Phân lập vi khuẩn bacillus subtilis trong ao nuôi tôm sú (penaeus monodon) tại sóc trăng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN LÊ MỸ PHƯƠNG PHÂN LẬP VI KHUẨN Bacillus subtilis TRONG AO NUÔI TƠM SÚ (Penaeus monodon) TẠI SĨC TRĂNG Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN Cần Thơ, 2008 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN LÊ MỸ PHƯƠNG PHÂN LẬP VI KHUẨN Bacillus subtilis TRONG AO NI TƠM SÚ (Penaeus monodon) TẠI SĨC TRĂNG Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN Cần Thơ, 2008 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC HÌNH Hình Trang -2 Hình 4.1: Khuẩn lạc sau 24 độ pha lỗng 10 21 Hình 4.2: Khuẩn lạc TSA sau 24 21 Hình 4.3: Vi khuẩn gram dương 22 Hình 4.4: Bào tử sau 28 22 Hình 4.5: Các bào tử tự sau 36 22 Hình 4.6: Thủy phân Starch 24 Hình 4.7: Thuỷ phân Casein 24 Hình 4.8: Thuỷ phân Gelatin 24 Hình 4.9: Phản ứng V-P dương tính 25 Hình 4.10: Tạo Nitrite từ Nitrate dương tính 25 Hình 4.11: Methyl red dương tính 25 Hình 4.12: Vi khuẩn phát triển nồg độ muối Trung tâm Học ĐH10% Cần Thơ @ Tài liệu học tập 26 nghiên cứu 2%, liệu 5%, 7%, Hình 4.13: Xylose (+), Arabinose (+), Mannitol (+), Glucose (+), Sucrose (-) 26 Hình 4.14: Kết chạy điện di ADN dòng chuẩn Bacillus subtilis 27 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Phần I: GIỚI THIỆU Phần II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Ứng dụng vi sinh vật đời sống người 2.2 Các vấn đề phát sinh ao nuôi tôm thâm canh - 2.3 Probiotic thuỷ sản 2.3.1 Khái niệm ứng dụng probiotic - 2.3.2 Cơ chế tác dụng probiotic 2.4 Đặc điểm sinh học Bacillus subtilis 2.4.1 Vị trí phân loại - 2.4.2 Quá trình hình thành bào tử 2.4.3 Vai trò Bacillus subtilis 10 2.5 Các đặc tính sinh lý, sinh hóa vi khuẩn - 11 2.6 Phương pháp PCR 12 Phần III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Địa điểm thời gian thực 14 3.2 Mơi trường, hóa chất thiết bị 14 3.3 Phương pháp thu phân tích mẫu 15 Trung tâm liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên 3.3.1 ThuHọc mẫu 15 3.3.2 Phân tích mẫu - 15 3.4 Phân lập vi khuẩn - 15 3.5 Xác định tiêu hình thái, sinh lý, sinh hoá vi khuẩn - 15 3.6 Phương pháp PCR 17 3.6.1 Ly trích ADN -17 3.6.2 Qui trình chạy PCR 18 3.6.3 Chạy điện di đọc kết 18 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 4.1 Kết phân lập vi khuẩn 19 4.2 Kết hình thái, sinh lý, sinh hố vi khuẩn - 19 4.3 Kết PCR dòng chuẩn - 26 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 28 5.1 Kết luận - 28 5.1 Đề xuất 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO - 29 cứu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ Đặc biệt thầy cô thuộc môn Sinh học Bệnh học Thủy sản truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt trình em học tập nghiên cứu trường Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Phạm Thị Tuyết Ngân tận tình hướng dẫn giúp đỡ em nhiều trình thực đề tài tốt nghiệp Đồng thời xin gởi lời cám ơn đến cô cố vấn Nguyễn Thị Thu Hằng gia đình bạn lớp Bệnh học Thủy sản K30 động viên hỗ trợ cho em thời gian học tập thực đề tài tốt nghiệp Sinh viên thực Lê Mỹ Phương Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT Bacillus subtilis vi khuẩn có lợi, có vai trị quan trọng nhiều lĩnh vực đời sống Phần lớn sản phẩm men vi sinh bán thị trường có thành phần B subtilis Đề tài thực nhằm phân lập xác định đặc tính sinh hoá vi khuẩn phân lập để định danh vi khuẩn B subtilis ao nuôi tôm sú thâm canh Thu mẫu bùn ao nuôi tôm thâm canh Sóc Trăng với nhịp thu tuần/lần phân tích phịng thí nghiệm Kết phân lập 39 chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus, có chủng cho kết đặc tính sinh hố gần giống với Bacillus subtilis Tám chủng vi khuẩn trữ lại tiếp tục định danh theo phương pháp PCR Tuy nhiên thời gian có hạn đề tài thực đến việc xác định chủng vi khuẩn chuẩn B subtilis S19 (bằng phương pháp PCR) sử dụng làm đối chứng dương Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phần I: GIỚI THIỆU Trong năm gần đây, thuỷ sản trở thành ngành kinh tế mũi nhọn nước ta Sản lượng thuỷ sản không đáp ứng nhu cầu thực phẩm nước mà xuất sang thị trường nước Nhật, Nga, Mỹ, Úc,… Năm 2007, xuất thuỷ sản nước ta đạt 3,7 tỷ USD, vượt 2,78% so với kế hoạch, tăng 10,45% so với năm 2006 (Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nơng Thơn, 2007) Trong tơm Sú (Penaeus monodon) sản phẩm xuất chủ lực, chiếm 39,9% tổng sản phẩm thuỷ sản xuất Tuy nhiên để tăng xuất lợi nhuận, người nuôi không ngừng tăng mật độ giống thả, sử dụng thuốc, hố chất phịng trị bệnh chưa hợp lý, thiếu sót quản lý mơi trường… Vấn đề không làm xáo trộn cân sinh học hệ sinh thái ao ni mà cịn tạo điều kiện cho dịch bệnh bùng phát ảnh hưởng đến sức khoẻ vật nuôi, đồng thời gây ô nhiễm môi trường Trước tình hình trên, xu hướng chung giới “phịng bệnh chữa bệnh” nayliệu nhiều mơCần hình Thơ ni bền học đề xuất áp nghiên dụng cứu Trung tâmHiện Học ĐH @ vững Tài liệu tậpvàvà nuôi tôm thân thiện môi trường, nuôi sinh thái, ni an tồn sinh học… Gần nhà khoa học tập trung nghiên cứu việc tận dụng vi sinh vật hữu ích để tạo chế phẩm sinh học (như: Bio-remediation, Bio-control, Probiotics) thông qua chế tác động chúng như: sản xuất hợp chất ức chế vi sinh vật gây hại, cạnh tranh dinh dưỡng, nơi cư trú, tiết enzym phân huỷ hợp chất hữu giúp cải thiện môi trường ao ni, hỗ trợ q trình tiêu hố cho đối tượng ni… Một nhóm vi khuẩn nghiên cứu nhiều Bacillus Hầu hết loài Bacillus không độc hại động vật kể người Nó có vai trị quan trọng khả sản sinh nhiều sản phẩm biến dưỡng thứ cấp kháng sinh, thuốc trừ sâu sinh học, hoá chất enzym (trích dẫn Olmos, 2005) Đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon) Sóc Trăng” thực với mục tiêu nội dung: Mục tiêu Phân lập xác định đặc tính sinh hóa Bacillus subtilis ao ni tơm sú thâm canh Từ làm sở cho nghiên cứu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nội dung Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu bùn ao nuôi tôm sú thâm canh Khảo sát đặc điểm sinh học vi khuẩn theo phương pháp truyền thống Nhận diện dòng vi khuẩn chuẩn Bacillus subtilis S19 kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phần II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Ứng dụng vi sinh vật đời sống người Việc nghiên cứu vi sinh vật phát triển nhanh dẫn đến việc hình thành lĩnh vực khác nhau: vi khuẩn học (Bacteriology); nấm học (Mycology); tảo học (Phicology); virus học (Virology),…Chúng ứng dụng nhiều lĩnh vực như: y học, thú y, công nghiệp, nông nghiệp, môi trường,…(Nguyễn Xuân Thành ctv, 2005) Đa số vi sinh vật tự nhiên có lợi, cần nghiên cứu vai trị to lớn nhiều mặt nhóm vi sinh vật tự nhiên công nghiệp Trên sở tìm kiếm phương pháp nhằm khai thác đầy đủ tác động tích cực vi sinh vật ngăn chặn cách hiệu tác động có hại chúng Định hướng nghiên cứu lĩnh vực công nghiệp vi sinh vật nhằm tạo nhiều chế phẩm vi sinh vật hữu ích ứng dụng sản xuất nơng nghiệp, công nghiệp, phục vụ đắc lực cho hoạt động sống người (Nguyễn Xuân Thành ctv, 2005) Vi tâm sinh vật tham gia ĐH vào việc khép kín @ vịng tuầnliệu hồnhọc vật giữ cân cứu Trung Học liệu Cần Thơ Tài tậpchất và nghiên sinh thái tự nhiên Một số chủng vi sinh vật tiết chất kháng sinh, vitamin, chất kích thích sinh trưởng, tế bào chứa tinh thể diệt côn trùng áp dụng công nghệ sản xuất chất kháng sinh, vitamin, thuốc bảo vệ thực vật,… Ngoài ra, vi sinh vật phân huỷ chất độc hại, phế thải nông nghiệp, công nghiệp, làm môi trường,…(Nguyễn Khắc Thái Sơn, 2007) Trong y học, công nghệ vi sinh góp phần việc tìm kiếm nhiều loại dược phẩm quan trọng, chẩn đoán điều trị nhiều loại bệnh hiểm nghèo cho người, gia súc, gia cầm Đặc biệt trình tìm kiếm biện pháp, thuốc phịng trị loại bệnh truyền nhiễm, cơng nghệ vi sinh tạo vacxin từ vi sinh vật như: vacxin tạo từ riboxom loài vi khuẩn gây bệnh, có ưu điểm độc tính miễn dịch cao vacxin tạo từ mảnh vỏ virus gây bệnh Ngồi vacxin cịn chế tạo từ vi khuẩn nấm men tái tổ hợp có mang gen mã hố việc tổng hợp protein kháng nguyên gây bệnh (Nguyễn Xuân Thành ctv, 2005) Cơng nghệ vi sinh cịn ứng dụng để sản xuất men tiêu hóa cho người Hầu hết men tiêu hóa dùng cho người thị trường có chứa vi sinh vật thuộc nhóm Bacillus LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com subtilis như: Biosubtilic, Bidisubtilic, Antibio, Biofidin, Biobaby,…(Nguyễn Khắc Thái Sơn, 2007) Vi sinh vật cịn có vai trị việc tạo nguồn lượng cho người lên men nguyên liệu rẻ tiền rỉ đường để sản xuất cồn chạy xe thay xăng Nhờ trình lên men yếm khí vi sinh vật chuyển hố vật chất hữu tạo Biogas làm khí đốt Đặc biệt, vi sinh vật có vai trị lớn việc bảo vệ mơi trường, tham gia tích cực việc xử lý phế thải nông nghiệp, công nghiệp, rác thải sinh hoạt, nước thải,…làm môi trường Trong tự nhiên, nhờ hoạt động sống vi sinh vật nên lượng lớn chất hữu bị khoáng hoá Các hợp chất hữu chuyển hoá qua hàng loạt phản ứng hoá học, xúc tác phản ứng enzyme (Nguyễn Xuân Thành, 2005) Trong chuyển hố hợp chất tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật tham gia, sản phẩm chuyển hoá vi sinh vật lại chất cho vi sinh vật khác, hoạt động chúng diễn phức tạp có mối liên hệ chặt chẽ với Sự phân huỷ chất hữu diễn với tốc độ khác phụ thuộc vào thành phần, số lượng điều kiện môi trường Thành phần chủ yếu hợp chất hữu nước bùn ao nuôi tôm bao gồm: protein, lipit, hydratcacbon, khuẩn có khả phân học huỷ protein gặp cứu Trung tâm Học kitin liệu Các ĐH viCần Thơ @ Tài liệu tập vàthường nghiên thuộc chi Pseudomonas, Clostridium, Bacillus Chúng phân giải protein thành polypeptit, axit amin, NH3 Nhóm vi sinh vật phân huỷ hydratcacbon bao gồm chi Bacillus, Aspegilus streptomyces, Streptocococus, Clostrium,… Trong trình hydratcacbon (tinh bột, xenluloza, pectin, hemixenluloza,…) phân giải thành phần nhỏ hơn, tạo sản phẩm q trình trao đổi chất khí (NH3, CO2), axit formic, axit acetic, axit propinic, axit béo, axit lactic, chất khoáng sinh khối vi sinh vật (http://www.nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2k6-08.htm) Một đặc điểm quan trọng vi sinh vật chúng sinh trưởng nhanh Khi nuôi cấy mơi trường thích hợp sau 24 từ tế bào vi sinh vật thu sinh khối lớn Hơn chúng nuôi cấy dễ dàng chất rẻ tiền, khơng tốn nhiều diện tích việc sản xuất khơng phụ thuộc vào thay đổi thời tiết (http://www.nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2k6-08.htm) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 4.6 Thủy phân Starch Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Hình 4.7 Thủy phân Casein Hình 4.8 Thủy phân Gelatin LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 4.9 Phản ứng VP dương tính (mũi tên) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Hình 4.10 Sự khử Nitrate dương tính (mũi tên) Hình 4.11 Methyl red dương tính (mũi tên) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 4.12: Vi khuẩn phát triển nồng độ muối khác (đối chứng, 2%, 5%, 7%, 10% thứ tự từ phải qua trái) Qua xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa, cho thấy Bacillus subtilis có khả thích nghi với điều kiện mơi trường khác Vi khuẩn có khả sống nồng độ muối 7% 10%, pH 5,7 phát triển nhiệt độ 65ºC Do vi khuẩn có khả phân bố rộng chiếm ưu Qua Hình 4.12, độ củaHọc dung liệu dịch ĐH giảmCần dần nồng muối tăng chotập thấyvà vi nghiên khuẩn phátcứu Trungđục tâm Thơ @độTài liệu học triển mạnh nồng độ muối 5% Hình 4.13: Lên men đường Xylose(+), Arabinose (+), Mannitol(+), Glucose(+), Sucrose(-) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.3 Kết PCR dịng chuẩn Do thời gian có hạn nên việc định danh chủng vi khuẩn phân lập theo phương pháp phân tử chưa thực Đề tài thực đến việc xác định lại xác dịng chuẩn phương pháp PCR dùng làm đối chứng dương cho phản ứng PCR chủng vi khuẩn phân lập 1500 bp M 1517 bp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Hình 4.14: Kết chạy điện di ADN dịng chuẩn Bacillus subtilis S19 Qua hình 4.14, M thang ADN 100 bp, giếng mẫu ADN dòng chuẩn lập lại lần, giếng đối chứng âm Ở giếng không vạch sáng chứng tỏ phản ứng PCR không bị tạp nhiễm Hai vạch sáng từ giếng tương ứng với vạch 1.500 bp nên phản ứng PCR thực LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phần V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết kuận Phân lập 39 chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus Qua kết xác định đặc tính sinh hóa loại trừ cịn chủng vi khuẩn thoả tiêu định danh cho Bacillus subtilis Bao gồm chủng: IV-A4-37-S, IV-A2-35-S, II-A2-6-S, IIIA4-30-S, II-A4-12-S, III-A4-29-S, III-A3-23-S, IV-A4-38-S Tuy nhiên chưa thể kết luận xác chủng B subtilis cịn vài tiêu sinh hóa chưa xác định (Phát triển điều kiện kỵ khí, sinh gas từ Glucose, Citrate, Tyrosine, Lecithinase) Kết PCR khẳng định xác dịng chuẩn Bacillus subtilis S19 dùng làm đối chứng dương để nhận định sản phẩm PCR cho việc định danh tiếp chủng phân lập theo phương pháp phân tử 5.2 Đề xuất Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Tiếp tục định danh chủng vi khuẩn phân lập theo phương pháp PCR Nghiên cứu khả phân huỷ chất hữu khả diệt khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ ao nuôi tôm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Andretta, C.W.S., R.M Rosa, E.C Tondo, C.C Gaylarde and J.A.P Henriques 2004 Identification and molecular characterization of a Bacillus subtilis IS13 strain involved in the biodegradation of 4,5,6trichloroguaiacol Chemosphere 55 (2004) 631-639 Austin, B., L.F Stuckey, P.A.W Robertson, J Effendi and D.R.W Griffith 1995 A probiotic reducing disease caused by Aeromonas salmonicida, Vibrio anguillarum and Vibrio ordalii Journal of Fish Diseases 18, 93-96 Banwart, G.J 2000 Basic food microbiology Department of Microbiology The Ohio State University Boon, N., J Goris, P.D Vos, W Vertraete and E.M Top 2000 Bioaugmentation of activated sludge by an indegenous 3-chloroanilinedegrading Comamnas testosteroni strain, I2gfp Appl Environ Icrobiol 66: 2906-2913 Brown, A.E 2005 Benson’s Microbiological Applications Ninth edition Collins, C.H.,ĐH P.MCần Lyne and@J.M 1986 Trung6.tâm Học liệu Thơ Tài Grange liệu học tập Microbiological nghiên cứu Methods Sixth edition Driks, A 1999 Bacillus subtilis spore coat Microbiology and Molercular biology reviews, p.1-20, vol.63, No.1 Đặng Thị Hồng Oanh 2007 Giáo trình Nguyên lý kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản Khoa Thủy Sản-Trường Đại Học Cần Thơ Đặng Thị Hồng Oanh 2007 Xác định tiêu hình thái sinh lý sinh hóa vi khuẩn Trong: Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chun mơn Bệnh Học Thủy Sản Bộ môn sinh học bệnh thủy sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ 10 Elnasser, Z., A Maraqa, W Owais, A Khraisat 2007 Isolation and characterization of new Thermophilic bacteria in Jordan The internet journal of microbiology Vol Number 11 Fuller, R 1987 A review, probiotics in man and animals Journal of Applied Bacteriology 66, 365-378 12 Gatesoupe, F.J 1991 Siderophore production and probiotic effect of Vibrio sp Associated with turbot larvae, Scophthalmus maximus Aquatic Living Resources 10, 239-246 13 Gong, M., J.D Wang, J Zhang, H Yang, X.F Lu, Y Pei and J.Q Cheng 2006 Study of the antifungal ability of Bacillus subtilis strain PY-1 in Vitro and identification of its antifungal substance (Iturin A) Acta Biochim Biophys Sin 38: 233-240 14 Gram L., J Melchiorsen, B Spanggaard, I Huber and T.F Nielsen 1999 Inhibition of Vibrio anguillarum by Pseudomonas fluorescens AH2, a possiple probiotic treatment of fish Applied and Environmental Microbiology 65, 969-973 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 15 Hastings, J.W and K.H Nealson 1981 The symbiotic luminous bacteria In: The Prokaryotes II Springer- Verlag, Newyork, 1960 pp 16 Huys, G 2003 Sampling and sample processing procedures for the isolation of aquaculture assosiated bacteria 17 Irianto, A., and B Austin 2002 Probiotics in aquaculture 633-642 18 Marlowe, E.M., K.L Josephson and I.L Pepper 2005 Nucleic acid-based methods of analysis 287-315 19 Mirel, D.B., W.F Estacio, M Mathieu, E Olmsted, J Ramirez, and L.M Marquez-Magana 2000 Environmental Regulation of Bacillus subtilis σD –Dependent gene expression Journal of Bacteriology, June 2000, p.30553062 Vol.182, No.11 20 Moriarty, D.J.W 1998 Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds Aquaculture 164 : 351 – 258 21 Moriarty, D.J.W 1997 The role of microorganism in aquaculture ponds Aquaculture 151, 333-349 22 Moriarty, D.J.W 1999 Disease control in shrimp aquaculture with probiotic bacteria 23 Nguyễn Lân Dũng 1983 Thực tập vi sinh vật học Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội 24 Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Bá Hiên, Hoàng Hải, Vũ Thị Hoan 2005 Trung tâmGiáo Học liệu ĐHvậtCần Thơnghiệp @ Tài liệu tập dục nghiên cứu trình vi sinh học công Nhà xuấthọc giáo 25 Nguyễn Khắc Thái Sơn 2007 Một vài suy nghĩ công nghệ vi sinh vật ứng dụng Khoa Tài Nguyên Môi Trường 26 Olmos, S.J and J.L.S Ochoa 2005 The functional property of Bacillus for shrimp feeds Food Micrology 23, 519-525 27 Phạm Thị Tuyết Ngân 2006 Giáo trình vi sinh học ứng dụng thủy sản Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ 28 Rengpipat, S., W.Phianphak, S Piyatirativivorakul and P Menasveta 1998 Effects of a probiotic bacterium on black tiger shrimp Penaeus monodon survival and growth Aquaculture 167, 301-313 29 Robertson, P.A.W., C O’Dowd, C Burrells, P Williams and B Austin 2000 Use of Carnobacterium sp as a probiotic for Atlantic salmon (Salmo salar L.) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) Aquaculture 185, 235-243 30 Rosenthal, H 1980 Ozonation and sterilization In: Symposium on New Developmants in Utilization of Heated Effluents and of Recirculation Systems for intensive Aquaculture FAO EIFAC /80/ Symp: R/8/ May 1980 European Inland Fisheries Advance Committee, Norway, 75 pp 31 Salminen S., A Ouwehand, Y Benno and Y.K Lee 1999 Probiotics: how should they be defined? Trends in Food Science Technology 10, 107110 32 Salyers, A.A and D.D Whitt 2001 Microbiology- Diversity, Disease, and the environment 33 Sharmin, F and Rahman, M 2007 Isolation and characterization of protease producing Bacillus strain FS-1 Agricultural Engineering International: the CIGR Ejournal Vol IX April, 2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 34 Vaseeharan, B and P Ramasamy 2002 Control of pathogenic Vibrio spp by Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatmant for black tiger shrimp Peaneus monodon Appplied Microbiology 36, 83-87 35 Vaseeharan, B., J Lin and P.Ramasamy 2004 Effect of probiotics, antibiotic sentivity, pathogenicity and plasmid profiles of Listonella anguillarum- like bacteria isolatedfrom Penaeus monodon culture systems Aquaculture 241 (2004), 77-91 36 http://www.nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2k6.08.htm/ 37 http://www.upwardquest.com/bacillus-subtilis.html/ 38 http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Subtilisin 39 http://www.textbookofbacteriology.net/Bacillus.html/ Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC A Các bước thực tiêu sinh lý, sinh hố Tính di động Sự di động vi khuẩn quan sát kính hiển vi phương pháp giọt treo Các bước: Cho vaseline lên góc lamelle đặt ngửa lam bàn Dung que cấy tiệt trùng lấy nước muối sinh lý cho lên lamelle Lấy vi khuẩn cho lên lam hòa vào nước muối sinh lý Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn - Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước treo ngược lamelle - Đặt lame kính hiển vi quan sát tính di động vi khuẩn vật kính 40X - Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Nhuộm Gram vi khuẩn Cố định vi khuẩn lam: Nhỏ giọt nước cất lên lam, dùng que cấy nhặt vi khuẩn trải lên giọt nước cất Để khơ nhiệt độ phịng, sau hơ lướt lam lửa đèn cồn hai ba lần Nhuộm với dung dịch Crystal violet 30 giây, rửa lam vòi nước nhẹ Sau nhỏ dung dịch Iodine lên lam để phút rửa với 95% alcohol 10 giây, để rửa vòi nước nhẹ Nhuộm tiếp với dung dịch Safranin phút Rửa vòi nước, để khơ nhiệt độ phịng Quan sát vi khuẩn kính hiển vi vật kính 100X Nhuộm bào tử Cố định vi khuẩn (khuẩn lạc ủ 36 giờ) lam (giống phương pháp nhuộm Gram) Nhỏ dung dịch malachite green 5% lên vi khuẩn cố định lam, đặt lam lên cốc thủy tinh 25 ml chứa nước đun sôi bếp điện, để phút Sau rửa nước., để nhiệt độ phòng Nhuộm tiếp với dung dịch safranin 45 giây Sau rửa nước để khơ nhiệt độ phịng Quan sát kính hiển vi vật kính 100X Bào tử bắt màu xanh thành tế bào bắt màu hồng Phản ứng Catalase LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Dùng que cấy nhặt vi khuẩn để lên lam, sau nhỏ lên vi khuẩn giọt dung dịch H2O2 3% Vi khuẩn cho phản ứng catalase dương gây tượng sủi bọt Phản ừng Voges – Proskauer (VP) Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa ml môi trường MR – VP broth + 1,5% NaCl trùng, ủ 30oC Sau 48 nhỏ 0,6ml thuốc thử A (5g alpha naphthol 100 ml ethylalcohol) 0,2ml thuốc thử B (40g KOH 100ml nước cất) vào ống nghiệm Lắc để nghiêng ống nghiệm khoảng 30 phút Sự chuyển màu hồng môi trường cho phản ứng dương ngược lại Phản ừng tạo Nitrite từ Nitrate Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa ml môi trường Nitrare broth +1,5% NaCl trùng Ủ 30oC, sau 24 nhỏ 1ml thuốc thử A (0,8% sulphanilic acid 5N acid acetic) thêm 1ml thuốc thử B (0,5% alpha naphthylamine 5N acid acetic) vào ống nghiệm Sự xuất màu đỏ vòng – choHọc phảnliệu ứng dương ngược Trungphút tâm ĐH Cần Thơlại.@ Tài liệu học tập nghiên cứu Khả thủy phân Starch Cấy vi khuẩn lên đĩa môi trường bao gồm nutrient agar + 0,5% Starch + 1,5% NaCl trùng Ủ 30oC, sau 24h nhỏ thuốc thử Lugol’s iodine lên bề mặt agar Nếu xuất vịng rõ xung quanh chỗ có chứa vi khuẩn phát triển 30 phút cho phản ứng dương ngược lại Khả thủy phân Gelatin Cấy vi khuẩn lên đĩa môi trường (chứa nutrient agar + 1% gelatin + 1,5% NaCl) trùng Ủ 30oC Sau 24 nhỏ thuốc thử HgCl2 (12g HgCl2, 80ml nước cất, 16ml HCl đậm đặc) lên bề mặt agar Nếu xuất vòng rõ xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển cho phản ứng dương ngược lại Khả thủy phân Casein (skimmed milk) Cấy vi khuẩn lên đĩa môi trường skimmed milk agar (chứa 1% casein, 0,2% yeast extract, 0,01% KH2PO4, 0,03% K2HPO4, 0,5 NaCl 2% agar – pH 6,5) ủ 55oC 72h Nếu xuất vịng rõ xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển cho thấy có thủy phân casein 10 Khả sinh indole Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3ml môi trường Nutrient broth + 1,5% NaCl trùng Ủ 30oC từ 24 – 48h, sau nhỏ vài giọt thuốc thử LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kovac’s vào, vi khuẩn sinh indole cho phản ứng dương với vòng màu từ hồng đến đỏ sậm bề mặt môi trường ngược lại 11 Khả sử dụng Citrate Môi trường Simmon’s Citrate agar + 1,5% NaCl đun sôi khuấy cho tan, sau cho 3ml mơi trường vào ống nghiệm, sau trùng để nghiêng ống nghiệm tạo thành mặt phẳng nghiêng để nguội Cấy vi khuẩn bề mặt nghiêng môi trường Ủ 30oC, sau – ngày vi khuẩn sử dụng Citrate tạo màu xanh lơ cho phản ứng dương ngược lại 12 Khả phát triển vi khuẩn nồng độ muối: 2%, 5%, 7%, 10% Môi trường 1% Tryptone Thêm NaCl ứng với nồng độ 2, 5, 7, 10% NaCl Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm Thanh trùng 121ºC 15 phút Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm ủ 30ºC Sau 2-4 ngày, môi trường đục cho kết dương tính ngược lại 13 Khả phát triển vi khuẩn nhiệt độ: 50oC, 65oC Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trường TSB + 1,5% NaCl Ủ nhiệt độ 55ºC 65ºC Sau 2-4 ngày, mơi trường đục cho kết dương tính ngược lại 14 Khả sử dụng carbohydrate (glucose, arabinose, xylose, sucrose, mannitol) - Môi trường TSB + 1,5% NaCl 0,4% Bromothymol blue (1,6%) 1% đường (Glucose, Arabinose, Xylose, Sucrose, Mannitol) Chỉnh pH 6,8 Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm Thanh trùng 121ºC 15 phút Cấy vi khuẩn vào môi trường đường tương ứng Ủ 30ºC Sau 2-7 ngày môi trường chuyển sang màu vàng cho kết dương tính ngược lại 15 Methyl Red Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3ml môi trường MR-broth + 1,5% NaCl Sau 24-48 nhỏ giọt thuốc thử methyl red (0,04g methyl red + 40ml ethanol +100ml nước cất) Xuất vòng màu đỏ cho phản ứng dương tính, màu vàng cho phản ứng âm tính LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 16 Khả sử dụng urê - Dung dịch 0,1% pepton +1% NaCl + 0,2% KH2PO4 + 0,0012% Phenol red + 1% glucose - Thêm 2% urê cho phản ứng Mơi trường làm đối chứng khơng có urê - Cho 3ml môi trườg vào ống nghiệm - Thanh trùng 121ºC 15 phút - Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Ủ 30ºC - Sau ngày môi trường chuyển màu hồng cho kết dương tính ngược lại Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com B Kết test sinh hóa 39 chủng vi khuẩn phân lập Chỉ tiêu Trung Gram + + Di động + + Catalase + + VP + + Methyl red + Casein + Gelatin + Starch + Urê Khử Nitrate + 2% NaCl + 5% NaCl + 7% NaCl 10% NaCl 55ºC 65ºC pH 5,7 pH 6,8 + tâm Học liệu +ĐH Glucose Arabinose + Xylose + Sucrose Mannitol Sinh indole - + + + - + + + - + + + + - + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - - + + + + + + + + + + + + + - - + - - + - - + - - + - - + + + + @ +Tài+ liệu + + + + + + + - - - - - + + + + - - - - Cần Thơ 10 11 12 13 14 15 + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + - + - + - + + + + - + + + + - + + - + - + + + + + + + + + - + - + - + + - + - + + + + + học -tập+ nghiên + + - + + + - + - + - + - + - cứu Ghi chú: (+) phản ứng dương tính, (-) âm tính Những chủng cho kết âm tính với Casein, Gelatin, Starch bị loại bỏ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chỉ tiêu Gram Di động Catalase VP Methyl red Casein Gelatin Starch Urê Khử Nitrate 2% NaCl 5% NaCl 7% NaCl 10% NaCl 55ºC 65ºC pH 5,7 pH 6,8 Glucose Arabinose TrungXylose tâm Học Sucrose Mannitol Sinh indole 16 17 18 19 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + +ĐH+Cần + liệu - 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + - + + + - + + + + - + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +@+Tài+ liệu + học + tập + +và + + +cứu Thơ nghiên - + + + + + + + + - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trung tâm Chỉ tiêu Gram Di động Catalase VP Methyl red Casein Gelatin Starch Urê Khử Nitrate 2% NaCl 5% NaCl 7% NaCl 10% NaCl 55ºC 65ºC pH 5,7 pH 6,8 HọcGlucose liệu ĐH Arabinose Xylose Sucrose Mannitol Sinh indole 31 32 33 34 35 36 37 38 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + - + + - + - + + - + + + + + - + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + - + + + + + + + - + + - + - + + + + + + + + + + + + Cần Thơ @ Tài liệu học tập + + + + + - + - + + + + + + + - 39 + + + + + + + + + + + + + - nghiên cứu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... tài ? ?Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis ao ni tơm sú (Penaeus monodon) Sóc Trăng? ?? thực với mục tiêu nội dung: Mục tiêu Phân lập xác định đặc tính sinh hóa Bacillus subtilis ao nuôi tôm sú thâm... hố vi khuẩn phân lập để định danh vi khuẩn B subtilis ao nuôi tôm sú thâm canh Thu mẫu bùn ao ni tơm thâm canh Sóc Trăng với nhịp thu tuần/lần phân tích phịng thí nghiệm Kết phân lập 39 chủng vi. .. Nội dung Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu bùn ao nuôi tôm sú thâm canh Khảo sát đặc điểm sinh học vi khuẩn theo phương pháp truyền thống Nhận diện dòng vi khuẩn chuẩn Bacillus subtilis