3. Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn
3.3.2.Nhân dòng đoạn PrrnO-RBS(spoVG)-lacZ trong vector pDG364
Để có thể cài nhập đƣợc đoạn DNA PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ vào genome của B. subtilis chúng tôi đã lựa chọn vector pDG364 vì vector này có chứa các trình tự amyEf và amyEb tƣơng đồng với trình tự gen amyE trên nhiễm sắc thể của B. subtilis. Đoạn DNA bao gồm promoter PrrnO-RBS của gen spoVG-lacZ đƣợc khuếch đại thành công từ pUL1 có chứa gen lacZ bằng cách sử dụng cặp mồi nhƣ trong phần nguyên liệu và phƣơng pháp. Sản phẩm PCR của gen lacZ (đƣợc cắt với
EcoRI và HindIII) đƣợc chèn vào vector pDG364 (đã đƣợc xử lý với EcoRI và
HindIII) và biến nạp vào tế bào khả biến của E. coli. Vector tái tổ hợp này đƣợc ký hiệu là vector pUL2. Có thể tóm tắt quá trình trên trong sơ đồ hình 3.8.
Hình 3.8. Sơ đồ tạo vector pUL2
Các thể biến nạp đƣợc trải trên môi trƣờng chọn lọc chứa ampicillin (100 µg/ml). Plasmid tách từ các khuẩn lạc thu đƣợc cắt với enzyme giới hạn EcoRI và
47
promoter PrrnO-RBS của gen spoVG-lacZ chèn thêm đƣợc thể hiện trong hình 3.9 dƣới đây.
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm cắt pUL2
Giếng 1: sản phẩm PCR gen lacZ, giếng 2: pUL2 cắt bằng enzyme giới hạn EcoRI và HindIII, giếng M: DNA marker (Express DNA Ladder)
Kết quả cho thấy sau khi cắt bởi hai enzyme giới hạn, plasmid pUL2 này văng ra một băng có kích thƣớc hơn 3 kb (PrrnO-RBS của gen spoVG-lacZ có kích thƣớc dự đoán khoảng 3,3 kb). Sau đó, plasmid này đƣợc tách chiết bằng kit của hãng Roche theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất và đƣợc gửi đến hãng Macrogen (Hàn Quốc) để xác định trình tự. Kết quả là, đoạn PrrnO-RBS của gen spoVG-lacZ
có trình tự chính xác nhƣ các đoạn khuôn mà từ đó PrrnO, RBS của gen spoVG và
lacZ đƣợc khuếch đại và các đoạn nối giữa các đoạn DNA chèn thêm là hoàn toàn đúng khung (phụ lục 1). Điều này chứng tỏ chúng tôi đã nhân dòng thành công đoạn PrrnO-RBS của gen spoVG-lacZ trong vector pDG364.Nhƣ vậy, trong vector tái tổ hợp pUL2, gen lacZ đƣợc thiết kế dƣới sự điều khiển của promoter PrrnO và RBS của gen spoVG. Ngoài ra, pDG364 có gen cat giúp sàng lọc các khuẩn lạc trên môi trƣờng chứa kháng sinh chloramphenicol. Thêm nữa, vector pDG364 có các trình tự
amyEf và amyEb tƣơng đồng với trình tự gen amyE trên nhiễm sắc thể của B.
1 2 M
3 kb
5kb
2kb 3kb
48
subtilis. Vậy, vector tái tổ hợp pUL2 có đầy đủ các yếu tố giúp biểu hiện gen lacZ
trong B. subtilis. Do đó, chúng tôi tiến hành bƣớc tiếp theo là cài nhập đoạn PrrnO- RBS (spoVG)-lacZ trong vector pDG364 vào genome của B. subtilis PY79 tại locus
amyE và kiểm tra sự cài nhập này.