biểu hiện β-galactosidase trong vi khuẩn bacillus subtilis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thúy BIỂU HIỆN β-GALACTOSIDASE TRONG VI KHUẨN Bacillus subtilis TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1. Sơ lƣợc về vi khuẩn B. subtilis 2 1.1. Lịch sử, đặc điểm phân loại theo hệ thống Bergey, đặc điểm hình thái và sự phân bố của vi khuẩn B. subtilis 2 1.2. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn B. subtilis 3 1.3. Cấu trúc genome 5 1.4. Tính an toàn và ứng dụng của B. subtilis 6 2. Cấu trúc operon lac, gen lacZ và β- galactosidase. 9 2.1. Cấu trúc operon lac 9 2.2. Gen lacZ và β-galactosidase 12 3. Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn 16 3.1. Đặc điểm của plasmid 16 3.2. Những vector tách dòng và vector biểu hiện trong E. coli 18 3.3. Vector biểu hiện trong B. subtilis 21 3.3.1. Hệ thống vector biểu hiện pHT 21 3.3.2. Hệ thống vector biểu hiện pAL 22 3.4 Cài nhập vector biểu hiện vào B. subtilis 22 3.4.1. Cơ chế của quá trình cài nhập vào B. subtilis 23 3.4.2. Các kiểu cài nhập vào B. subtilis 24 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 27 2.1 Nguyên liệu và thiết bị 27 2.1.1. Tế bào và plasmid 27 2.1.2. Hóa chất 28 2.1.3. Môi trường nuôi cấy 29 2.1.4. Thiết bị thí nghiệm 29 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 30 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 30 2.2.2. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 30 2.2.3 Các phương pháp sinh học phân tử 31 2.2.4. Các phương pháp hóa sinh 35 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Thiết kế vector pUL1(PrrnO-RBS (spoVG)) dựa trên vector pET28b 37 3.2 Nhân dòng gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase trong vector pUL1 41 3.2.1. Khuếch đại gen lacZ từ vector pDG268 41 3.2.2. Nhân dòng gen lacZ trong vector pUL1 42 3.3 Nhân dòng đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong vector pDG364 tạo pUL2 44 3.3.1. Khuếch đại đoạn DNA gồm promoter PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong pUL1 44 3.3.2. Nhân dòng đoạn PrrnO-RBS(spoVG)-lacZ trong vector pDG364 46 3.4 Cài nhập đoạn PrrnO-RBS(spoVG)-lacZ trong vector pDG364 vào genome của B. subtilis PY79 và kiểm tra sự cài nhập này 48 3.4.1. Cài nhập đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong vector pDG364 vào genome vi khuẩn B. subtilis 48 3.4.2 Kiểm tra sự cài nhập 49 3.5. Xác định hoạt độ của enzyme β-galactosidase 50 3.5.1. Xác định hoạt tính β-galactosidase bằng cơ chất X-gal 51 3.5.2. Xác định hoạt độ β-galactosidase với cơ chất ONPG 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 KẾT LUẬN: 54 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh B. subtilis [41, 68] 3 Hình 1.2. Hình ảnh bào tử B. subtilis với các độ phóng đại khác nhau [69, 76, 77] 4 Hình 1.3. Cơ chế thủy phân của enzyme β- galactosidase 10 Hình 1.4. Cấu trúc operon lac [70] 10 Hình 1.5. Cơ chế điều hòa của operon lac 12 Hình 1.6. Cấu trúc của β-galactosidase ở E. coli [66, 67] 13 Hình 1.7. Cơ chế thủy phân X-gal của enzyme β-galactosidase [71] 14 Hình 1.8. Sơ đồ minh họa một tế bào vi khuẩn chứa plasmid ở bên trong 16 (1) DNA nhiễm sắc thể, (2) Plasmid 16 Hình 1.9. Mô hình đoạn DNA của vector pHV32 đƣợc chèn vào nhiễm sắc thể của B. subtilis [35] 23 Hình 1.10. Mô hình trao đổi chéo đơn (single crossover) minh họa việc sử dụng một vector cài nhập cơ bản để xây dựng một đột biến knockout trong một khung đọc mở (orfA) [11] 24 Hình 1.11. Mô hình trao đổi chéo kép (double crossover) minh họa việc sử dụng một vector cài nhập (ectopic integration vector) để chèn một khung đọc mở (orfA) vào trong vị trí đích trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn B. subtilis [11] 25 Hình 3.1. Kết quả khuếch đại đoạn PrrnO từ genome của B. subtilis 38 Hình 3.2. Sơ đồ tạo vector pUL1 39 Hình 3.3. Kết quả PCR colony kiểm tra đoạn chèn PrrnO các khuẩn lạc thu đƣợc 40 Hình 3.4. Kết quả khuếch đại đoạn lacZ từ vector pDG268 42 Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR colony kiểm tra đoạn lacZ chèn trong plasmid pUL1 của 5 khuẩn lạc 43 Hình 3.6. Kết quả điện di trên gel agarose 1% kiểm tra sản phẩm chèn lacZ vào pUL1 44 Hình 3.7. Kết quả PCR khuếch đại đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ từ pUL1-lacZ 45 Hình 3.8. Sơ đồ tạo vector pUL2 46 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm cắt pUL2 47 Hình 3.10. Sơ đồ cài nhập đoạn PrrnO- RBS (spoVG)-lacZ từ vector pUL2 vào genome của B. subtilis PY79 49 Hình 3.11. Kết quả thử hoạt tính amylase trên môi trƣờng tinh bột (0,1%) của thể biến nạp 50 Hình 3.12. Kết quả thử hoạt tính β-galactosidasetrênđĩa có bổ sung X-gal 51 Hình 3.13. Xác định hoạt độ β-galactosidase trong các chủng 2, 4 và 7 tại thời điểm 12h 52 Hình 3.14. Biểu đồ hoạt độ β-galactosidase của các thể tái tổ hợp tại các thời điểm khác nhau 52 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme β-galactosidase [50] 15 Bảng 1.2. Một số vector thƣơng mại dùng tách dòng và biểu hiện trong E. coli [75] 20 Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng 27 Bảng 2.3. Thành phần các loại đệm và dung dịch 28 Bảng 2.4. Các thiết bị thí nghiệm 29 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR 32 Bảng 2.6. Các thành phần, điều kiện của phản ứng nối ghép gen 33 Bảng 3.1.Thành phần, điều kiện phản ứng PCR PrrnO 38 Bảng 3.2. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR lacZ 41 Bảng 3.3. Thành phần phản ứng cắt lacZ và pUL1 42 Bảng 3.4.Thành phần phản ứng nối lacZ và pUL1 43 Bảng 3.5. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ 45 Bảng 3.6. Thành phần và điều kiện cắt pDG364 48 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ CÁC TỪ VIẾT TẮT amyEb Phần gen amyE phía sau amyEf Phần gen amyE phía trƣớc β-gal β-galactosidase BGSC Bacillus Genetic Stock Center BLAST Basic local alignment search tool bp base pair CFU Colony forming unit dNTP 2-Deoxynucleoside 5-triphosphate DSM Difco Sporulation Medium E. coli Escherichia coli EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid EtBr Ethidium bromide IPTG Isopropyl β-D- thiogalactoside kbp Kilo base pair kDa Kilo Dalton LB Luria Bertani M Marker MCS Multiple cloning site NAD Nicotinamide adenine dinucleotide OD Optical density ONPG Ortho-netrophenol-β-galactosidase PCR Polymerase Chain Reaction RBS Ribosome binding site rRNA Ribosome Ribonucleic acid Sol Solution TAE Tris - Acetate - EDTA U Unit v/v volume/volume w/v Weight/volume X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ 1 MỞ ĐẦU Hiện nay, phần lớn các hệ vector (cả hệ vector nhân dòng và vector biểu hiện) cho Escherichia coli đều đã đƣợc thƣơng mại hóa [75]. Tuy nhiên, E. coli đƣợc xem là sinh vật có khả năng gây bệnh và tiết độc tố. Chính vì vậy, việc sử dụng E. coli nhƣ tế bào vật chủ để biểu hiện gen còn nhiều hạn chế. Bên cạnh đó, Bacillus subtilis, đại diện tiêu biểu của nhóm vi sinh vật Gram dƣơng, với vai trò là tế bào vật chủ, đã thể hiện nhiều ƣu điểm hơn so với E. coli. Đó là khả năng không gây bệnh (B. subtilis đƣợc Hiệp hội Thuốc và Thực phẩm của Mỹ FDA coi là “genereally regarded as safe”- GRAS) và khả năng chịu đựng các điều kiện nuôi cấy, bảo quản khắc nghiệt hơn [18, 25]. Trong nghiên cứu cơ bản, B. subtilis đã đƣợc sử dụng nhƣ mô hình để nghiên cứu khả năng biệt hoá và cơ chế điều hoà hoạt động của gen trong tế bào [24]. Trong hƣớng phát triển các vacxin thế hệ mới, B. subtilis đã đƣợc phát hiện và nghiên cứu nhƣ một công cụ chuyển kháng nguyên an toàn và tiềm năng [19, 17, 59]. Mặc dù có nhiều ƣu điểm với vai trò là tế bào vật chủ so với E. coli nhƣng các vector thƣơng phẩm dùng cho việc tách dòng và biểu hiện gen sử dụng cho vi khuẩn B. subtilis vẫn chƣa xuất hiện rộng rãi trên thị trƣờng. Nguyên nhân là gen ngoại lai cần đƣợc cài nhập thẳng vào nhiễm sắc thể của vi sinh vật này, và gen ngoại lai cần phải có đầy đủ các yếu tố cần thiết cho việc biểu hiện gen. Ở Việt Nam, cho đến thời điểm này mới chỉ có rất ít các công trình nghiên cứu về biểu hiện gen trong B. subtilis nhƣ biểu hiện gen trên vỏ bào tử [14], hoặc biểu hiện gen trong tế bào sinh dƣỡng, có sử dụng chất cảm ứng IPTG [7] và vẫn chƣa có nghiên cứu nào công bố về việc biểu hiện gen trong tế bào sinh dƣỡng của B. subtilis mà không cần sử dụng chất cảm ứng. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Biểu hiện β-galactosidase trong vi khuẩn B. subtilis” với mục đích biểu hiện gen trong tế bào sinh dƣỡngs, mà không cần sử dụng chất cảm ứng nhằm góp phần mở rộng khả năng ứng dụng vi sinh vật an toàn này trong lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng. Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Sơ lƣợc về vi khuẩn B. subtilis 1.1. Lịch sử, đặc điểm phân loại theo hệ thống Bergey, đặc điểm hình thái và sự phân bố của vi khuẩn B. subtilis Vào năm 1835, vi khuẩn B. subtilis (tên ban đầu là Vibrio subtilis) đƣợc phát hiện bởi Christian Gottfried Ehrenberg. Sau đó, (năm 1872) Ferdinand Cohn đã phân loại và đổi tên thành B. subtilis [69]. B. subtilis là một trong những vi khuẩn đầu tiên đƣợc nghiên cứu nhƣ mô hình của quá trình biệt hóa và phát triển tế bào. Theo hệ thống phân loại của Bergey (1994) thì B. subtilis thuộc: Giới (regnum): Bacteria Ngành (divisio): Firmicutes Lớp (class): Bacilli Bộ (ordo): Bacillales Họ (familia): Bacillaceae Chi (genus): Bacillus Loài: B. subtilis Năm 2011, Rooney và cộng sự đã phát hiện thêm một chủng nữa của loài B. subtilis là B. subtilis subsp. inaquosorum. Nhƣ vậy, hiện nay có ba phân loài (subspecies) là B. subtilis subsp. inaquosorum, B. subtilis subsp. spizizenii và B. subtilis subsp. subtilis [69, 10, 56]. B. subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram dƣơng, kích thƣớc 0,41-0,58 µm X 1,5–3 µm, đứng đơn lẻ hay tạo thành chuỗi ngắn. B. subtilis có khả năng di động (có từ 8 - 12 tiên mao) và có khả năng sinh nội bào tử (hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào). B. subtilis có khả năng thích nghi với môi trƣờng bằng cách hấp thu các DNA ngoại lai tạo DNA tái tổ hợp hoặc nội bào tử B. subtilis phát triển bằng cách nảy chồi [13, 72]. Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ 3 Hình 1.1. Hình ảnh B. subtilis [41, 68] B. subtilis là tế bào hình que, tiêu biểu cho nhóm vi khuẩn Gram dƣơng, đƣợc tìm thấy tự nhiên trong đất và thảm thực vật mục, trong thực phẩm hỏng, trong không khí và cả trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời và động vật. Số lƣợng vi khuẩn B. subtilis trong đất khoảng 10 6 - 10 7 CFU/g [72]. Nhiệt độ tối ƣu để nó phát triển là 25 0 C đến 35 0 C [72]. Khi gặp điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt, B. subtilis có khả năng hình thành bào tử. Thông thƣờng đến 60% B. subtilis tìm thấy trong đất tồn tại ở dạng bào tử [72]. Vi khuẩn B. subtilis là vi khuẩn hiếu khí. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng B. subtilis thực sự có thể phát triển trong điều kiện yếm khí [44]. Các vi khuẩn có thể tạo ra ATP trong điều kiện yếm khí thông qua quá trình lên men butanediol hay sử dụng ammoni nitrate [44]. B. subtilis khác với các vi khuẩn yếm khí tùy ý khác ở chỗ nó trải qua quá trình lên men không có chất nhận điện tử ở bên ngoài [72]. Trong quá trình lên men, sự tái tạo NAD+ chủ yếu qua chất trung gian lactate dehydrogenase (đƣợc tìm thấy trong tế bào chất). Lactate dehydrogenase chuyển hóa pyruvate thành lactate [72]. 1.2. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn B. subtilis Trong các điều kiện môi trƣờng không thuận lợi, vi khuẩn B. subtilis hình thành nội bào tử. Nội bào tử ở trung tâm có kích thƣớc 0,5-0,8 X 0,4 µm. Bào tử trƣởng thành có thể có hình tròn hay hình elip, với chiều dài khoảng 1,5-1,8 µm, có [...]... bào tử B subtilis hoặc biểu hiện gen trong vi khuẩn này bằng cách sử dụng chất cảm ứng IPTG và vẫn chƣa có công trình nào công bố về vi c biểu hiện gen trong tế bào sinh dƣỡng của vi khuẩn B subtilis mà không sử dụng chất cảm ứng Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: Biểu hiện β-galactosidase trong vi khuẩn B subtilis nhằm mở rộng phạm vi ứng dụng của vi sinh vật an toàn này trong cả... đó, để khảo sát đặc tính một enzyme mới ngƣời ta thƣờng lựa chọn biểu hiện trên E coli trƣớc Sau đó, khi sản xuất protein lƣợng lớn thì chuyển sang hệ thống biểu hiện của B subtilis [65, 17, 55, 35] 3.3 Vector biểu hiện trong B subtilis Hiện nay đã có nhiều loại vector thƣơng mại dành cho E coli nhƣng vector dành cho biểu hiện gen trong B subtilis thì mới có một công ty sản xuất (công ty Mobitec) Có hai... và vector biểu hiện trong E coli Escherichia coli hay còn đƣợc gọi là vi khuẩn đại tràng là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đƣờng ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim và động vật có vú) E coli là vi khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý và không hình thành bào tử Các tế bào thƣờng hình que dài khoảng 2,0 µm và đƣờng kính là 0,5 mm E coli thuộc họ Enterobacteriaceae Ƣu điểm của vi khuẩn E... minh họa vi c sử dụng một vector cài nhập (ectopic integration vector) để chèn một khung đọc mở (orfA) vào trong vị trí đích trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn B subtilis [11] Ở Vi t Nam, đã có một số nghiên cứu về tách dòng và bƣớc đầu biểu hiện enzyme ngoại bào trong B subtilis Báo cáo của Quyền Đình Thi và cộng sự năm 2008 về “Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa β-galactosidase từ chủng B subtilis. .. vào thực phẩm [9] 3 Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn 3.1 Đặc điểm của plasmid Ở vi khuẩn và một số nấm men, ngoài các gen nằm trong genome còn có các yếu tố di truyền ngoài thể nhiễm sắc, gọi là plasmid Plasmid là các phân tử DNA mạch đôi dạng vòng, đôi khi có mạch thẳng hay đƣợc cấu tạo bởi RNA nằm ngoài DNA nhiễm sắc thể [80] (hình 1.8) Nó thƣờng có trong tế bào vi khuẩn, đôi khi cũng có ở sinh... đƣợc khắc phục phần lớn bằng vi c do vi c xây dựng chủng thiếu protease Trở ngại thứ hai đƣợc khắc phục hoàn toàn bằng vi c sử dụng plasmid sao chép dạng theta (theta (θ) - mode replication) tƣơng tự các plasmid có nguồn gốc tự nhiên nhƣ pAM β1 và pBS72 [11] Sau đây là một số hệ thống biểu hiện tiêu biểu của B subtilis 3.3.1 Hệ thống vector biểu hiện pHT Có hai vector biểu hiện pHT01 và pHT43 đƣợc thiết... sung B subtilis vào thức ăn của vật nuôi, B subtilis tiết ra các enzyme phân hủy rất hiệu quả các chất trong thức ăn nhƣ carbonhydrate, chất béo và đạm thành những đơn vị nhỏ giúp vật nuôi hấp thụ tốt hơn Ngoài ra, B subtilis có khả năng sinh kháng sinh hạn chế vi khuẩn có hại trong đƣờng ruột và trong môi trƣờng, giúp vật nuôi chuyển hoá hiệu quả thức ăn và khống chế vi khuẩn gây bệnh Do vậy, B subtilis. .. AUG và một trong ba mã kết thúc - Có vị trí cắt đa điểm để đƣa gen ngoại lai vào theo một hƣớng chính xác với promoter (MCS) Chỉ khi đƣợc cấu trúc đầy đủ nhƣ thế, các vector mới có thể biểu hiện gen ngoại lai trong E coli [3] Có nhiều loại vector tách dòng và vector biểu hiện trong E coli đƣợc thƣơng mại hóa Một số vector thƣơng mại dùng tách dòng và biểu hiện trong E coli đƣợc liệt kê trong bảng 1.2... nhau Các enzyme β-galactosidase có nguồn gốc từ vi khuẩn có pH tối ƣu thuộc vùng trung tính, trong khi đó hầu hết β-galactosidase từ nấm mốc có pH thuộc vùng axit, có một số chủng có pH tối ƣu là 2 [48, 49, 16] Để có hoạt tính một số enzyme β-galactosidase thu từ vi khuẩn cần phải có các ion hoá trị 1 và các ion hoá trị 2 nhƣ Mg2+, Mn2+, Na+, K+,… Ví dụ nhƣ enzyme β-galactosidase từ S rectivirgula, E coli,... cứu đã thành công trong vi c biểu hiện một số kháng nguyên trên bề mặt bào tử của B subtilis để sản xuất các vacxin nhƣ vacxin kháng bệnh than, vacxin phòng virus Rota gây bệnh tiêu chảy, vacxin uốn ván, bạch hầu, ho gà,… [61] Do đó, B subtilis đƣợc xem nhƣ nhà máy sản xuất các loại vacxin dạng uống ổn định và an toàn [33, 40, 59] Ở Nhật Bản, một chủng B subtilis đã đƣợc sử dụng trong các món ăn cổ . β-galactosidase 12 3. Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn 16 3.1. Đặc điểm của plasmid 16 3.2. Những vector tách dòng và vector biểu hiện trong E. coli 18 3.3. Vector biểu hiện trong B. subtilis 21 3.3.1 cho vi c biểu hiện gen. Ở Vi t Nam, cho đến thời điểm này mới chỉ có rất ít các công trình nghiên cứu về biểu hiện gen trong B. subtilis nhƣ biểu hiện gen trên vỏ bào tử [14], hoặc biểu hiện. cần sử dụng chất cảm ứng. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: Biểu hiện β-galactosidase trong vi khuẩn B. subtilis với mục đích biểu hiện gen trong tế bào sinh dƣỡngs, mà không cần sử dụng