3. Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn
2.2.4. Các phương pháp hóa sinh
Phƣơng pháp kiểm tra hoạt tính amylase
Do trao đổi chéo kép, gen amyE bị mất tính nguyên vẹn dẫn đến mất hoạt tính amylase. Do đó, thể tái tổ hợp không có khả năng phân giải tinh bột. Dịch nuôi cấy của các thể biến nạp đƣợc thu sau các thời điểm thích hợp, ly tâm thu dịch và nhỏ trên đĩa thạch đục lỗ có bổ sung tinh bột (0,1%), ủ 37oC trong 8 giờ, nhuộm đĩa bằng dung dịch lugol. Các thể biến nạp không có khả năng phân giải tinh bột (không có vòng sáng trên đĩa) đƣợc lựa chọn.
Phƣơng pháp định tính bằng phản ứng enzyme β-galactosidase với X-gal
Nguyên lý: Hoạt tính enzyme β-galactosidase đƣợc định tính dựa vào khả năng β-galactosidase thuỷ phân X-gal. Nếu vi khuẩn mang gen lacZ, enzyme β- galactosidase đƣợc tổng hợp sẽ phân hủy X-gal dẫn đến tế bào vi khuẩn phát triển
36
thành khuẩn lạc màu xanh. X-gal đƣợc hoà tan trong dimethylformamide ở nồng độ 40 g/ml. Dung dịch gốc này đƣợc bảo quản trong tối ở nhiệt độ 40C.
Môi trƣờng thạch dùng để cấy hoặc phân lập bình thƣờng đƣợc khử trùng và làm nguội đến nhiệt độ khoảng 550C, sau đó thêm X-gal đến nồng độ cuối là 8
g/ml. Không thêm X-gal vào khi nhiệt độ môi trƣờng lớn hơn 550C do tại nhiệt độ lớn hơn 550C X-gal không bền và sẽ bị phân huỷ. Cấy vi khuẩn lên trên đĩa này. Sau thời gian nuôi cấy (tùy thuộc vào đặc tính của mỗi chủng riêng biệt), các chủng vi khuẩn tạo khuẩn lạc màu xanh trên đĩa biểu thị là chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme -galactosidase, còn các chủng không có khả năng sinh enzyme -galactosidase sẽ tạo khuẩn lạc màu trắng [71].
Phƣơng pháp định lƣợng bằng phản ứng enzyme β-galactosidase với cơ chất ONPG
Nguyên lý: Hợp chất ONPG là hợp chất không màu. -galactosidase sẽ thủy phân ONPG thành galactose và ortho-nitrophenol (oNP) (màu vàng). Ortho- nitrophenol hấp thụ ở bƣớc sóng 420 nm. Hoạt độ -galactosidase đƣợc xác định là lƣợng enzyme giải phóng 1 µmol oNP trong 1 phút ở 370C trong 1 đơn vị thể tích [32].
Tiến hành: Nuôi khuẩn lạc tái tổ hợp trên môi trƣờng DSM bổ sung kháng sinh chloramphenicol (50 µg/ml)và thu 1 ml dịch tại các thời điểm thích hợp để đo, rồi ly tâm thu cặn tế bào. Rửa cặn bằng 500 µl dung dịch đệm Tris-HCl pH 8. Bổ sung 500 µl dung dịch đệm Z và 20 µl toluen, vortex 30 giây, ủ đá 20 phút. Bổ sung 200 µl ONPG, ủ nhiệt độ 30oC trong 1 giờ. Ngừng phản ứng bằng 250 µl Na2CO3 1 M. Ly tâm mẫu, đo OD420nm và tính hoạt tính của enzyme theo công thức:
Time: thời gian phản ứng (phút)
Vol: thể tích mẫu thu (ml)
OD420: Đo mẫu ở bước sóng 420 nm
OD600: Đo mẫu ở bước sóng 600 nm
(Time) (Time) * (Vol) * (OD600)
OD420 * 1000 1 đơn vị (U) =
37
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Thiết kế vector pUL1 (PrrnO-RBS (spoVG)) dựa trên vector pET28b
Ở Việt Nam, vector biểu hiện trong B. subtilis chƣa đƣợc thƣơng mại hóa nên chúng tôi phải thiết kế vector có chứa promoter và RBS của B. subtilis dựa trên vector thƣơng mại pET28b. Vector này chúng tôi ký hiệu là pUL1. Trong pUL1 có promoter của gen mã hoá cho rRNA (một trong những gen quản gia của B. subtilis) và RBS của gen spoVG (gen mạnh cần cho tổng hợp vỏ bảo tử của B. subtilis) thay thế cho promoter T7 và RBS trong vector pET28b.
Việc lựa chọn promoter thích hợp vô cùng quan trọng khi thiết kế một hệ thống biểu hiện. Một promoter mạnh có một tần số phiên mã cao, tạo ra protein đích và protein này có thể chiếm từ 10-30% protein tổng của tế bào [77]. Đối với B. subtilis theo các tài liệu công bố, độ mạnh của promoter rrn phụ thuộc chủ yếu vào hai box tại vị trí -10 và -35 trong mỗi promoter. B. subtilis chứa 10 rrn operon, 6 trong số đó chứa đồng thời cả trình tự promoter P1-P2 và 4 operon chỉ chứa promoter đơn. Vị trí khởi đầu phiên mã của promoter PrrnO (P1/P2) của B. subtilis
đều đƣợc bắt đầu bằng GTC. Do đó, khi nồng độ GTP trong tế bào thay đổi sẽ làm thay đổi khả năng phiên mã của nó [78]. Samarrai W. cùng các cộng sự đã chứng minh rằng trong số các promoter của 10 operon (rrnA, rrnB, rrnD, rrnE, rrnO, rrnJ,
rrnW, rrnI, rrnH, rrnG) của B. subtilis thì có promoter của 4 operon rrnO, rrnD,
rrnJ và rrnB là các promoter mạnh [57]. Theo các nghiên cứu của Krásnývà Ogasawara, khi sử dụng cặp promoter (rrn P1/rrn P2) để biểu hiện các gen, đã cho thấy rằng các gen hoạt động dƣới sự điều khiển của rrnOP2 biểu hiện ổn định và ít bị ảnh hƣởng bởi môi trƣờng bên ngoài hơn so với rrnOP1 [38, 52]. Chính vì vậy, chúng tôi quyết định chọn trình tự rrnOP2 để làm trình tự promoter trong vector thiết kế và từ đây sẽ ký hiệu là PrrnO. Thông qua phân tích trình tự của PrrnO (kích thƣớc là 244bp) chúng tôi đã thiết kế mồi là đoạn đầu và đoạn cuối của trình tự PrrnO với các enzyme giới hạn đầu dính BglII tại F và XbaI tại R để khuếch đại trình tự đoạn này. Phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi trên đƣợc thực hiện ở một số nhiệt
38
độ gắn mồi khác nhau. Qua đó chúng tôi đã xác định điều kiện và thành phần tối ƣu của phản ứng PCR là nhƣ sau:
Bảng 3.1.Thành phần, điều kiện phản ứng PCR PrrnO
Thành phần phản ứng Thể tích (μl) Nồng độ
cuối cùng Điều kiện
DNA genome của B. subtilis 1 50-100 ng/µl
- Biến tính: 940C trong 36 giây - Gắn mồi: 550C trong 30 giây - Tổng hợp: 720C trong 30 giây - Chu trình trên lặp lại 30 lần
Mồi xuôi PrrnO-F 0,5 0,25 mM
Mồi ngƣợc PrrnO-R 0,5 0,25 mM
dNTP mix 2 2 mM
Đệm Taq DNA polymerase 10x 2,5 1x
Taq DNA polymerase có hoạt tính
đọc sửa 0,5 0,5 U/µl
H2O 18
Tổng thể tích 25
Kết quả là chúng tôi đã thu đƣợc một băng duy nhất với kích thƣớc khoảng 244 bp, phù hợp với kích thƣớc dự đoán theo lý thuyết. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.1
Hình 3.1. Kết quả khuếch đại đoạn PrrnO từ genome của B. subtilis
Giếng M: DNA marker 100 bp; giếng 1: đoạn DNA PrrnO; giếng 2: đối chứng âm.
39
- Cặp mồi đƣợc thiết kế có đặc tính đặc hiệu cao.
- Đã khuếch đại thành công đƣợc promoter PrrnO nhƣ mong muốn.
Trình tự RBS của gen spoVG trong B. subtilis đƣợc tổng hợp nhân tạo bằng cách nối hai đoạn oligonucleotide (Oligonucleotide xuôi: tctagaAAAGGTGGTAAvà Oligonucleotide ngƣợc: ccatggTTACCACCTTT). Đoạn này đƣợc thiết kế với các đầu dính XbaI và NcoI tại đầu 5' và 3' tƣơng ứng. Sản phẩm PCR đoạn promoter PrrnO
(đƣợc cắt với BglII và XbaI) cùng với RBS của gen spoVG (cũng đã đƣợc cắt với
XbaI và NcoI), đƣợc nhân dòng trong plasmid pET 28b đã đƣợc xử lý bằng hai enzyme BglIIvà NcoI để tạo ra plasmid tái tổ hợp pUL1. Vector pUL1 đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α và trải trên môi trƣờng LB agar có bổ sung kháng sinh kanamycin (30µg/ml) để sàng lọc các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp. Có thể tóm tắt quá trình tạo pUL1 nhƣ hình 3.2.
Hình 3.2. Sơ đồ tạo vector pUL1
Để kiểm tra pUL1 có chứa đoạn PrrnO, đoạn RBS của gen spoVG chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR colony các khuẩn lạc thu đƣợc. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
40
Hình 3.3. Kết quả PCR colony kiểm tra đoạn chèn PrrnO các khuẩn lạc thu đƣợc Giếng (+): sản phẩm PCR đoạn PrrnO đƣợc khuếch đại từ genome của B. subtilis
PY79, giếng 1-5: sản phẩm PCR colony các khuẩn lạc từ số 1-5, giếng (-): đối chứng âm, giếng M: DNA marker 100 bp
Dựa trên kết quả hình 3.3, chúng tôi thấy trong 5 khuẩn lạc đƣợc chọn có 4 khuẩn lạc mang đoạn chèn PrrnO. Khuẩn lạc số 1 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin (30µg/ml) để tách plasmid dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Nhƣ vậy, chúng tôi đã nhân dòng thành công đoạn PrrnO-RBS của gen spoVG
trong vector pET28b để tạo vector pUL1. Vector pUL1 mang đầy đủ các yếu tố của một vector tách dòng/biểu hiện và những yếu tố này là :
- Promoter PrrnO của gen quản gia (gen tổng hợp rRNA) hoạt động liên tục trong B. subtilis
- RBS của gen spoVG, gen hoạt động mạnh trong vi khuẩn B. subtilis
- Vị trí cắt đa điểm MCS của nhiều enzyme giới hạn phổ biến của vector pET28b
- Trình tự origin của vector pET28b (origin có nguồn gốc từ vector pBR322) có khả năng tạo ra số lƣợng lớn bản sao trong tế bào chủ (khoảng 25 - 50 bản/tế bào)
41
- Gen chỉ thị kháng sinh kanamycin để dễ dàng nhận biết các chủng mang gen tái tổ hợp khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc có chứa kháng sinh.
3.2 Nhân dòng gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase trong vector pUL1
3.2.1. Khuếch đại gen lacZ từ vector pDG268
Mặc dù có rất nhiều vector chứa gen lacZ nhƣ vector pBluescript, nhóm pGEM, nhóm pUC nhƣng chúng tôi chọn pDG268 làm khuôn để khuếch đại lacZ vì pDG268 có trình tự gen lacZ không mang các enzyme giới hạn phổ biến nên khi sử dụng các enzyme giới hạn thì đoạn lacZ vẫn đƣợc bảo tồn.
Theo tính toán, đoạn lacZ trong pDG268 có kích thƣớc khoảng 3kb. Dựa vào chính trình tự đoạn đầu và đoạn cuối của lacZ chúng tôi thiết kế cặp mồi có gắn enzyme giới hạn là lacZ-F-BamHI và lacZ-R-HindIII để khuếch đại đoạn lacZ mã hóa cho β-galactosidase và tối ƣu hóa chƣơng trình PCR nhƣ sau:
Bảng 3.2. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR lacZ
Thành phần phản ứng Thể tích
(μl)
Nồng độ cuối
cùng Điều kiện
DNA khuôn 3 50-100 ng/µl - Biến tính:
940C trong 36 giây - Gắn mồi: 550C trong 30 giây - Tổng hợp: 720C trong 3 phút 30 giây - Chu trình trên lặp lại 30 lần
Mồi xuôi lacZ-F-BamHI 0,5 0,25 mM
Mồi ngƣợc lacZ-R-HindIII 0,5 0,25 mM
dNTP mix 2 2 mM
Đệm Taq DNA polymerase 10x 2,5 1x
Taq DNA polymerase có hoạt tính đọc
sửa 0,5 0,5 U/µl
H2O 16
Tổng thể tích 25
42
Hình 3.4. Kết quả khuếch đại đoạn lacZ từ vector pDG268
Giếng số 1: đối chứng âm (không có khuôn); giếng số 2, 3: lacZ đƣợc khuếch đại từ pDG268 với nồng độ pha loãng khác nhau; giếng M: DNA marker (Express DNA Ladder)
Dựa vào kết quả điện di trên gel agarose 1% chúng tôi nhận thấy rằng băng
lacZ (khoảng 3 kb) xuất hiện đậm và rõ. Điều này chứng tỏ lacZ đã đƣợc khuếch đại thành công với số lƣợng lớn.
3.2.2. Nhân dòng gen lacZ trong vector pUL1
Sản phẩm PCR khuếch đại gen lacZ cùng với vector pUL1 đƣợc cắt bằng các enzyme giới hạn BamHI và HindIII. Thành phần phản ứng cắt đƣợc trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng cắt lacZ và pUL1
Thành phần phản ứng Thể tích (μl) Nồng độ cuối cùng Điều kiện
Đệm Tango 10x 10 2x
Ủ 370C trong 3h.
BamHI 1 10 U/µl
HindIII 1 10 U/µl
DNA (sản phẩm PCR lacZ hoặc
vector plasmid pUL1) 17 50-100 ng/µl
H2O 21
Chúng tôi chạy điện di sản phẩm phản ứng cắt trong 50 phút và 95V. Sản phẩm điện di đƣợc tinh sạch bằng kit QIA quick gel extration. Tiếp đó, chúng tôi
43
tiến hành phản ứng nối lacZ vào pUL1 với tỉ lệ thích hợp sao cho tổng thể tích là 12 µl. Phản ứng nối đƣợc ủ qua đêm ở 160C với các thành phần đƣợc tối ƣu hóa nhƣ sau:
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng nối lacZ vào pUL1
Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ cuối cùng
H2O 5
Đệm 10x 2 1x
Enzyme T4 ligase 1 5 U/µl
(pUL1 + sản phẩm khuếch đại lacZ) đã cắt 12 50-100 ng/µl
Tổng thể tích 20
Sản phẩm ghép nối trên đƣợc biến nạp vào E. coli DH5α theo phƣơng pháp sốc nhiệt và các thể biến nạp trải trên đĩa LB agar bổ sung kháng sinh kanamycin (30 µg/ml). Để kiểm tra các khuẩn lạc có plasmid pUL1 mang đoạn chèn lacZ hay không chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng phản ứng PCR colony. Sản phẩm PCR colony đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR colony kiểm tra đoạn lacZ chèn trong plasmid pUL1 của 5 khuẩn lạc
Giếng 1-5 sản phẩm PCR colony của 5 khuẩn lạc, giếng (-): đối chứng âm, giếng M: sản phẩm PCR của lacZ đƣợc khuếch đại từ khuôn pDG268
Trong 5 khuẩn lạc đƣợc kiểm tra, có 2 khuẩn lạc (số 1 và 2) chứa vector pUL1 mang đoạn chèn lacZ. Khuẩn lạc cho kết quả dƣơng tính (khuẩn lạc số 1) sẽ
44
đƣợc nuôi trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kanamycin (30 µg/ml) để tách chiết plasmid. Plasmid này sau đó đƣợc cắt bằng hai enzyme cắt giới hạn BamHI và
HindIII, đệm Tango 2x và đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Hình 3.6. Kết quả điện di trên gel agarose 1% kiểm tra sản phẩm chèn lacZ vào pUL1
Giếng M: DNA marker (Express DNA Ladder); giếng 1: sản phẩm PCR gen lacZ; giếng 2: sản phẩm cắt pUL1-lacZ
Kết quả điện di trên cho thấy trên giếng số 2 xuất hiện băng có kích thƣớc nhƣ sản phẩm PCR của lacZ (khoảng 3kb) và điều này chứng tỏ chúng tôi đã nhân dòng thành công đoạn lacZ trong vector pUL1.
3.3 Nhân dòng đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong vector pDG364 tạo pUL2
3.3.1. Khuếch đại đoạn DNA gồm promoter PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong pUL1 trong pUL1
Đoạn DNA bao gồm promoter PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ đƣợc khuếch đại từ vector tái tổ hợp pUL1-lacZ bằng cặp mồi đặc hiệu nhƣ đƣợc trình bày trong phần nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu. Phản ứng PCR với Taq DNA polymerase có hoạt tính đọc sửa đƣợc thực hiện ở nhiều nhiệt độ gắn mồi khác nhau. Qua đó, thành phần và điều kiện phản ứng đƣợc tối ƣu hóa nhƣ bảng 3.5.
1 2 M
3 kb
5kb
45
Bảng 3.5. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ
Thành phần Thể tích (μl) Nồng độ cuối cùng
H2O 13,8
dNTPs + Đệm 10x 2,0 2 mM
Mồi xuôi PrrnO-F 0,4 0,25 mM
Mồi ngƣợc lacZ-R 0,4 0,25 mM
Taq DNA polymerase có hoạt
tính đọc sửa 0,4 1 U/µl
Plasmid khuôn 3,0 50-100ng/µl
Tổng thể tích 20
Chu trình nhiệt:
Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên agarose 1%:
Hình 3.7. Kết quả PCR khuếch đại đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ từ pUL1-lacZ
Giếng M: DNA marker (Express DNA Ladder), giếng 1: đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ đƣợc khuếch đại từ vector pUL1-lacZ, giếng (-): đối chứng âm
M 1 (-)
46
Kết quả trên cho thấy băng có kích thƣớc lớn hơn 3kb (kích thƣớc tính toán theo lý thuyết của đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ là khoảng 3.3 kb) xuất hiện khá rõ nét. Điểu này chúng tỏ là chúng tôi đã khuếch đại thành công đoạn DNA PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ từ pUL1-lacZ.
3.3.2. Nhân dòng đoạn PrrnO-RBS(spoVG)-lacZ trong vector pDG364
Để có thể cài nhập đƣợc đoạn DNA PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ vào genome của B. subtilis chúng tôi đã lựa chọn vector pDG364 vì vector này có chứa các trình tự amyEf và amyEb tƣơng đồng với trình tự gen amyE trên nhiễm sắc thể của B. subtilis. Đoạn DNA bao gồm promoter PrrnO-RBS của gen spoVG-lacZ đƣợc khuếch đại thành công từ pUL1 có chứa gen lacZ bằng cách sử dụng cặp mồi nhƣ trong phần nguyên liệu và phƣơng pháp. Sản phẩm PCR của gen lacZ (đƣợc cắt với
EcoRI và HindIII) đƣợc chèn vào vector pDG364 (đã đƣợc xử lý với EcoRI và
HindIII) và biến nạp vào tế bào khả biến của E. coli. Vector tái tổ hợp này đƣợc ký hiệu là vector pUL2. Có thể tóm tắt quá trình trên trong sơ đồ hình 3.8.
Hình 3.8. Sơ đồ tạo vector pUL2
Các thể biến nạp đƣợc trải trên môi trƣờng chọn lọc chứa ampicillin (100 µg/ml). Plasmid tách từ các khuẩn lạc thu đƣợc cắt với enzyme giới hạn EcoRI và
47
promoter PrrnO-RBS của gen spoVG-lacZ chèn thêm đƣợc thể hiện trong hình 3.9 dƣới đây.
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm cắt pUL2
Giếng 1: sản phẩm PCR gen lacZ, giếng 2: pUL2 cắt bằng enzyme giới hạn EcoRI và HindIII, giếng M: DNA marker (Express DNA Ladder)
Kết quả cho thấy sau khi cắt bởi hai enzyme giới hạn, plasmid pUL2 này văng ra một băng có kích thƣớc hơn 3 kb (PrrnO-RBS của gen spoVG-lacZ có kích thƣớc dự đoán khoảng 3,3 kb). Sau đó, plasmid này đƣợc tách chiết bằng kit của