Thiết kế vector biểu hiện gen trong vi khuẩn bacillus subtilis đề tài NCKH QG 10 22

DẠI n ọ c Q U Ổ C G IA HÀ NỘI VIỆN VI SINH VẠT VÀ C Ô N G N G H Ệ SINH HỌ C BÁO CÁO KÉT QUẢ THỤ C HIỆN ĐÈ TÀI KHCN NHÓM B CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA Tên đề tài:Thiết k ế vector biểu gen (rong vi khuẩn Bacillus subtilis Mã số: QG.10 22 Chủ trì đề tài: TS N guyễn Quỳnh Uyển Co' quan: Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh H Nội năm 2012 học M ự c LỤC PHẦN I BÁO CÁO TÓM TÁT Bằng tiếng Việt Bằng tiếng Anh PHẦN II BÁO CÁO TỐNG KÉT 12 Giải thích chữ viết tắt 13 Danh sách ngưòi tham gia thực đề tài 14 Danh inục bảng hình 15 MỞ ĐẦU 17 CHƯƠNG I TỎNG QUAN TÀI L IỆ U 18 1.1 Vi khuẩn B su b tilỉs 18 1.1.1 Tóm tắt vè B subtiỉis 18 1.1.2 Tính an tồn B su bíilis 18 1.1.3 Những ứng dụng B subtilis 19 Vector bieu cài nhập genvào nhiễm sắc thể vi khuân B su b tilỉs 22 1.2.1.Vector biêu E c o li ĩ 22 1.2.2 Vector biểu B subtilis cài Iiliập gen đích vào nhiễm sắc thể vi kliuẩn B subtiỉis 23 1.3 Gen la c Z 25 1.4 Nội dung mục đích nghiên c ứ u 26 CHƯƠNG II - NGUYÊN VẠT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c u 28 2.1 Nguyên vật liệu đối tuụng nghiên cứu hóa chất sử dụng 28 2.1.1 Nguyên vật liệu đoi tượng nghiên cừ u 28 2.1.2 Hóa chất môi trường 29 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ sử dụng trung nghiên cứu 30 2.2 Phương pháp nghiên cứu .30 2.2.1 Quy trình tách dịng 30 2.2.2 Pltuvng pháp kiêm tra sụ cài Itltập đánh giá hoạt tính gen lacZ vi kliuẩn B subtilis 34 CHƯƠNG III KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Thiết kế vector biểu gen vi khuẩn B subtiU s 37 3.1.1 Tách dòng đoạn DNA, bao gằm prom oter rRNA RBS gen spoVG Bacỉllus subtỉlis vector p E T 28b để tạo vector p U L l 39 3.1.2 Tách dịng gen mã hóa cho ịi-gaỉactosidase vector p U L l 42 3.1.3 Tách (lòng đoạn DNA bao gồm promoter PrrnO-RBS gen spoVG-ỉacZ vector pDG364 để tạo vector p U L 44 3.2 Cài nhập biêu gen lacZ vi khuân B su b tỉlis 48 3.2.1 Cài nliập gen vào nhiễm sắc thể vi khuẩn B subtiỉis PY79 48 3.2.2 Địnlì lượng hoạt dộ p-galactosidase chất ONPG 50 KẾT LUẬN 53 KIÉN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHÀN I BAO CA O TOM TA'] Báo cáo tóm tắt tiếng Việt Tên đề tài: Thiết kế vector biếu gen vi khuẩn B subtiỉis M ã số: Q G 10.22 Thòi gian thực hiện: năm (2010 - 2012) Cấp quản lý: Đại học Quôc gia Hà nội Chủ trì đề tài: TS Nguyễn Quỳnh Uyển Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - ĐHQGHN Điện thoại: 37547694; Fax: 37547407; Email: uyennq@ vnu.edu.vn Cán tham gia: - ThS Phan Thị Hà - ThS Hoàng Văn Vinh - CN Hoàng Thu Hà Mục tiêu nội dung nghiên cửu Mục tiêu nghiên cứu thiết kế vector biểu gen trons tế bào sinh dưỡng vi khuẩn B s u b tilis mà không cần sử dụne chất căm ứng a Vector dược thiết kế phải có đầy đủ yếu tố sau: • Promotor: m n h , hoạt độna liên tục cùa B subtilis để gen cài đặt có thè biêu mà khơng cân sử dụna chât cảm ứng (inđucer) • Vị tr í bám ribosome: vị trí bám tố t een b i ể u mạnh vi khuấn B subtilis • VỊ trí cắt da diêm: có vị trí căt đa điêm enzym e giới hạn thương phẩm phổ biến • Vector thiêt kê phải có đoạn tươne đơng với nhiễm săc thể vi khuân B s u b tiìis để cỏ thể xảy trao đổi chéo kép vector nhiễm sắc thể vi khn • Có dấu chuẩn để sàng lọc vi sinh vật đ ợ c biến nạp vector b Sau dó vector thiết lập sử dụng để biếu gen đích Các kết đạt đuọc 8.1 Kết mặt khoa học - Đã xác định thành công promoter biểu liên tục không cần sử dụng chât cảm ứng (rrnO P2) để thiết lập'trong vector biểu - Đã xây dựng thành cơng vector biểu gen vi khuẩn tì su b tilis PY79 với đặc diêm câu trúc sau: • Promoter: rrnO P2, promoter mạnh, biểu liên tục điều khiển sinh tổng hợp rRNA • RBS trình tự RBS biết gen sp o V G , gen hoạt động mạnh pha log • Chứa mã mở đầu ATG • Chứa codon mã hóa cho His Tag sau mã mở đầu để dễ dàng tinh protein đích sử dụng cột His Tag sau vị trí vị trí cắt đặc hiệu thrombin (L eucine-V aline-Proline-A rgỉnine-G lycine-Serine) để loại bỏ cách hiệu His khỏi protein đích • Gen chọn lọc c a t mã hóa cho chloramphenicol acetvltransíerase đê sàng lọc thể biến nạp • Đoạn a m y E f a m y E b tương đồng với a m y E nhiễm sắc thê B s u b tilis PY79 để tham gia vào q trình trao đổi chéo kép • MCS có enzym e giới hạn phổ biến: s N h e I, E c o R V , S a c ỉ, S a l I H i n ỉ ỉỉ Sử dụng enzym e giới hạn N h e ỉ £ co R V kết hợp với S a c ỉ , S a il H in ả ỉỉỉ để cài nhập biểu gen đích B s u b tilis PY79 - Biểu thành cơng gen mã hóa cho p-galactosidase tế bào sinh dường B s u b tilis PY79 mà không cần sử dụng chất cảm ứng hoạt độ tương đối cao 8.2 Kết đào tạo 01 T h csỹ: N guyễn Thị Thúy: Đã bảo vệ ngày 18 tháng năm 2012 Tên khóa luận: “Biểu gen mã hóa cho p-galactosidase vi khuẩn B s u b tilis " 02 c nhãn: N guyễn Thị H oa: Đã bảo vệ nầy 13 thánụ năm 2012 Tên khóa luận: “Thiết kế vector chứa promoter rrnO vị trí bám ribosome cua gen s p o V G B s u b tilis tách dòng gen mã hóa cho P-galactosidase vector này” Trần Tlíị Trang: Đã bảo vệ ngày tháne, năm 2012 Tên khóa luận: “B iểu gen mã hóa cho p-galactosidase vi khuẩn B s u b tilis " 8.3 Bài báo ❖ Nguyễn Quỳnh Uyển, Trần Thị Trang, Phan Thị Hà, N guyễn Huỳnh Minh Quyên, Biểu gen mã hóa cho (3-galatosidase tế bào sinh dưỡng vi khuẩn B a c illu s s u b tilis , T ạp c h í K h o a h ọ c v C ô n g n g h ệ , Đại học Quốc gia Hà Nội (đã nhận đăng) ❖ Hoàng Thu Hà, Phan Thị Hà, Nguyễn Quỳnh Uyển (2011), Thiết kế vector có chứa promoter vị trí bám ribosome vi khuẩn B a c ilìu s s u b tilis tách dòng gen la c Z vector trên, T p c h í D i tr u y ề n h ọ c v n g d ụ n g , chuyên san Công nghệ Sinh học, trang 1-6 Tình hình sử dụng kinh phí - Tổng kinh phí đề tài duyệt: (Tiết kiệm chi 5.100.000 đ), thực nhận: - Tổng kinh p h í đ ề tài tốn: 140.000.000 VNĐ 134.900.000 V NĐ 134.900.000 V N Đ , bao g m mục: + Chi phí thuê mướn: 62.000.000 + Chi phí nghiệp vụ chun mơn: 66.954.000 + Photo tài liệu, văn phòng phẩm, chi khác: 3.446.000 + Quản lý phí: 2.500.000 Xác nhận co quan Chủ trì đề tài SU M M AR Y Projcct title: Establising an expression vector in B subtilis Code: QG 10.22 Duration: years (2010 - 2012) Organizer: Institute o f M icrobiology and Biotechnology Vietnam National University Hanoi (V N U H ) Project leader: Dr Nguyen Quynh Uyen Key participants: - MSc Phan Thi Ha - M Sc Hoang Van Vinh - BSc Hoang Thu Ha Objectives and study contents Objectives: the aim o f this project is establishing a vector, which is capable o f expressing a gene in the vegetative cells o f bacterium B s u b tilis without the use o f inducer Study contents a The vector should contain the elem ents as follows: • Promotor: strong and constitutive one o f B s u b tilis so the gene inserted can express without inducer • RBS: is a known RBS o f a strongly expressed gene in B s u b tilis • MCS: is based on the MCS o f commercial pET28b vector • The expression vector, which has been established, should have fragments hom ologous with those o f chromosome o f B s u b tilis in order to occur double crossover betw een this vector and bacterial chrom osom e • Selectable marker to select the bacteria transformed with the vector b The vector, which has been established, should be used to express a target gene The obtained results - Successful determining constitutive promoter rrnO P2 in order to create it into the expression vector - Successful creating the vector expressed a target gene in bacterium B s u b tilis PY79 with special features as follow s: • Promoter: rrnO P2 is a strong and constitutive one o f B s u b tilis , and it regulates synthesis o f rRNA • RBS is known sequence RBS o f gene s p o V G , strongly expressed at exponential phase • Containing the start codon ATG • Containing the codon encoding for His Tag behind the start codon to satisfy the purification o f the target protein by using His Tag colum n, and behind is the position o f specific cleaving o f thrombin (L eueine-V aline-P roline-A rginineG lycine-Serine) which can be used to remove His effectively from the target protein • Selectable cat encoding for chloramphenicol transformants acetyltransferase to select Ị ■~ C ó b o k h o a h ọ c đ ợ c c ô n g bố tạp c h í k h o a h ọ c c h u y ê n n g n h q u ố c t ế c ó u y tín 5~ Đ e x u ấ t l ý t h u y ế t , l ý l u ậ n , p h n g p h p n g h i ê n c u m i c ó g i trị khoa hoc k ế t q u ả n g h iê n c ứ u c ó ý n g h ĩa q u a n tr ọ n g đ ố i v ó i th ự c tiễn , đư ợ c ị c h u y ê n g ia o ứ n g d ụ n g ( c ó văn bàn x c n h ậ n ) Ị Có luận án T i ế n sĩ củ a N C S bảo vệ th àn h c ô n g phù hợ p với h n g v v ậ n d ụ n g n g h i ê n c ứ u c ù a đ ề tà i C ó s ố c c c n g tr ìn h đ ợ c c n g b ố v ọ t t r ộ i s o v ó i đ ă n g k ý ( í t n h ấ t c n g t r ìn h h o ặ c s c h c h u y ê n k h ả o ) T ông cộng 100 ( * * * ) T ỏn g s o đ iế m c u a c c m ụ c III xếp loại Đ e tà i (đ ả n h d ấ u Vv o K h ( Đ t t ổ n g đ i ể m tù' ỏ tư n g ứ n g p h ù h ợ p , b ắ t b u ộ c ): trò lên ) dến 85 đ iể m ) T r u n g b ì n h (Đ t t ổ n g đ iề m từ * □ dến 69 đ iềm ) K hông đạt 'jgr