3. Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn
3.2.2.Nhân dòng gen lacZ trong vector pUL1
Sản phẩm PCR khuếch đại gen lacZ cùng với vector pUL1 đƣợc cắt bằng các enzyme giới hạn BamHI và HindIII. Thành phần phản ứng cắt đƣợc trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng cắt lacZ và pUL1
Thành phần phản ứng Thể tích (μl) Nồng độ cuối cùng Điều kiện
Đệm Tango 10x 10 2x
Ủ 370C trong 3h.
BamHI 1 10 U/µl
HindIII 1 10 U/µl
DNA (sản phẩm PCR lacZ hoặc
vector plasmid pUL1) 17 50-100 ng/µl
H2O 21
Chúng tôi chạy điện di sản phẩm phản ứng cắt trong 50 phút và 95V. Sản phẩm điện di đƣợc tinh sạch bằng kit QIA quick gel extration. Tiếp đó, chúng tôi
43
tiến hành phản ứng nối lacZ vào pUL1 với tỉ lệ thích hợp sao cho tổng thể tích là 12 µl. Phản ứng nối đƣợc ủ qua đêm ở 160C với các thành phần đƣợc tối ƣu hóa nhƣ sau:
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng nối lacZ vào pUL1
Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ cuối cùng
H2O 5
Đệm 10x 2 1x
Enzyme T4 ligase 1 5 U/µl
(pUL1 + sản phẩm khuếch đại lacZ) đã cắt 12 50-100 ng/µl
Tổng thể tích 20
Sản phẩm ghép nối trên đƣợc biến nạp vào E. coli DH5α theo phƣơng pháp sốc nhiệt và các thể biến nạp trải trên đĩa LB agar bổ sung kháng sinh kanamycin (30 µg/ml). Để kiểm tra các khuẩn lạc có plasmid pUL1 mang đoạn chèn lacZ hay không chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng phản ứng PCR colony. Sản phẩm PCR colony đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR colony kiểm tra đoạn lacZ chèn trong plasmid pUL1 của 5 khuẩn lạc
Giếng 1-5 sản phẩm PCR colony của 5 khuẩn lạc, giếng (-): đối chứng âm, giếng M: sản phẩm PCR của lacZ đƣợc khuếch đại từ khuôn pDG268
Trong 5 khuẩn lạc đƣợc kiểm tra, có 2 khuẩn lạc (số 1 và 2) chứa vector pUL1 mang đoạn chèn lacZ. Khuẩn lạc cho kết quả dƣơng tính (khuẩn lạc số 1) sẽ
44
đƣợc nuôi trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kanamycin (30 µg/ml) để tách chiết plasmid. Plasmid này sau đó đƣợc cắt bằng hai enzyme cắt giới hạn BamHI và
HindIII, đệm Tango 2x và đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Hình 3.6. Kết quả điện di trên gel agarose 1% kiểm tra sản phẩm chèn lacZ vào pUL1
Giếng M: DNA marker (Express DNA Ladder); giếng 1: sản phẩm PCR gen lacZ; giếng 2: sản phẩm cắt pUL1-lacZ
Kết quả điện di trên cho thấy trên giếng số 2 xuất hiện băng có kích thƣớc nhƣ sản phẩm PCR của lacZ (khoảng 3kb) và điều này chứng tỏ chúng tôi đã nhân dòng thành công đoạn lacZ trong vector pUL1.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});