biểu hiện β-galactosidase trong vi khuẩn bacillus subtilis

subtilis đã được sử dụng như mô hình để nghiên cứu khả năng biệt hoá và cơ chế điều hoà hoạt động của gen trong tế bào [24].. Nguyên nhân là gen ngoại lai cần được cài nhập thẳng vào nh

-

Nguyễn Thị Thúy

BIỂU HIỆN β-GALACTOSIDASE

TRONG VI KHUẨN Bacillus subtilis

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1 Sơ lược về vi khuẩn B subtilis 2

1.1 Lịch sử, đặc điểm phân loại theo hệ thống Bergey, đặc điểm hình thái và sự phân bố của vi khuẩn B subtilis 2

1.2 Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn B subtilis 3

1.3 Cấu trúc genome 5

1.4 Tính an toàn và ứng dụng của B subtilis 6

2 Cấu trúc operon lac, gen lacZ và β- galactosidase 9

2.1 Cấu trúc operon lac 9

2.2 Gen lacZ và β-galactosidase 12

3 Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn 16

3.1 Đặc điểm của plasmid 16

3.2 Những vector tách dòng và vector biểu hiện trong E coli 18

3.3 Vector biểu hiện trong B subtilis 21

3.3.1 Hệ thống vector biểu hiện pHT 21

3.3.2 Hệ thống vector biểu hiện pAL 22

3.4 Cài nhập vector biểu hiện vào B subtilis 22

3.4.1 Cơ chế của quá trình cài nhập vào B subtilis 23

3.4.2 Các kiểu cài nhập vào B subtilis 24

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 30

2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 30

2.2.3 Các phương pháp sinh học phân tử 31

2.2.4 Các phương pháp hóa sinh 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Thiết kế vector pUL1(PrrnO-RBS (spoVG)) dựa trên vector pET28b 37

3.2 Nhân dòng gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase trong vector pUL1 41

3.2.1 Khuếch đại gen lacZ từ vector pDG268 41

3.2.2 Nhân dòng gen lacZ trong vector pUL1 42

3.3 Nhân dòng đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong vector pDG364 tạo pUL2 44

3.3.1 Khuếch đại đoạn DNA gồm promoter PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong pUL1 44

3.3.2 Nhân dòng đoạn PrrnO-RBS(spoVG)-lacZ trong vector pDG364 46

3.4 Cài nhập đoạn PrrnO-RBS(spoVG)-lacZ trong vector pDG364 vào genome của B subtilis PY79 và kiểm tra sự cài nhập này 48

3.4.1 Cài nhập đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong vector pDG364 vào genome vi khuẩn B subtilis 48

3.4.2 Kiểm tra sự cài nhập 49

3.5 Xác định hoạt độ của enzyme β-galactosidase 50

3.5.1 Xác định hoạt tính β-galactosidase bằng cơ chất X-gal 51

3.5.2 Xác định hoạt độ β-galactosidase với cơ chất ONPG 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

KẾT LUẬN: 54

KIẾN NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh B subtilis [41, 68] 3

Hình 1.2 Hình ảnh bào tử B subtilis với các độ phóng đại khác nhau [69, 76, 77] 4

Hình 1.3 Cơ chế thủy phân của enzyme β- galactosidase 10

Hình 1.4 Cấu trúc operon lac [70] 10

Hình 1.5 Cơ chế điều hòa của operon lac 12

Hình 1.6 Cấu trúc của β-galactosidase ở E coli [66, 67] 13

Hình 1.7 Cơ chế thủy phân X-gal của enzyme β-galactosidase [71] 14

Hình 1.8 Sơ đồ minh họa một tế bào vi khuẩn chứa plasmid ở bên trong 16

(1) DNA nhiễm sắc thể, (2) Plasmid 16

Hình 1.9 Mô hình đoạn DNA của vector pHV32 đƣợc chèn vào nhiễm sắc thể của B subtilis [35] 23

Hình 1.10 Mô hình trao đổi chéo đơn (single crossover) minh họa việc sử dụng một vector cài nhập cơ bản để xây dựng một đột biến knockout trong một khung đọc mở (orfA) [11] 24

Hình 1.11 Mô hình trao đổi chéo kép (double crossover) minh họa việc sử dụng một vector cài nhập (ectopic integration vector) để chèn một khung đọc mở (orfA) vào trong vị trí đích trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn B subtilis [11] 25

Hình 3.1 Kết quả khuếch đại đoạn PrrnO từ genome của B subtilis 38

Hình 3.2 Sơ đồ tạo vector pUL1 39

Hình 3.3 Kết quả PCR colony kiểm tra đoạn chèn PrrnO các khuẩn lạc thu đƣợc 40

Hình 3.4 Kết quả khuếch đại đoạn lacZ từ vector pDG268 42

Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm cắt pUL2 47

Hình 3.10 Sơ đồ cài nhập đoạn PrrnO- RBS (spoVG)-lacZ từ vector pUL2 vào genome của B subtilis PY79 49

Hình 3.11 Kết quả thử hoạt tính amylase trên môi trường tinh bột (0,1%) của thể biến nạp 50 Hình 3.12 Kết quả thử hoạt tính β-galactosidasetrênđĩa có bổ sung X-gal 51 Hình 3.13 Xác định hoạt độ β-galactosidase trong các chủng 2, 4 và 7 tại thời điểm 12h 52 Hình 3.14 Biểu đồ hoạt độ β-galactosidase của các thể tái tổ hợp tại các thời điểm khác nhau 52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme β-galactosidase [50] 15

Bảng 1.2 Một số vector thương mại dùng tách dòng và biểu hiện trong E coli [75] 20

Bảng 2.1 Các plasmid sử dụng 27

Bảng 2.3 Thành phần các loại đệm và dung dịch 28

Bảng 2.4 Các thiết bị thí nghiệm 29

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 32

Bảng 2.6 Các thành phần, điều kiện của phản ứng nối ghép gen 33

Bảng 3.1.Thành phần, điều kiện phản ứng PCR PrrnO 38

Bảng 3.2 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR lacZ 41

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng cắt lacZ và pUL1 42

Bảng 3.4.Thành phần phản ứng nối lacZ và pUL1 43

Bảng 3.5 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ 45

Bảng 3.6 Thành phần và điều kiện cắt pDG364 48

CÁC TỪ VIẾT TẮT

amyEb Phần gen amyE phía sau

amyEf Phần gen amyE phía trước

β-gal β-galactosidase

BGSC Bacillus Genetic Stock Center

BLAST Basic local alignment search tool

CFU Colony forming unit

dNTP 2-Deoxynucleoside 5-triphosphate

DSM Difco Sporulation Medium

E coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid

EtBr Ethidium bromide

IPTG Isopropyl β-D- thiogalactoside

MCS Multiple cloning site

NAD Nicotinamide adenine dinucleotide

ONPG Ortho-netrophenol-β-galactosidase

PCR Polymerase Chain Reaction

RBS Ribosome binding site

rRNA Ribosome Ribonucleic acid

MỞ ĐẦU

Hiện nay, phần lớn các hệ vector (cả hệ vector nhân dòng và vector biểu

hiện) cho Escherichia coli đều đã được thương mại hóa [75] Tuy nhiên, E coli

được xem là sinh vật có khả năng gây bệnh và tiết độc tố Chính vì vậy, việc sử

dụng E coli như tế bào vật chủ để biểu hiện gen còn nhiều hạn chế Bên cạnh đó, Bacillus subtilis, đại diện tiêu biểu của nhóm vi sinh vật Gram dương, với vai trò là

tế bào vật chủ, đã thể hiện nhiều ưu điểm hơn so với E coli Đó là khả năng không gây bệnh (B subtilis được Hiệp hội Thuốc và Thực phẩm của Mỹ FDA coi là

“genereally regarded as safe”- GRAS) và khả năng chịu đựng các điều kiện nuôi

cấy, bảo quản khắc nghiệt hơn [18, 25] Trong nghiên cứu cơ bản, B subtilis đã

được sử dụng như mô hình để nghiên cứu khả năng biệt hoá và cơ chế điều hoà hoạt

động của gen trong tế bào [24] Trong hướng phát triển các vacxin thế hệ mới, B subtilis đã được phát hiện và nghiên cứu như một công cụ chuyển kháng nguyên an

toàn và tiềm năng [19, 17, 59] Mặc dù có nhiều ưu điểm với vai trò là tế bào vật

chủ so với E coli nhưng các vector thương phẩm dùng cho việc tách dòng và biểu hiện gen sử dụng cho vi khuẩn B subtilis vẫn chưa xuất hiện rộng rãi trên thị

trường Nguyên nhân là gen ngoại lai cần được cài nhập thẳng vào nhiễm sắc thể của vi sinh vật này, và gen ngoại lai cần phải có đầy đủ các yếu tố cần thiết cho việc biểu hiện gen

Ở Việt Nam, cho đến thời điểm này mới chỉ có rất ít các công trình nghiên

cứu về biểu hiện gen trong B subtilis như biểu hiện gen trên vỏ bào tử [14], hoặc

biểu hiện gen trong tế bào sinh dưỡng, có sử dụng chất cảm ứng IPTG [7] và vẫn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Sơ lược về vi khuẩn B subtilis

1.1 Lịch sử, đặc điểm phân loại theo hệ thống Bergey, đặc điểm hình thái

và sự phân bố của vi khuẩn B subtilis

Vào năm 1835, vi khuẩn B subtilis (tên ban đầu là Vibrio subtilis) được phát

hiện bởi Christian Gottfried Ehrenberg Sau đó, (năm 1872) Ferdinand Cohn đã

phân loại và đổi tên thành B subtilis [69] B subtilis là một trong những vi khuẩn

đầu tiên được nghiên cứu như mô hình của quá trình biệt hóa và phát triển tế bào

Theo hệ thống phân loại của Bergey (1994) thì B subtilis thuộc:

Giới (regnum): BacteriaNgành (divisio): FirmicutesLớp (class): Bacilli

Bộ (ordo): Bacillales

Họ (familia): BacillaceaeChi (genus): Bacillus

Loài: B subtilis Năm 2011, Rooney và cộng sự đã phát hiện thêm một chủng nữa của loài B subtilis là B subtilis subsp inaquosorum Như vậy, hiện nay có ba phân loài (subspecies) là B subtilis subsp inaquosorum, B subtilis subsp spizizenii và B subtilis subsp subtilis [69, 10, 56]

B subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram dương, kích thước 0,41-0,58 µm X 1,5–3 µm, đứng đơn lẻ hay tạo thành chuỗi ngắn B subtilis

có khả năng di động (có từ 8 - 12 tiên mao) và có khả năng sinh nội bào tử (hình

bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào) B subtilis có khả năng thích

nghi với môi trường bằng cách hấp thu các DNA ngoại lai tạo DNA tái tổ hợp hoặc

nội bào tử B subtilis phát triển bằng cách nảy chồi [13, 72]

Hình 1.1 Hình ảnh B subtilis [41, 68]

B subtilis là tế bào hình que, tiêu biểu cho nhóm vi khuẩn Gram dương,

được tìm thấy tự nhiên trong đất và thảm thực vật mục, trong thực phẩm hỏng, trong không khí và cả trong đường tiêu hóa của người và động vật Số lượng vi

khuẩn B subtilis trong đất khoảng 106 - 107 CFU/g [72] Nhiệt độ tối ưu để nó phát triển là 250C đến 350C [72] Khi gặp điều kiện môi trường khắc nghiệt, B subtilis

có khả năng hình thành bào tử Thông thường đến 60% B subtilis tìm thấy trong đất

tồn tại ở dạng bào tử [72]

Vi khuẩn B subtilis là vi khuẩn hiếu khí Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng B subtilis thực sự có thể phát triển trong điều kiện yếm khí [44] Các

vi khuẩn có thể tạo ra ATP trong điều kiện yếm khí thông qua quá trình lên men

butanediol hay sử dụng ammoni nitrate [44] B subtilis khác với các vi khuẩn yếm

khí tùy ý khác ở chỗ nó trải qua quá trình lên men không có chất nhận điện tử ở bên ngoài [72] Trong quá trình lên men, sự tái tạo NAD+ chủ yếu qua chất trung gian

bề mặt tích điện âm và hơi kỵ nước [73] Bảo tử có cấu trúc đặc biệt bao gồm cấu trúc lõi và các lớp vỏ xung quanh Cấu trúc lõi là nhiễm sắc thể ở trạng thái bị nén chặt và bất hoạt Các lớp vỏ xung quanh lõi tính từ trong ra ngoài bao gồm lớp cortex chứa nhiều peptidoglycan, tiếp đến là các lớp vỏ có chứa các loại protein khác nhau Vì vậy, nội bào tử có tính kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, phóng xạ,…[68, 31]

Hình 1.2 Hình ảnh bào tử B subtilis với các độ phóng đại khác nhau [69, 76, 77]

Sự hình thành bào tử xảy ra trong nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất Đầu tiên, nucleotid kéo dài trở thành một sợi trục Sau đó, tế bào hình thành một vách ngăn và bắt đầu phân chia thành hai phần Phần nhỏ hơn của tế bào được gọi là các tiền bào tử (forespore) và phần lớn hơn được gọi là tế bào mẹ [54]

Tế bào mẹ nuôi dưỡng tiền bào tử Khi hình thành vách ngăn, 30% số nhiễm sắc thể

đã nằm bên trong tế bào mẹ, 70% nhiễm sắc thể còn lại chuyển vào tiền bào tử thông qua một loại protein vận chuyển được gọi là SpoIIIE [60] Các tế bào mẹ chứa các bào tử bên trong bằng cách thực bào Do đó, các tiền bào tử sẽ có hai lớp màng tế bào chất với một lớp murein dày bảo vệ giữa chúng và tế bào mẹ Tại thời điểm này, tiền bào tử sẽ trải qua những thay đổi bên trong Cuối cùng, tiền bào tử tách khỏi tế bào mẹ sau khi tế bào mẹ chết [54] Bào tử trưởng thành không có hoạt động trao đổi chất với môi trường nhưng nó vẫn đáp ứng các tín hiệu dinh dưỡng đặc thù bằng cách nảy chồi khi môi trường giàu chất dinh dưỡng và thuận lợi cho sự phát triển [60, 61]

hoạt động [37, 39] Bộ gen của B subtilis có hơn 74% khung đọc mở và 94% gen ribosome được phiên mã cùng hướng và được sao chép lại Chỉ có 53% các gen của

B subtilis là gen đơn bản, số còn lại thuộc họ đa gen (có 2-77 bản sao) Trong hệ

gen này có khoảng 220 yếu tố điều hòa phiên mã đã được xác định Tuy tất cả các

gen của B subtilis đã được giải trình tự nhưng chỉ khoảng 58% các gen được biết

chức năng, 42% các gen còn lại vẫn chưa biết rõ chức năng và đang được nghiên

cứu [68] Ngoài ra, B subtilis còn chứa nhiều gen liên quan đến các chất chuyển

hóa trung gian và một trong số các chất trung gian đó là kháng sinh Một vài gen mã

hóa protein tiết có vai trò quan trọng đã được xác định và đó là các gen secA, secD, secE, secF, secY, FFh và ftsY [39]

B subtilis có một nhiễm sắc thể duy nhất với chiều dài 2 mm được nén chặt vào một nucleoid đường kính 1 µm [26] Nhiễm sắc thể của B subtilis có duy nhất

1.4 Tính an toàn và ứng dụng của B subtilis

Tính an toàn của B subtilis đối với người và động vật

Ở châu Âu và ở Mỹ, B subtilis được chỉ định là đủ điều kiện về an toàn và

không hề có tác dụng phụ (QPS, Qualified Presumption of Safety) hay GRAS

(Genrally Regarded As Safe) [21] Một số chủng B subtilis và họ hàng gần của nó

là B licheniformis, B pumulis, B megaterium có khả năng sản xuất lecithinase, một

enzyme có khả năng phá vỡ màng động vật có vú Tuy nhiên, vẫn chưa có bằng chứng nào cho thấy lecithinase gây bệnh trên người [21] Trong một số các trường

hợp người ta vẫn phát hiện ra B subtilis ở những bệnh nhân bị ung thư phổi, hoại

thư bạch cầu, áp xe khi lắp bộ phận giả…, nhưng tỉ lệ các trường hợp này là rất

hiếm (chỉ có 2 trong 1034 ca phát hiện có B subtilis) [21] Bacillus anthracis là một loài của Bacillus gây bệnh than nguy hiểm cho người [61, 21]

Hầu hết những loài B subtilis an toàn với động vật Các nghiên cứu cho thấy khi bổ sung B subtilis vào thức ăn của vật nuôi, B subtilis tiết ra các enzyme phân

hủy rất hiệu quả các chất trong thức ăn như carbonhydrate, chất béo và đạm thành

những đơn vị nhỏ giúp vật nuôi hấp thụ tốt hơn Ngoài ra, B subtilis có khả năng

sinh kháng sinh hạn chế vi khuẩn có hại trong đường ruột và trong môi trường, giúp vật nuôi chuyển hoá hiệu quả thức ăn và khống chế vi khuẩn gây bệnh Do

vậy, B subtilis được áp dụng sản xuất probiotic để xử lý môi trường nuôi thủy sản,

xử lý đáy ao, xử lý mùi hôi, xử lý rác thải, phối trộn với thực phẩm tạo hệ men tiêu hóa, phòng ngừa các bệnh đường ruột tăng cường khả năng kích thích miễn dịch,…và được ứng dụng trong ngành nuôi thủy sản và chăn nuôi thú y [46] Sử

dụng chế phẩm có B subtilis trong chăn nuôi là hướng đi có ý nghĩa thực tiễn về khía cạnh bảo vệ môi trường và đảm bảo hiệu quả sản xuất [5, 46]

Ứng dụng của B subtilis trong nghiên cứu cơ bản

Qua nghiên cứu quá trình hình thành bào tử từ tế bào mẹ của B subtilis, các nhà

nghiên cứu đã xây dựng được mô hình biệt hóa tế bào Dựa trên các kết quả thí nghiệm và mô hình toán học, các nhà nghiên cứu của trường Đại học Oxford đã giải

thích cách kích hoạt các yếu tố phiên mã chính Nguyên nhân để xác định con đường biệt hóa tế bào là do sự khác biệt về khối lượng giữa tiền bào tử và tế bào

mẹ [12] Quá trình hình thành bào tử ở B subtilis cần tới sự biểu hiện của hơn 200

gen, các gen này chỉ cần thiết cho quá trình hình thành bào tử mà không cần cho

sự sinh trưởng và sống sót của tế bào sinh dưỡng Thêm nữa, thông qua tìm hiểu

cơ chế điều hòa phiên mã, các nhà nghiên cứu còn giải thích được mô hình điều hòa hoạt động của gen trong tế bào [43] Ban đầu các gen này được phiên mã theo trình tự thời gian Các yếu tố sigma F, E, G, K xuất hiện theo trình tự sẽ quyết định trình tự phiên mã các gen bị chi phối bởi các yếu tố sigma này Các yếu tố sigma đóng vai trò điều khiển quá trình phiên mã các gen đặc thù cho từng loại tế bào Ví dụ, yếu tố sigma F và sigma G điều khiển quá trình phiên mã các gen của tiền bào tử, yếu tố sigma E và sigma K điều khiển quá trình phiên mã các gen của

tế bào mẹ Vì vậy, cơ chế biểu hiện gen có sự phối hợp giữa tiền bào tử và tế bào

mẹ để điều hòa hoạt động của các gen [43]

Ứng dụng của B subtilis trong y học

Do những nhược điểm của các vacxin thế hệ cũ (như yêu cầu nghiêm ngặt về nhiệt độ bảo quản, kỹ thuật sử dụng để đưa vacxin vào cơ thể con người…) đã dẫn đến nhu cầu cấp thiết phải phát triển vacxin thế hệ mới như các vacxin thế hệ thứ

hai và thế hệ thứ ba Trong hướng phát triển này, B subtilis được phát hiện và

được nghiên cứu như công cụ chuyển kháng nguyên an toàn và tiềm năng [19] Gần đây, các nghiên cứu đã thành công trong việc biểu hiện một số kháng nguyên

trên bề mặt bào tử của B subtilis để sản xuất các vacxin như vacxin kháng bệnh

nhiễm khuẩn đường tiết niệu ở người cao tuổi [61, 33] B subtilis có khả năng lây nhiễm và gây chết ấu trùng của muỗi Anophelis aulicifacies (côn trùng chính gây

sốt rét ở Ấn Độ) [28] Do đó, nó được sử dụng như tác nhân kiểm soát sinh học phòng chống bệnh sốt rét

Ứng dụng của B subtilis trong công nghiệp

Trong môi trường dinh dưỡng hạn chế, B subtilis có khả năng sản xuất một

số enzyme (bao gồm cả protease, amylase, cenlulase, lipase, β-galactosidase, nattokinase,….) và kháng sinh [72] Các hãng sản xuất đã dựa vào khả năng tiết các

enzyme của B subtilis như nhà máy để sản xuất các enzyme này trên quy mô công

nghiệp Các enzyme được ứng dụng để sản xuất một số phụ gia trong chất tẩy rửa

và các sản phẩm khác [74] Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn được sản xuất vào năm 1956 với tên BIO-40 Đến nay, tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trường đều là serine protease, được sản xuất từ các chủng

Bacillus và chủ yếu là từ B subtilis Trên thế giới, mỗi năm người ta đã sử dụng

89% các loại enzyme này cho ngành công nghiệp tẩy rửa Trong đó có hai công ty lớn là Novo Nordisk và công ty đa quốc gia Genencor mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lượng enzyme protease [74] Dựa vào khả năng tiết kháng sinh

mà B subtilis đã được sử dụng để sản xuất thuốc kháng sinh (bao gồm cả subtilin,

surfactin, bacillomycin, bacilysin, và fengycin) trên quy mô công nghiệp Các chất

này được sử dụng như thuốc kháng khuẩn và kháng nấm [74] Ngoài ra, B subtilis

đã được sử dụng để chuyển đổi vật liệu nổ thành các hợp chất vô hại vì nó loại bỏ

các chất thải phóng xạ hạt nhân [74] Do khả năng hình thành màng sinh học, B subtilis còn được ứng dụng rộng rãi trong việc chống ô nhiễm và xử lý bằng biện

pháp sinh học trong ngành chế biến thực phẩm Vi khuẩn này cũng giúp làm giảm

ăn mòn thép ở mức độ nhẹ [46]

Ứng dụng của B subtilis trong nông nghiệp

B subtilis được ứng dụng trong nông nghiệp vì chúng tham gia tích cực vào

chu trình cacbon và nitơ, phân hủy vật chất hữu cơ nhờ vào khả năng sinh nhiều loại

enzyme ngoại bào [72] B subtilis có khả năng hình thành các màng sinh học

(biofilm) -lớp màng sinh học này giúp hỗ trợ cho hệ thống thân rễ cạnh tranh với nấm gây bệnh và các loại vi khuẩn có hại cho cây trồng [22, 46] Do vậy, người ta

dùng B subtilis như tác nhân kiểm soát sinh học phòng trừ vi sinh vật (nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Pylicularia oryzae,…) gây bệnh cho cây trồng

như bằng cách ngâm với hạt giống trước khi gieo trồng [61] Một số chủng có họ

gần với vi khuẩn B subtilis như Bacillus thuringiensis có khả năng sản xuất độc tố

đối với côn trùng nên được sử dụng như thuốc diệt ấu trùng chống lại nhiều loại sâu bướmđể bảo vệ mùa màng [22] Xu hướng hiện nay trên thế giới là sử dụng thuốc

trừ sâu có chứa các chủng Bacillus thuringiensis vì nó an toàn với động vật và thân

thiện với môi trường hơn các loại thuốc trừ sâu tổng hợp [63]

2 Cấu trúc operon lac, gen lacZ và β- galactosidase

2.1 Cấu trúc operon lac

Operon lac ở E coli là operon đầu tiên được phát hiện và nghiên cứu khá chi tiết từ năm 1961 bởi Jacob và Monod [2] Operon lac gồm ba gen cấu trúc là lacZ, lacY và lacA nằm kề nhau được điều khiển chung bởi một promoter [70] Hoạt động

của operon này được kiểm soát theo hai cơ chế là tích cực và tiêu cực

Gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase Enzyme này xúc tác phản ứng

thủy phân lactose thành glucose và galactose để cung cấp năng lượng cho tế bào Ngoài ra, β- galactosidase còn chuyển hóa một phần lactose (liên kết β-1,4-D-glycoside của glucose và galactose) thành một đồng phân là allolactose (liên kết β-1,6-D-glycoside của glucose và galactose) Chính allolactose mới là phân tử kích

Hình 1.3 Cơ chế thủy phân của enzyme β- galactosidase

Gen lacY mã hóa cho protein vận chuyển permease Pemease nằm xuyên

màng tế bào vi khuẩn và có vai trò vận chuyển chủ động lactose từ môi trường

ngoại bào vào trong tế bào Gen lacA mã hóa cho enzyme thiogalactoside

transacetylase có vai trò giải độc tế bào đối với các hợp chất thiogalactoside và enzyme thiogalactoside transacetylase cũng được vận chuyển vào tế bào nhờ protein vận chuyển permease [4]

Hình 1.4 Cấu trúc operon lac [70]

Những gen này chỉ được biểu hiện mạnh khi môi trường có lactose và không

có glucose Có hai protein điều hòa tham gia điều khiển hoạt động của operon lac

Đó là protein hoạt hóa CAP và protein ức chế LacI Gen mã hóa CAP (Catabolite

Activator Protein), còn có tên là CRP (cAMP Receptor Protein), nằm xa operon lac LacI được mã hóa bởi gen lacI nằm về phía đầu 5’ của operon lac Mỗi protein điều

hòa tiếp nhận một tín hiệu khác nhau từ môi trường và truyền tín hiệu tới operon

lac Khi môi trường không có lactose, LacI liên kết với operator và ức chế operon

lac Khi có mặt lactose, LacI bị bất hoạt và operon lac được biểu hiện Ngược lại, protein CAP khi liên kết operon lac lại có vai trò thúc đẩy operon hoạt động Tuy

vậy, CAP chỉ liên kết mạnh khi môi trường không có glucose Vì vậy, sự phối hợp của hai protein điều hòa CAP và LacI sẽ bảo đảm cho operon chỉ biểu hiện mạnh khi môi trường có lactose, không có glucose [4]

Ở operon lac, trình tự điều khiển (operator) gồm 21 bp với trình tự hai đầu

lặp lại đảo chiều, đối xứng qua cặp nucleotide số 11 Cấu trúc đối xứng của operator được nhận biết bởi hai tiểu phần của LacI Do trình tự liên kết của LacI tại operator

phủ lên một phần của trình tự promoter lac nên nó ngăn cản RNA polymerase liên kết với promoter Vì vậy, nó cũng ngăn cản quá trình phiên mã của operon lac

Khi môi trường có lactose, lactose được chuyển vào tế bào nhờ permease Khi vào trong tế bào, một số lactose (liên kết β-1,4) được chuyển thành allolactose (liên kết β-1,6) nhờ β-galactosidase Allolactose là chất cảm ứng, nó gắn vào LacI làm thay đổi cấu hình của protein này và dẫn đến sự liên kết lỏng lẻo trong liên kết giữa LacI và operator làm LacI rời khỏi promoter Lúc này các gen cấu trúc của

operon lac được bật mở, RNA polymerase bắt đầu phiên mã từ gen cấu trúc

Hình 1.5 Cơ chế điều hòa của operon lac

I Cấu trúc operon lac, II Sơ đồ điều hòa âm tính operon lac III Sơ đồ điều hòa

dương tính operon lac [79]

2.2 Gen lacZ và β-galactosidase

Gen lacZ là một trong ba gen cấu trúc nằm trong operon lac của E coli Gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase Trình tự của β-galactosidase ở E.coli

được giải mã vào năm 1970 và β-galactosidase có 1024 amino acid, nặng 464 kDa Cấu trúc bậc 4 đối xứng của nó được xác định vào năm 1994 với mỗi một đơn vị β-galactosidase gồm 5 miền [47]

z

Hình 1.6 Cấu trúc của β-galactosidase ở E coli [66, 67]

Trong kỹ thuật sàng lọc thể tái tổ hợp ở tế bào vi khuẩn, gen lacZ (kết hợp

với IPTG và X- gal) được sử dụng phổ biến như gen chỉ thị màu, do tính dễ nhận biết thể tái tổ hợp nhờ màu sắc khuẩn lạc Nếu môi trường có mặt X-gal (5-bromo -4-cloro-3-indolyl -β-D- galactopyranoside), enzyme β-galactosidase có khả năng thuỷ phân X-gal từ một hợp chất không màu thành màu xanh Do đó, ở môi trường nuôi cấy vi khuẩn sau khi biến nạp có bổ sung thêm X-gal và chất cảm ứng IPTG (isopropylthiogalactoside - chất đồng đẳng của lactose), các tế bào vi khuẩn có gen

lacZ nguyên vẹn (không có DNA tái tổ hợp) có khả năng tổng hợp enzyme

β-galactosidase thuỷ phân X-gal và các tế bào này phát triển thành khuẩn lạc có màu

xanh Nếu DNA lạ được xen vào giữa gen lacZ làm cho gen lacZ mất hoạt tính dẫn

đến enzyme β-galactosidase không được tổng hợp thì tế bào vi khuẩn phát triển thành các khuẩn lạc có màu trắng Sau đó, các khuẩn lạc có màu trắng được lựa chọn

và cấy chuyển vào môi trường dinh dưỡng để thu được dòng tế bào mang vectơ tái

tổ hợp [71]

Hình 1.7 Cơ chế thủy phân X-gal của enzyme β-galactosidase [71]

Enzyme β-galactosidase có trong các vi sinh vật, thực vật và động vật Các enzyme này đã được ứng dụng trong nhiều quy trình công nghệ sinh học Đặc biệt, các enzyme từ vi sinh vật được sử dụng để thủy phân lactose nhằm tăng khả năng tiêu hóa sữa hoặc để cải thiện các đặc tính chức năng của các sản phẩm từ sữa Phản ứng chuyển hoá galactozyl cũng thường được sử dụng để tạo ra các galacto-oligosaccharide nhằm cải biến chức năng và cấu trúc của nguyên liệu thực phẩm, dược phẩm và các hợp chất có hoạt tính sinh học khác [9]

Hiện nay, các nhà nghiên cứu đã tìm ra được nhiều chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase với hoạt lực cao Enzyme này khi được tổng hợp có thể ở dạng ngoại bào (tiết ra ngoài môi trường) hoặc nội bào (tích tụ trong tế bào, có thể ở dạng tự do hoặc ở dạng liên kết với màng, với plasma hoặc lyzosome của tế bào…) [9, 48] Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme β-galactosidase được liệt kê trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme β-galactosidase [50] NẤM

Khối lượng phân tử của β-galactosidase dao động từ 19 đến 630 kDa Cấu trúc dưới phân tử của các enzyme này bao gồm nhiều loại khác nhau từ monomer

(enzyme thu từ Kluyveromyces lactic) đến octamer (enzyme thu từ E coli) [20]

Tuỳ thuộc vào nguồn thu enzyme mà tính đặc hiệu phân tử của từng loại enzyme là khác nhau Các enzyme β-galactosidase có nguồn gốc từ vi khuẩn có pH tối ưu thuộc vùng trung tính, trong khi đó hầu hết β-galactosidase từ nấm mốc có pH thuộc vùng axit, có một số chủng có pH tối ưu là 2 [48, 49, 16]

nhiên, một số -galactosidase khác lại không cần sự có mặt của các ion kim loại như

enzyme thu từ Rhizobium melioti [16, 8]

Mặc dù rất nhiều enzyme -galactosidase từ vi sinh vật được biết đến nhưng chỉ có một số ít các vi sinh vật được lựa chọn làm nguồn sinh enzyme trong công

nghiệp Hầu hết, các vi sinh vật này có nguồn gốc từ nấm mốc như là Kluyveromyces lactic, K fragilis, Aspergillus niger và A oryzae hoặc từ vi khuẩn như E coli Những

loài vi sinh vật đó được lựa chọn chính vì chúng có thể tạo ra β-galactosidase với giá rẻ khi cho thêm vào thực phẩm [9]

3 Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn

3.1 Đặc điểm của plasmid

Ở vi khuẩn và một số nấm men, ngoài các gen nằm trong genome còn có các yếu tố di truyền ngoài thể nhiễm sắc, gọi là plasmid Plasmid là các phân tử DNA mạch đôi dạng vòng, đôi khi có mạch thẳng hay được cấu tạo bởi RNA nằm ngoài DNA nhiễm sắc thể [80] (hình 1.8) Nó thường có trong tế bào vi khuẩn, đôi khi

cũng có ở sinh vật nhân thật (eukaryote) (ví dụ, ở Saccharomyces cerevisiae) Kích

thước của plasmid khoảng từ 1 đến hơn 400 kbp, có thể chứa vài gen đến vài trăm gen Plasmid có thể có một bản sao hay tới vài trăm bản sao trong cùng một tế bào

Số lượng bản sao ảnh hưởng tới đặc tính chống chịu của vi khuẩn, đặc biệt là khả năng kháng thuốc, do đó nếu vi khuẩn mang plasmid có nhiều bản sao thì khả năng kháng kháng sinh sẽ càng cao [32, 8]

Hình 1.8 Sơ đồ minh họa một tế bào vi khuẩn chứa plasmid ở bên trong

(1) DNA nhiễm sắc thể, (2) Plasmid

Trong tự nhiên plasmid có thể tái bản đồng thời với nhiễm sắc thể của tế bào hoặc có thể tái bản độc lập Plasmid mang gen tự kiểm soát vòng đời của chúng, một vài plasmid còn mang gen ảnh hưởng tới tế bào vật chủ [80] Một số plasmid

có khả năng di chuyển từ tế bào vi khuẩn này đến tế bào vi khuẩn khác Những plasmid có khả năng di chuyển là loại có kích thước trung bình và kích thước lớn vì

nó đòi hỏi phải có trên 30 gen hoạt động [80] Trong công nghệ sinh học, người ta thường sử dụng plasmid làm vectơ để chuyển ghép gen từ tế bào cho sang tế bào nhận, từ đó nhân dòng tạo ngân hàng gen hoặc biểu hiện gen nhằm thu sản phẩm protein có hoạt tính sinh học [2]

Nhiều loại plasmid khác nhau có thể cùng tồn tại trong một tế bào Đã có 7

plasmid khác nhau được tìm thấy trong E coli Mặt khác, những plasmid có họ

hàng thường không thể cùng tồn tại do không tương hợp (incompatible) và một trong số chúng sẽ bị loại khỏi tế bào Vì thế, các plasmid còn được xếp vào các nhóm không tương hợp (incompatibility group) dựa vào khả năng cùng tồn tại của chúng trong một tế bào Sự sắp xếp theo tính không tương hợp dựa vào cơ chế điều hòa những chức năng thiết yếu của plasmid [8]

Một cách khác phân loại plasmid còn dựa vào chức năng của chúng và bằng cách đó người ta phân plasmid thành 5 nhóm chính [8]:

1 Nhóm plasmid Col: là các loại plasmid chứa các gen sản xuất protein (gọi là

colicin) giúp cho vi khuẩn chủ chống lại vi khuẩn khác

2 Nhóm plasmid R (resistant plasmid): là loại plasmid chứa một hay nhiều gen

có khả năng sản xuất các loại protein (chủ yếu là các enzyme) kháng lại

5 Nhóm plasmid nhân tạo: đó là các plasmid được tạo ra bằng cách thiết kế

từng thành phần lấy từ các plasmid có nguồn gốc trong tự nhiên Tùy theo hướng sử dụng mà người ta thiết kế plasmid để phục vụ công nghệ DNA và protein tái tổ hợp

Những plasmid chỉ hiện diện với một hoặc một số ít bản sao trong vi khuẩn Khi tế bào vi khuẩn phân chia, plasmid sẽ có nguy cơ bị dồn về một trong hai tế bào con Để tránh bị mất đi sau phân bào, những plasmid một bản sao có các cơ chế để chủ động phân phối mỗi bản sao về một tế bào con [8]

Plasmid có vai trò quan trọng trong các phòng thí nghiệm di truyền và sinh hóa, chúng được sử dụng để nhân bản hoặc biểu hiện các gen cần quan tâm Có rất nhiều plasmid được thương mại hóa cho các ứng dụng trên Các plasmid dùng trong

kỹ thuật di truyền được gọi là các vector [2]

3.2 Những vector tách dòng và vector biểu hiện trong E coli

Escherichia coli hay còn được gọi là vi khuẩn đại tràng là một trong những

loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim

và động vật có vú) E coli là vi khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý và không hình thành bào tử Các tế bào thường hình que dài khoảng 2,0 µm và đường kính là 0,5 mm E coli thuộc họ Enterobacteriaceae Ưu điểm của vi khuẩn E coli là có tốc độ sinh

trưởng nhanh, khả năng biểu hiện protein mạnh nên giảm được chi phí công nghệ và

hóa chất Do đó, E coli được chọn làm sinh vật mô hình để nghiên cứu trong phòng

thí nghiệm trên khắp thế giới [79]

Các plasmid được sử dụng phổ biến hiện nay là các plasmid đa năng và chuyên dụng thuộc thế hệ thứ ba Để tiện cho việc sử dụng nhiều enzyme cắt giới hạn, nhiều trình tự của chúng đã được xếp nối tiếp nhau thành một đoạn dài gọi là multiple cloning site (vị trí đa điểm tách dòng) [2]

Nhiều loại plasmid dùng cho E coli có nguồn gốc từ thiên nhiên được thiết

kế lại để thuận tiện cho việc sử dụng làm vector nhân dòng (cloning vector) hay để biểu hiện gen ngoại lai (expression vector) Các plasmid dùng để tạo dòng có đặc điểm như sau:

- Kích thước tương đối nhỏ, mang một hay nhiều gen chỉ thị chọn lọc cho phép xác định nhân tố biến nạp và duy trì trong quần thể vi khuẩn

- Chứa các vị trí nhận biết đa điểm tách dòng

- Phải có tâm tái bản cho phép vector tái bản trong tế bào nhận [2]

Để biểu hiện tất cả các gen ngoại lai trong E coli đoạn gen ngoại lai phải

được gắn vào trong vector biểu hiện (thường là plasmid) Vector này phải có đủ các cấu trúc cần thiết sau [3]:

- Trình tự khởi đầu sao chép (ori) để có thể tạo ra nhiều bản sao trong tế bào vật chủ

- Các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker)

- Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc tac) cho phép sản xuất một lượng lớn mRNA từ các gen được tạo dòng

- Các trình tự kiểm soát dịch mã như trình tự liên kết ribosome (ribosome binding site) được bố trí thích hợp cùng với mã khởi đầu AUG và một trong ba mã kết thúc

- Có vị trí cắt đa điểm để đưa gen ngoại lai vào theo một hướng chính xác với promoter (MCS)

Chỉ khi được cấu trúc đầy đủ như thế, các vector mới có thể biểu hiện gen

ngoại lai trong E coli [3] Có nhiều loại vector tách dòng và vector biểu hiện trong

E coli được thương mại hóa Một số vector thương mại dùng tách dòng và biểu

Bảng 1.2 Một số vector thương mại dùng tách dòng và biểu hiện trong E coli [75]

Nguồn

Hệ pBAD/His araBAD Amp N-His Enterokinase pUC Invitrogen

C-His Thrombin pBR322 Novagen

Hệ pPROLar lac-ara1 Kan Nc-Myc Enterokinase p15A Clontech

Hệ pTriEx T7-lac Amp N-His C-His Thrombin Enterokinase pUC Novagen

Hệ

Tuy nhiên, việc sử dụng E coli để sản xuất các protein tái tổ hợp phải đối mặt với nhiều vấn đề bất lợi về sinh học như: E coli không thể được sử dụng nhằm

sản xuất một số protein phức tạp lớn có chứa cầu nối disulfide hoặc các protein của eukaryote đòi hỏi phải sửa chữa sau phiên mã và sau dịch mã để tạo ra protein hoạt tính [79] Do đó, muốn phục hồi được hoạt tính của các protein này đòi hỏi quy

trình phức tạp và tốn kém Protein ngoại tiết của E coli thường có tính ổn định thấp

do nó dễ bị thủy phân Ngoài ra, E coli có thể gây bệnh và sinh độc tố đối với con

người [79]

Trong khi đó, các chủng B subtilis được sử dụng nhiều nhất vì đã được

nghiên cứu tương đối đầy đủ về đặc tính sinh lý, sinh hóa và di truyền với toàn bộ

genome đã được xác định B subtilis như nhà máy tiềm năng để sản xuất các

protein vì nó có khả năng tiết các enzyme ngoại bào trực tiếp vào môi trường nuôi

cấy trong khi E coli thường có khả năng tiết enzyme nội bào nhiều hơn Do vậy, B subtilis được sử dụng để nâng cao chất lượng và làm tăng số lượng của các protein

tiết ra ngoài môi trường như interferon, hormone tăng trưởng, pepsinogen và yếu tố

tăng trưởng biểu bì Hơn nữa, B subtilis được xem là sinh vật an toàn, không gây

bệnh cho người và động vật [30] Tuy nhiên, chúng có nhược điểm là plasmid tái tổ

hợp chứa DNA ngoại lai thiếu bền vững nên việc biểu hiện trên B subtilis thường

yêu cầu tái tổ hợp vào nhiễm sắc thể Do đó, để khảo sát đặc tính một enzyme mới

người ta thường lựa chọn biểu hiện trên E coli trước Sau đó, khi sản xuất protein lượng lớn thì chuyển sang hệ thống biểu hiện của B subtilis [65, 17, 55, 35]

3.3 Vector biểu hiện trong B subtilis

Hiện nay đã có nhiều loại vector thương mại dành cho E coli nhưng vector dành cho biểu hiện gen trong B subtilis thì mới có một công ty sản xuất (công ty Mobitec) Có hai lí do làm giảm khả năng sử dụng của B subilis:

1 Sản xuất các protease ngoại bào mà nhận biết và phân hủy các protein khác nguồn gốc (heterologous protein)

2 Tính không ổn định của các plasmid

Nhược điểm thứ nhất đã được khắc phục phần lớn bằng việc do việc xây dựng chủng thiếu protease Trở ngại thứ hai được khắc phục hoàn toàn bằng việc sử

dụng plasmid sao chép dạng theta (theta (θ) - mode replication) tương tự các

plasmid có nguồn gốc tự nhiên như pAM β1 và pBS72 [11] Sau đây là một số hệ

thống biểu hiện tiêu biểu của B subtilis

operator của operon lac vào vector [11] Trong các hệ vector pHT khi không bổ

sung chất cảm ứng, mức độ biểu hiện của protein được mã bởi các đoạn gen ngoại lai rất thấp, còn khi bổ sung IPTG thì lượng protein tái tổ hợp sản xuất có thể lên đến 10 và 13% tổng số protein của tế bào Trong các vector pHT01và pHT43 các trình tự RBS và MCS cũng được thiết kế chèn vào một cách hiệu quả để sản xuất protein tái tổ hợp α-amylase [11] Ngoài ra, các vector này được thiết kế mang các dẫn xuất có sẵn như 8xHis tag trong vector pHT08, dẫn xuất Strep tag trong pHT9 hay dẫn xuất C-Myc trong pHT10 giúp tách chiết được protein đích

3.3.2 Hệ thống vector biểu hiện pAL

Bên cạnh các vector đề cập ở trên có sử dụng chất cảm ứng IPTG còn có hệ vector biểu hiện pAL không sử dụng chất cảm ứng IPTG mà sử dụng điều kiện cảm

ứng là nhiệt độ lạnh Vector pAL được thiết kế có chứa promoter des của B subtilis,

sử dụng điều kiện cảm ứng là nhiệt độ lạnh (cold-inductor), cho phép tiết ra các protein tái tổ hợp ở nhiệt độ thấp Khi các tế bào đang sinh trưởng ở pha log mà nhiệt độ chuyển từ 37°C xuống 25°C thông thường quá trình tổng hợp các protein của hầu hết các tế bào đều giảm rất nhiều Tuy nhiên, khi dùng vector pAL để biểu hiện protein tái tổ hợp thì quá trình tổng hợp vẫn được xảy ra liên tục trong 30 phút

đầu tiên và kéo dài trong khoảng 5 giờ [64] Trong B subtilis, một trong những

protein sốc lạnh (cold-shock proteins) là protein bám màng Δ5-Des, được mã hóa

bởi gen des [64] Bản chất của protein này là một enzyme xúc tác thủy phân liên kết đôi cis tại vị trí Δ5 của một loạt các chất béo bão hòa trong axit Vì vậy, gen des

được điều hòa một cách nghiêm ngặt trong quá trình sốc nhiệt lạnh

3.4 Cài nhập vector biểu hiện vào B subtilis

Việc cài nhập đoạn DNA ngoại lai vào B subtilis được phát triển cuối những

năm 1970 và đến nay vẫn có vai trò đáng kể trong di truyền học Cài nhập DNA

ngoại lai vào B subtilis được Frank E Young thuộc Đại học Rochester thực hiện

lần đầu tiên năm 1976 [29] Năm 1977, Ehrlich cùng cộng sự đã cài nhập các đoạn

DNA mang gen kháng kháng sinh vào phần tương đồng trên nhiễm sắc thể của B

subtilis bằng quá trình trao đổi chéo [23] Năm 1978, xuất hiện hàng loạt các bài báo về sử dụng B subtilis như vật chủ để nhân dòng gen trong vi khuẩn này [27, 36,

15, 42] Đến năm 1980, Haldenwang và cộng sự sử dụng thành công vector cài nhập

do họ thiết kế để lập bản đồ vị trí của "gen 0.4kb" (ngày nay được biết là spoVG) ở

vị trí gần 5° trên bản đồ di truyền B subtilis [29] Sau đó, một loạt các nghiên cứu

khác sử dụng kỹ thuật di truyền DNA tái tổ hợp trở nên phổ biến và được thương mại hóa để sản xuất, tách chiết, tinh sạch, giải trình tự protein và lập bản đồ di

truyền của các gen trên B subtilis [11, 29, 31, 45, 49]

3.4.1 Cơ chế của quá trình cài nhập vào B subtilis

DNA ngoại lai được cài nhập vào tế bào khả biến B subtilis theo cơ chế tự

nhiên Ban đầu, đoạn DNA ngoại lai sẽ bám vào các thụ thể đặc biệt trên bề mặt tế bào khả biến (chỉ tế bào khả biến mới có các thụ thể đặc biệt này) Sau đó, đoạn DNA ngoại lai xuyên qua màng tế bào vi khuẩn khả biến và một trong hai sợi sẽ bị nuclease của tế bào cắt, còn lại một sợi

Hình 1.9 Mô hình đoạn DNA của vector pHV32 được chèn vào nhiễm sắc thể của

ngoài Cuối cùng, đoạn DNA mới này sẽ được nhân lên cùng với quá trình nhân bản

của nhiễm sắc thể B subtilis [35]

3.4.2 Các kiểu cài nhập vào B subtilis

Có hai phương pháp cài nhập gen ngoại lai vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn

B subtilis:

o Phương pháp trao đổi chéo đơn (single crossover)

Giữa plasmid và nhiễm sắc thể chỉ có một trình tự tương đồng thì plasmid và

nhiễm sắc thể của B subtilis có thể xảy ra trao đổi chéo đơn theo cơ chế Campell

như hình 1.10 [11, 33, 35]

Hình 1.10 Mô hình trao đổi chéo đơn (single crossover) minh họa việc sử dụng một vector cài nhập cơ bản để xây dựng một đột biến knockout trong một

khung đọc mở (orfA) [11]

o Phương pháp trao đổi chéo kép (double crossover)

Giữa plasmid và nhiễm sắc thể của B subtilis có hai trình tự tương đồng thì

có thể xảy ra trao đổi chéo kép tạo ra một cassette cài nhập trên nhiễm sắc thể của

B subtilis như hình 1.11 [11]

Hình 1.11 Mô hình trao đổi chéo kép (double crossover) minh họa việc sử dụng

một vector cài nhập (ectopic integration vector) để chèn một khung đọc mở (orfA) vào

trong vị trí đích trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn B subtilis [11]

Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu về tách dòng và bước đầu biểu hiện

enzyme ngoại bào trong B subtilis Báo cáo của Quyền Đình Thi và cộng sự năm

2008 về “Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa β-galactosidase từ chủng B subtilis G1” trong hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV đã dùng vector pJET 1

nhân dòng thành công gen mã hóa cho β-galactosidase [6] Nguyễn Thị Vân Anh và

cộng sự (năm 2011) đã biểu hiện streptavidin trên bề mặt bào tử B subtilis với mục

đích sử dụng nó như một chất mang “đa dụng” nhờ khả năng gắn vào phân tử được biotinyl hóa để hy vọng bào tử này sẽ có khả năng “chuyên chở” các kháng nguyên của vi sinh vật, các enzyme, các kháng thể để phục vụ cho các mục đích phân tích

quả là chủng B subtilis tái tổ hợp được tạo ra có đoạn cotB13-chlFNa tại vị trí gen amyE, kháng chloramphenicol và không sản xuất amylase [1] Nghiên cứu của Trần

Linh Thước và cộng sự (năm 2008) tạo insulin từ mini-proinsulin (MPI) tái tổ hợp

được biểu hiện dạng tiết ở B subtilis Đoạn DNA được khuếch đại bằng PCR mang

gen mã hóa decahistidine-miniproinsulin (10xHis-MPI) với peptide tín hiệu tiết của

gen amyQ trong plasmid pHT43 tạo plasmid tái tổ hợp pHAI Các chủng B subtilis

B1012/pHAI, DB104/pHAI và WB800N/pHAI được nuôi cấy trong môi trường

Luria-Bertani (LB) và cảm ứng với 1 mM IPTG Kết quả cho thấy chủng B subtilis

B1012/pHAI có hiệu quả tiết cao nhất với tốc độ tổng hợp 10xHis-MPI khoảng 2,31 µg/ml/giờ và chiếm 38,5% tổng protein được tiết ra môi trường Nhưng các nghiên cứu này tại Việt Nam mới chỉ dừng lại ở việc nghiên cứu biểu hiện một số

protein ngoại lai trên bề mặt của bào tử B subtilis hoặc biểu hiện gen trong vi

khuẩn này bằng cách sử dụng chất cảm ứng IPTG và vẫn chưa có công trình nào

công bố về việc biểu hiện gen trong tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn B subtilis mà không sử dụng chất cảm ứng Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu:

“Biểu hiện β-galactosidase trong vi khuẩn B subtilis” nhằm mở rộng phạm vi

ứng dụng của vi sinh vật an toàn này trong cả lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng tại Việt Nam

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên liệu và thiết bị

2.1.1 Tế bào và plasmid

Hai chủng E coli DH5α và B subtilis PY79 được sử dụng để tách dòng và

biểu hiện Các plasmid sử dụng trong luận văn được liệt kê trong bảng 2.1 Các cặp mồi được liệt kê trong bảng 2.2

Bảng 2.1 Các plasmid sử dụng

Plasmid Đặc điểm chính Kích thước (bp) Nguồn

pET28b promoter T7, trình tự mã hóa cho

HisTag, T7 Tag, có vị trí cắt đa điểm của nhiều enzyme giới hạn phổ biến, mang gen kháng kanamycin

pDG268 Mang gen lacZ có kích thước khoảng 3 kb 10156

Bacillus Genetic

Stock Center (BGSC)

pDG364

Vector nhân dòng để cài nhập đoạn

DNA đích vào nhiễm sắc thể B

subtilis tại locus amyE, mang gen

chloramphenycol acetyl transferase

6257 Bacillus Genetic Stock Center

Bảng 2.2 Các cặp mồi sử dụng

Tên mồi Trình tự (5’- 3’) Ghi chú

PrrnO-F agatctGCATGACCATTATGACTAG Mồi để nhân dòng đoạn PrrnO với các

enzyme giới hạn BglII, XbaI (được gạch

chân)

PrrnO-R C tctagaACAGGTTAAGTTCACCGCATC

spoVG-F tctagaAAAGGTGGTAA Mồi để nhân dòng đoạn spoVG với các

enzyme giới hạn XbaI, NcoI (được gạch

chân)

spoVG-R ccatggTTACCACCTTT

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết: Agarose,

chloroform:isopropanol (24:1) từ Merck (Đức); Ethidium bromide, T4 ligase, Taq

polymerase, enzyme giới hạn từ Fermentas (Đức); mồi từ IDT (Mỹ), các kit gồm PCR puification kit, Gel extraction kit của QIA quick® (Đức) và kit tách plasmid High pure Isolution kit (Roche-Thụy Điển), kit AccuPrep Plasmid Mini Extraction (Bioneer-Mỹ)

Dung dịch nhuộm DNA 0,1 g/ml ethidium bromide

Đệm 10x TAE 20 mM EDTA, 900 mM Tris-acetate, pH 8,0

Đệm 6x tra mẫu DNA 0,09% brommophenol blue, 0,09% xylene xyanol (FF), 60%

glycerol Sol I 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0

Sol III 60% potassium acetate, 11,5% acetic acid, 28,5% nước cất

T-base 2 g (NH4)2SO4, 18,3 g K2HPO4.3H2O, 6 g KH2PO4, 1 g Na3–

Citrate, 1000 l H2O SpC 20 ml T-base, 0,2 ml 50% glucose, 0,3 ml 1,2% MgSO4.7H2O, 0,4

ml 10% cao nấm men, 0,5 ml 1% Casamino acid SpII 200 ml T-base, 2 ml 50% glucose, 14 ml 1,2% MgSO4.7H2O, 2 ml

10% cao nấm men, 2 ml 1% Casamino acid, 0,1 ml 0,1 M CaCl2

Dung dịch đệm Z

50 mM NaH2PO4.2H2O, 50 mM Na2HPO4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4.7H2O dâng 800 ml và đo pH đạt 7 rồi dâng lên 1 l và khử trùng Sau đó bổ sung thêm 360 l β-mecapthoetanol vào 100 ml hỗn hợp trên và dùng trong ngày

ONPG 40 mg ONPG pha với 10 ml đệm Z dùng trong ngày

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường LB (Luria-Bertani): 1% (w/v) peptone, 0,5% (w/v) cao nấm

men, 1% (w/v) NaCl, pH 7,5 Môi trường rắn được bổ sung 2% (w/v) agar

Môi trường DSM (Difco Sporulation Medium): 0,03% (w/v) cao thịt,

0,05% (w/v) pepton, 10% (w/v) KCl, 1,2% (w/v) MgSO4.7H2O, 0,0015 (v/v) NaOH 1M Sau khi khử trùng để nguội đến 500C thì bổ sung thêm các chất sau theo tỷ lệ 1/1000 (v/v): Ca(NO3)2 1 M, MnCl2 0,01 M, FeSO4 0,001 M Môi trường đặc được

bổ sung thêm 1,8 % (w/v) agar

Box cấy vi sinh vật clean bench Nuaire (Mỹ)