chẳng hạn như: Coban, kẽm,…và các nguyên tố gây ức chế sự tổng hợp enzymamylaza như: đồng, thủy ngân,…[4, tr 340].

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza từ

- Ảnh hưởng của pH môi trường: Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pHmôi trường ít ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym ở vi sinh vật Hơn nữa pHmôi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật, với cácnấm mốc pHopt = 6 - 6,5, với vi khuẩn thì pHopt = 6,6 - 7,4

Khi ta dùng phương pháp bề sâu thì pH có ảnh hưởng rất lớn, nhiều khi có vai tròquyết định đối với sự tích lũy proteaza trong môi trường pH môi trường có thể thayđổi sau khi khử trùng và trong quá trình phát triển của vi sinh vật pH ban đầu của môitrường thích hợp cho nấm mốc là pH = 3,8 - 5,6

- Độ thông khí: Đây cũng là một yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổnghợp proteaza Tuy nhiên ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo vi sinh vật Trong một

số trường hợp, thiếu oxy tuy có kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại làmtăng quá trình sinh tổng hợp proteaza Lượng oxy thích hợp cho quá trình sinh tổnghợp ở các vi sinh vật khác nhau là khác nhau Ngay cả đối với một vi sinh vật nhấtđịnh, sự hiếu khí cũng ảnh hưởng khác nhau Trong một số trường hợp, sự hiếu khí lạikiềm hãm mạnh sự sinh tổng hợp

- Đối với nấm nốc, chế độ sục khí thích hợp 10-12 m3 không khí vô trùng (cónhiệt độ không cao quá 400C) trên 1m3 môi trường trong 1h với thời gian nuôi 68 -73h Với thời gian nuôi ngắn hơn trong các thùng lên men giống (48h) và trong cácthùng lên men sản xuất (48-52h) thì lượng không khí cần sục vào môi trường để nuôi

Asp oryzae phải là 30m3/m3 môi trường/giờ đối với thùng nhân giống và 40m3/m3 môitrường/giờ cho thùng sản xuất

- Ảnh hưởng của thành phần môi trường:

Thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzym

Để tăng lượng enzym trong môi trường cần lựa chọn nguồn cacbon, nitơ, muối khoángthích hợp giữa các thành phần này và đặc biệt là cần sử dụng chất cảm ứng Đối vớimột vi sinh vật nhất định, điều kiện cho quá trình tổng hợp các enzym khác nhaukhông giống nhau Nắm vững các quy luật ảnh hưởng của các yếu tố này có thể điềukhiển vi sinh vật tổng hợp định hướng một enzym xác định

-Ảnh hưởng của nguồn cacbon: Có nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác

là nguồn cacbon thích hợp đối với nấm mốc sinh ra enzym proteaza có hoạt lực cao.Nguồn cacbon thích hợp đối với nấm mốc là: Glucoza, fructoza, maltoza và kém nhất

là lactoza, galactoza Tinh bột cũng là nguồn cabon tốt cho nấm mốc để sinh tổng hợpproteaza nhưng hiệu quả này cũng phụ thuộc vào chủng mốc có hoạt lực amylaza đểthủy phân sâu xa tinh bột

-Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Nguồn nitơ hữu cơ thường có ảnh hưởng tốt đến quátrình sinh tổng hợp proteaza vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này.Các nguồn nitơ thường dùng là: Các loại bột khác nhau (có gluten, nước chiết của

cám, nấm men đã tự phân giải, pepton, protein v.v đối với các loài Aspergillus (Asp oryzae, Asp awamori, Asp niger, Asp flavus) dạng hữu cơ là thành phần quan trọng

nhất của môi trường đối với quá trình sinh tổng hợp proteaza acid Khi thay NaNO3

trong môi trường Czapek bằng casein sẽ làm tăng đáng kể lượng proteaza acid trongmôi trường nuôi cấy Protein và pepton là nguồn dinh dưỡng nitơ tốt nhất đối với loài

Aspergillus nói trên Theo một số tác giả khi sử dụng phối hợp nguồn nitơ hữu cơ và

vô cơ sẽ làm tăng đáng kể quá trình tổng hợp proteaza Ví dụ khi thêm vào HNO3 hoặc

NH4 với lượng 0,6-3,8% vào môi trường có chứa nguồn nitơ hữu cơ có thể làm tăng

140-190% proteaza acid trong môi trường nuôi cấy của nhiều loài thuộc Aspergillus.

Ngoài việc chọn nguồn và lượng cacbon và nitơ thích hợp cần phải chọn tỷ lệthích hợp Có như vậy mới đảm bảo cho việc sinh proteaza là lớn nhất Theo Iulius

(1969), tỷ lệ C : N thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp proteaza ở Asp oryzae là 8:1

đến 2:1

Ngoài ra còn có các nguyên tố vi lượng, NaCl, vitamin và các yếu tố khác nữacũng ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp.[10, tr 428]

1.4 Công nghệ sản xuất enzym từ vi sinh vật, và ứng dụng.

Phần lớn các loại enzym là protein hòa tan Các enzym được sản xuất theo quy

mô công nghiệp là những enzym hòa tan Khái niệm ‘‘enzym hòa tan” cũng khônghoàn toàn chính xác vì trong nhiều trường hợp enzym hoàn toàn không hòa tan, ví dụnhư khi enzym còn trong tế bào vi sinh vật thì chúng ở trạng thái không hòa tan Kháiniệm này dùng để phân biệt loại enzym không hòa tan được tạo ra từ enzym loại hòatan này

Trong công nghiệp sản xuất enzym, trên thế giới đang tiến hành hai phương phápnuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm [4, tr 216]

1.4.1 Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt.

Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật đã đượcnghiên cứu và phát triển mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX Sau đóphương pháp nuôi cấy chìm được thay thế vào những năm 56-60 của thế kỷ trước.Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triểntrên bề mặt môi trường, phương pháp này lại được phục hồi rất mạnh vào những năm

1970 cho đến nay

*Ưu điểm cơ bản của phương pháp nuôi cấy bề mặt:

- Nuôi cấy bề mặt dễ thực hiện Quy trình công nghệ thường không phức tạp

- Lượng enzym được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều sovới nuôi cấy chìm

Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng, giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy

bề mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại

- Chế phẩm enzym thô (bao gồm thành phần môi trường sinh khối vi sinh vật,enzym và nước) sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản

- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vậnhành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém.

- Trong trường hợp bị nhiễm các vi sinh vật lạ, ta rất dễ dàng xử lý

Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bịnhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy Những khu vực khác

sẽ hoàn toàn được an toàn

*Phương pháp nuôi cấy bề mặt cũng có những nhược điểm cần quan tâm để khắcphục và hoàn thiện dần phương pháp này

- Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận thấy nhất đó là: Phương pháp này tốn khá lớndiện tích cho nuôi cấy Trong phương pháp này vi sinh vật phát triển trên bề mặt môitrường nên rất cần nhiều diện tích Trong những năm gần đây, người ta đã cải tiến cácthiết bị để vi sinh vật có thể phát triển ở 4 mặt (nơi tiếp xúc giữa môi trường và khôngkhí) Những thiết bị này được thiết kế như một hình hộp đứng có kích thước trung bìnhnhư sau:

Chiều cao 1,2m - 1,4m; Chiều ngang 0,8m - 1m; Chiều dày 0,1m - 0,2m

Môi trường sau khi thanh trùng được trộn giống vi sinh vật và cho vào những hộpnày Cả bốn phía mặt ngoài của bốn hộp này phải có độ thoáng khí nhất định, nhờ đógiống vi sinh vật, nhất là nấm sợi, sẽ phát triển rất mạnh ở bốn phía của hộp Bằngcách cải tiến này, vi sinh vật phát triển rất mạnh và ta đã tiết kiệm được ít nhất 1/2 diệntích nuôi cấy

Tuy nhiên phương pháp này khó cơ giới hóa, tự động hóa.[5, tr 217]

1.4.2 Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề sâu (nuôi cấy chìm).

Phương pháp nuôi cấy chìm để thu nhận emzym là phương pháp ở đó vi sinh vậtphát triển hẳn trong lòng môi trường Chính vì thế trong môi trường nuôi cấy chìmngười ta thường sử dụng môi trường lỏng

Phương pháp này có những ưu điểm cơ bản sau:

-Phương pháp nuôi cấy chìm tốn ít diện tích Trong quá trình nuôi cấy thườngđược thực hiện trong các thiết bị lên men rất gọn

-Phương pháp nuôi cấy chìm có thể tự động hóa và cơ giới hóa ở mức độ cao.Trong nuôi cấy chìm thường phải thiết lập hệ thống cánh khuấy và hệ thống thổi khí.Kiểm soát quá trình thổi khí bằng hệ thống tự động hoàn toàn có thể thực hiện được

với bất kỳ dung tích nào của thiết bị lên men Ngoài ra, ta còn có thể kiểm soát đượcnhiệt độ và điều hòa sự thay đổi nhiệt độ bằng hệ thống điều khiển tự động.

-Phương pháp nuôi cấy chìm có thể thực hiện liên tục bằng nhiều thiết bị lên mennối tiếp nhau Do đó việc kiểm soát chất lượng lên men rất dễ dàng

*Tuy nhiên phương pháp này cũng có những nhược điểm cần khắc phục:

-Hoạt tính enzym trong nuôi cấy chìm thường thấp hơn hoạt tính enzym trongnuôi cấy bề mặt

-Trong nuôi cấy chìm, sự nhiễm các vi sinh vật lạ nếu xảy ra sẽ gây ra sự nhiễmtoàn bộ hệ thống trong một thời gian rất ngắn Dung dịch lên men trong thiết bị lênmen luôn luôn trong trạng thái động nhờ hoạt động của cánh khuấy và hệ thống thổikhí Do đó chỉ cần một điểm nào đó của môi trường bị nhiễm ngay lập tức toàn bộ hệthống bị nhiễm, khi đó ta rất khó kiểm soát và giải quyết những hậu quả do sự nhiễm

vi sinh vật lạ gây nên

-Phương pháp nuôi cấy chìm thường đòi hỏi chi phí rất lớn Những chi phí nàychủ yếu bao gồm: Chi phí cho hệ thống lên men, cánh khuấy [5, tr 227]

1.5.Tình hình sản xuất và ứng dụng chế phẩm enzym proteaza và amylaza

trong nước và trên thế giới.

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinhhọc, các chế phẩm enzym được sản xuất càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong cáclĩnh vực kinh tế Enzym đã từng bước làm thay đổi và nâng cao một số các quá trìnhcông nghệ trong chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế đáp ứng nhu cầungày càng tăng của xã hội Hàng năm lượng enzym được sản xuất ra trên thế giới đạtkhoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD được phân bổ trong các lĩnhvực khác nhau

Hiện nay trên thị trường có khoảng 12 hãng sản xuất enzym chính Châu Âu vớihai hãng sản xuất lớn nhất trên thế giới là Novo Nordisk và Gist Brocades chiếm trên60% lượng enzym thị trường, các chế phẩm enzym của Mỹ chỉ chiếm 15% trong số2/3 lượng enzym được sử dụng nội địa Nhật Bản với các chế phẩm enzym khá đadạng chiếm khoảng 12% đến 15% thị trường thế giới

Các proteaza là các enzym dược sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngànhsản xuất như chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm phomat, làm mềm thịt ), sản xuấtcác chất tẩy rửa, thuộc da tiếp đến là các hydratcacbonat dược ứng dụng nhiều trong

kỹ nghệ chế biến thực phẩm, trong công nghiệp dệt nhuộm, công nghiệp giấy và bộtgiấy, chế biến thức ăn gia súc như các enzym amylaza, glucoizomeraza.[9, tr 221]

1.5.1 Chế phẩm enzym amylaza.

Amylaza với công nghiệp thực phẩm: Chế phẩm amylaza đã được dùng phổ biếntrong một số lĩnh vực của công nghiệp thực phẩm như sản xuất bánh mì, glucoza,rượu, bia Trong sản xuất bánh mì, chế phẩm amylaza đã làm thay đổi hoàn toàn chấtlượng của bánh mì cả hương vị, màu sắc, độ xốp

Chế phẩm amylaza sạch cho chất lượng bánh mì tốt hơn ở dạng phức hợp vớiproteaza Chính glucoamylaza, là yếu tố làm tăng hiệu suất trong sản xuất rượu  Giai đoạn từ năm 2000, Viện Công nghiệp giấy và xenlulose đã đầu tư nghiêncứu một cách tích cực về sử dụng enzym trong công nghệ khử mực giấy loại, trong đóđặc biệt chú trọng đối với enzym α-amylaza Kết quả đã nghiên cứu thành công vàthiết lập quy trình công nghệ sử dụng enzym α-amylaza để khử mực giấy loại có giakeo tinh bột.[11]

Theo tạp chí Phát Triển Khoa Học Và Công Nghệ, tập 9, số 5 năm 2006 của LêVăn Việt Mẫn và Trần Thị Ánh Tuyết đã ứng dụng chế phẩm enzym proteaza từ nấmmốc trong phương pháp lên men bề mặt vào công nghệ chế biến nước mắm, nhằm rútngắn thời gian thủy phân protein

Sản xuất sản phẩm thủy phân dùng thay sữa mẹ nhờ chế phẩm enzymFlavouenzym Sản xuất nước chấm magi, hình thành chất tạo hương cho sản phẩmthủy phân đậu tương.

CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và môi trường.

2.1.1 Nguyên liệu.

Cám gạo, bột bắp được chọn là loại mới, không bị mốc Độ ẩm đảm bảo từ 10 12% Khô dầu đậu phụng chọn bánh tốt, phơi khô, làm nhỏ rồi bảo quản để làm thínghiệm Bột đậu tương chọn mua loại tốt, mùi thơm, không bị nhiễm mốc

Và các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm

Phòng vô trùng, tủ cấy vô trùng

2.2.2 Hóa chất.

2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu.

2.3.1 Phương pháp vi sinh.

2.3.1.1 Phương pháp phân lập tuyển chọn nấm mốc.

Trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại

ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lí, sinhhóa hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuầnkhiết

Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể banđầu và đưa về dạng thuần khiết Đây là một khâu quan trọng trong việc nghiên cứu vàứng dụng vi sinh vật Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từmột tế bào ban đầu

Nguyên tắc: Tách rời tế bào vi sinh vật.

Nuôi cấy các tế bào trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạcmọc riêng rẽ, cách biệt nhau

Cách tiến hành: Theo mục 6 phụ lục.

2.3.1.2 Phương pháp nghiên cứu hình thái tế bào nấm mốc.

Để quan sát tế bào nấm mốc ta tiến hành 2 bước

1 Quan sát đại thể

Gieo cấy nấm mốc thuần khiết lên môi trường đặc và chọn lọc trong hộp pêtri,

có thể cấy thành đường hoặc thành 1- 3 chấm trong mỗi hộp, để quan sát khuẩn lạc.Nuôi cấy ở 300C, sau 3 - 5 ngày đem quan sát với kính hiển vi

*Làm tiêu bản nấm mốc không nhuộm màu: Dùng que cấy hình móc câu lấy một

ít hệ sợi nấm dàn mỏng trên phiến kính Cho vài giọt cồn 95% để một lúc, rồi dùnggiấy thấm khô sau đó cho vài giọt NaOH 10% đậy lá kính lên và đem soi Hoặc chovài giọt cồn 600 có vết amoniac, thấm khô rồi cho vài giọt glyxerin loãng Đậy kín lákính lên và đem soi

Mục đích của các tác dụng trên đây là tăng cường khả năng thấm nước của sợinấm, đuổi bọt khí trong sợi nấm, và làm sợi nấm nở to ra để quan sát

Phương pháp tốt nhất là dùng dung dịch lacto-phenol

*Làm tiêu bản nhuộm màu nấm mốc: Nói chung nấm mốc rất khó nhuộm màu.Lúc còn trẻ sợi nấm, bắt màu nhưng khi già nó bắt màu rất kém Có thể nhuộm màubằng các dung dịch thuốc nhuộm sau:

-Erythrosin hoặc rose bengal 1% trong nước, nhuộm 15 phút

-Gentian violet 1/4 trong nước, trong 2-3 phút

-Tốt nhất là dùng xanh cotton hòa trong 100 ml lacto-phenol

2.3.2 Phương pháp hóa sinh.

2.3.2.1 Phương pháp đánh giá hoạt lực enzym bằng vòng thủy phân.

2.3.2.2 Phương pháp xác định hoạt độ enzym.

1.Xác định hoạt độ enzym - Amylaza Theo Rukhliadeva.

*Nguyên tắc của phương pháp:

Dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzym có trong dịch chế phẩm nghiên cứutới các dextrin có phân tử lượng khác nhau Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột

và các sản phẩm thủy phân của nó với iot bằng máy so màu quang điện sẽ tính đượchoạt độ enzym

Đơn vị hoạt độ amylaza là lượng enzym chuyển hóa được 1 gam tinh bột tạothành các dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 300C trong thời gian 1h ở pH = 4,7

* Cách tiến hành: theo mục 9 phụ lục.

2.Xác định hoạt độ enzym proteaza theo VILTESTE.

*Nguyên tắc của phương pháp:

Hoạt độ proteaza là hoạt độ của các enzym xúc tác phản ứng thủy phân proteinthành polypeptit và các axit amin HđP của các chế phẩm enzym được biểu thị bằng sốđơn vị hoạt độ proteaza có trong 1 gam hoặc 1ml chế phẩm

Một đơn vị HđP là một lượng enzym có khả năng xúc tác thủy phân protein đểtạo thành được 1mg nitơ amin sau 1 giờ ở 400C và pH thích hợp

Phương pháp dựa vào sự tăng nồng độ nitơ amin trong quá trình thủy phân với cơchất là gelatin Nitơ amin được định lượng bằng cách chuẩn độ các nhóm cacbonxyl tự

do của axit amin và polypepetit trong dung dịch rượu bằng NaOH với chỉ thịthimolphlatein 1%

Cách tiến hành: Theo mục 10 phụ lục.

2.3.3 Phương pháp vật lý.

Xác định độ ẩm của nguyên liệu:

Xác định độ ẩm của bột cám, bột bắp, trấu, khô dầu, bột đậu tương bằng phươngpháp sấy khô đến trọng lượng không đổi

*Nguyên tắc: Làm bay hơi nước trong mẫu Cân trọng lượng trước và sau sấy,

tính ra phần trăm nước có trong mẫu theo công thức:

Trong đó: G: Là trọng lượng cốc (gam).

G1: Là trọng lượng cốc và mẫu trước khi sấy.(gam)

G2: Trọng lượng cốc và mẫu sau khi sấy.(gam)

Để nghiên cứu chúng tôi tiến hành nuôi nấm mốc theo quy trình công nghệ sau:

Hình 2.1 Quy trình nuôi nấm mốc Asp oryzae sinh tổng hợp enzym.

Nguyên liệuPhối trộnLàm ẩmHấp Đánh tơi và làm nguội

Gieo mốc

Nuôi mốcXác định hoạt lực enzym

Nuôi cấy Ống giống

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Như chúng ta đã biết sự sinh trưởng và phát triển cũng như sự sinh tổng hợpenzym của nấm mốc phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: Thành phần môi trường dinhdưỡng, nhiệt độ, độ ẩm, pH của môi trường,

Do vậy để cho nấm mốc sinh trưởng và phát triển tốt, sinh tổng hợp enzym cóhoạt lực mạnh chúng ta cần chú ý đến các yếu tố này

Với mục đích đó chúng tôi tiến hành thực nghiệm khảo sát các yếu tố ảnhhưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym amylaza và proteaza của chủng nấm mốc

Aspergillus oryzae để tìm điều kiện tối ưu cho sự tổng hợp enzym có hoạt lực mạnh

nhất, đó là những yếu tố sau:

Sự ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng

Sự ảnh hưởng của thời gian nuôi nấm mốc

Sự ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu của nguyên liệu

Sự ảnh hưởng của nguồn nitơ và nguyên tố vi lượng bổ sung

Sự ảnh hưởng của pH

Sự ảnh hưởng của tỷ lệ trấu bổ sung

Để làm nghiên cứu, đầu tiên chúng tôi tiến hành phân lập Aspergillus oryzae

từ ống nghiệm gốc do Viện Công Nghệ Thực Phẩm Hồ Chí Minh cung cấp

Sau đó chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinhtổng hợp enzym amylaza và proteaza

3.1.Kết quả phân lập lại nấm mốc Asp oryzae từ ống nghiệm gốc.

3.1.1.Kết quả phân lập nấm mốc Asp oryzae từ ống nghiệm gốc.

Để phân lập chúng tôi sử dụng môi trường Czapek-Dox

Thành phần môi trường: Theo mục 1 phụ lục

Cách tiến hành: Theo mục 6 phụ lục

Kết quả thể hiện ở các hình 3.1, 3.2, 3.3 dưới đây

Hình 3.1 Aspergillus oryzae sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường Czapek-Dox.

Hình 3.2 Aspergillus oryzae sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường Czapek-Dox.

Sau khi phân lập chúng tôi nuôi cấy Asp oryzae trên môi trường nhân giống.

Môi trường nhân giống được chuẩn bị theo mục 2 phụ lục

Kết quả sau 2 ngày nuôi cấy thể hiện ở hình 3.3

Hình 3.3 Asp oryzae phát triển sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường nhân giống Qua các hình ảnh 3.1, 3.2, 3.3 chúng tôi có nhận xét sau:

Chủng Asp oryzae phát triển trên môi trường Czapek-Dox ở nhiệt độ

28-320C, sau hai ngày nuôi khuẩn lạc có tản màu trắng xốp Sau 3-4 ngày nuôi có nhiềubào tử màu vàng hoa cau, sau đó chuyển sang màu nâu nhạt Càng về già thì bào tửnấm mốc chuyển sang màu xanh

Sau khi phân lập chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên muôi trường nhân giốngnhận thấy nấm mốc phát triển rất tốt, không thấy tạp nhiễm

Hình 3.3

Tơ nấm màu trắng xốp, mọc dày trên bề mặt thạch Bào tử màu vàng hoa cauxuất hiện đều, và dày.

Chúng tôi bảo quản các ống giống đã phân lập thuần khiết ở tủ lạnh với nhiệt

độ 4-50C để dùng dần

3.1.2 Kết quả quan sát bào tử nấm mốc Aspergillus oryzae.

Để kiểm tra hình thái bào tử nấm mốc chúng tôi tiến hành quan sát trên kínhhiển vi motic 1.3 Kết quả thu được ở hình 3.4

Hình 3.4 Bào tử nấm mốc Asp oryzae quan sát trên kính hiển vi.

3.1.3 Kết quả kiểm tra hoạt lực enzym amylaza trên môi trường Czapek

- Dox nhưng thay saccaroza bằng tinh bột tan.

Chủng nấm mốc sau khi phân lập và nuôi cấy trên môi trường nhân giống.Chúng tôi tiến hành kiểm tra hoạt lực enzym proteaza và amylaza tạo thành theophương pháp vòng thủy phân Môi trường kiểm tra hoạt lực enzym amylaza theomục 4, mục 5 phụ lục Kết quả thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.5 và 3.6

Hình 3.5 Asp oryzae phát triển sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường

Czapek - Dox nhưng thay saccaroza bằng tinh bột tan.

Hình 3.6 Hoạt tính enzym amylaza theo phương pháp vòng thủy phân.

Hình 3.6 Hình 3.5

Bảng 3.1: Kết quả theo dõi hoạt tính enzym amylaza.

3.1.4 Kết quả kiểm tra hoạt lực enzym proteaza trên môi trường Czapek

- Dox nhưng thay NaNO3 bằng gelatin.

Hình 3.7 Nấm mốc phát triển sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường trường

Czapek - Dox nhưng thay NaNO3bằng gelatin.

Hình 3.8 Hoạt tính enzym proteaza theo vòng thủy phân.

Bảng 3.2: Kết quả theo dõi hoạt tính enzym proteaza theo vòng thủy phân.

Từ bảng 3.1, 3.2, hình 3.5, 3.6, 3.7, 3.8 cho thấy chủng nấm mốc Asp oryzae

tạo vòng thủy phân khi cho dung dịch Lugol vào môi trường chứa tinh bột và

Hình 3.8 Hình 3.7