3. Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn
2.2.3Các phương pháp sinh học phân tử
Nhân bản gen (PCR)
Nguyên tắc: PCR là phƣơng pháp dùng enzyme khuếch đại chọn lọc một đoạn DNA theo luật số mũ. Phản ứng nhân gen đƣợc thực hiện với DNA polymerase chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và bốn loại deoxyribonucleotide (dATP, dGTP, dCTP và dTTP).
Mỗi chu kỳ phản ứng nhân gen gồm 3 bƣớc: bƣớc 1 là biến tính DNA bằng cách tăng nhiệt độ phản ứng lên 94°C-95°C (tách hai sợi đơn từ sợi khuônxoắn kép), bƣớc 2 là bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn, bƣớc 3 là kéo dài chuỗi theo mồi, chiều 5′-3′ với quá trình kéo dài gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung.
Tính đặc hiệu của phản ứng đƣợc quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Nhƣ vậy, kết quả của phản ứng PCR là tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ.
Tiến hành: PrrnO, gen lacZ, đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ đƣợc nhân bản bằng các cặp mồi với trình tự enzyme giới hạn đƣợc gạch chân (bảng 2.2) trong phản ứng PCR có thành phần nhƣ bảng 2.5.
32 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) Đệm 10x 2,5 dNTP 2,0 Mồi xuôi 0,5 Mồi ngƣợc 0,5 Taq-polymerase 0,5 DNA khuôn 1,0
H2O khử ion vô trùng 13
Tổng thể tích 25
Tách plasmid
Nguyên tắc: Vi khuẩn đƣợc nuôi đến giai đoạn cuối của pha log. Tế bào đƣợc phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy mạnh. DNA plasmid đƣợc thu lại bằng cách kết tủa với isopropanol.
Quy trình:
- Nuôi một khuẩn lạc trong 1,5 ml môi trƣờng LB lỏng có bổ sung chất kháng sinh ở 37°C qua đêm
- Lấy 1,5 ml dịch nuôi ly tâm 14000 vòng/phút trong 5 phút, thu kết tủa - Bổ sung 150 µl sol I trộn đều bằng máy lắc rung
- Bổ sung 200 µl sol II trộn đều nhẹ nhàng, giữ trong đá lạnh 3 phút - Bổ sung 150 µl sol III và trộn đều
- Thêm 450 µl chloroform:isoamyl alcohol (24:1), trộn đều và ly tâm 14000 vòng/phút trong 5 phút
- Chuyển dịch nổi sang ống eppendorf mới. 400 l dịch trong phía trên đƣợc bổ sung 900 l isopropanol, trộn đều, ủ ở 10 phút ở nhiệt độ phòng
- Ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút, đổ dịch thu cặn
- Rửa lại bằng cồn 70%, ly tâm 14000 vòng/phút trong 1 phút, thu cặn, phơi khô
33 - Hòa tan DNA bằng 20 µl H2O
- Điện di kiểm tra trên gel 1% agarose.
Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn
Để kiểm tra plasmid lựa chọn có mang sản phẩm mong muốn hay không, các plasmid tái tổ hợp từ các khuẩn lạc đƣợc cắt bằng các enzyme giới hạn. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là sử dụng các enzyme giới hạn (endonuclease) cắt DNA tại những trình tự đặc hiệu. Ngƣời ta đã dùng tính chất này để cắt một đoạn DNA lớn thành các đoạn DNA nhỏ hơn. Hỗn hợp phản ứng cắt đƣợc trộn với tỉ lệ thích hợp theo hƣớng dẫn của hãng sản xuất. Ủ trong 2-3 giờ ở 37°C, sau đó điện di kiểm tra.
Phản ứng nối ghép gen
Nguyên tắc: Các nucleotide nằm ở đầu dính của sợi DNA có khả năng hình thành cầu nối hydro với các nucleotide bổ sung nằm trên đầu dính của sợi DNA khác. Nhờ xúc tác của enzyme T4 ligase mà hình thành liên kết phosphodieste giữa gốc phosphate đầu 5’ của sợi DNA này với gốc hydroxyl đầu 3’ của sợi DNA kia. Phản ứng có sự tham gia của phân tử ATP để cung cấp năng lƣợng cho phản ứng.
Các thành phần, điều kiện của phản ứng nối ghép gen thể hiện ở bảng 2.6. Bảng 2.6. Các thành phần, điều kiện của phản ứng nối ghép gen
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện H2O 5 Ủ 16oC qua đêm Đệm 10x 2 Enzyme T4 ligase 1 đoạn chèn và plasmid 12 Tổng thể tích 20
Biến nạp vào E. coli theo phƣơng pháp của Sambrook và cộng sự (1989) [58]
Plasmid đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5 theo phƣơng pháp sốc nhiệt và hóa học. Nguyên lý của phƣơng pháp là E. coli đƣợc xử lý bằng CaCl2, giúp DNA dễ dàng bám dính vào màng tế bào, và khi sốc nhiệt, các lỗ màng tế bào mở rộng làm các đoạn DNA đi vào dễ dàng [58].
34
Chuẩn bị tế bào khả biến: Khuẩn lạc E. coli đƣợc nuôi trong 2 ml LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Nuôi lắc tiếp giống 1% ở 37°C trong 2-3 giờ để đạt OD600nm 0,4-0,7. Dịch nuôi cấy để lạnh 30 phút cho ổn định rồi ly tâm thu tế bào 4000 vòng/phút trong 5 phút. Tế bào đƣợc ủ lần 1 với 0,1 M CaCl2 trong 1 giờ, ly tâm thu tế bào. Rửa lần 2 với 0,1 M CaCl2 trong 20 phút. Tế bào đã qua xử lý đƣợc hòa trong 100 l 0,1 M CaCl2 để chuẩn bị biến nạp [58].
Biến nạp plasmid vào E. coli: Đƣa tế bào khả biến từ -80oC ra hộp đá. Để tan từ từ (trong khoảng 20 phút). Cho 200 µl tế bào khả biến và 20 µl dung dịch sau phản ứng nối ghép gen vào một ống eppendorf mới, đảo nhẹ nhàng ủ trong đá khoảng 20 phút. Sau đó, mẫu đƣợc sốc nhiệt trong bể ổn nhiệt 42°C sau 45 giây, lấy mẫu ra và đặt lên đá trong 2 phút. Bổ sung 850 µl môi trƣờng LB lỏng và nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37°C trong 45 phút. Cấy trải 200 µl dịch nuôi trên đĩa LB bổ sung chất kháng sinh, nuôi ở 37°C qua đêm [58]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cài nhập plasmid vào B. subtilis theo phƣơng pháp của Nicholson W. và Setlow P. (1990) [51]
Quá trình cài nhập đoạn DNA ngoại lai vào genome của B. subtilis theo cơ chế tự nhiên đã đƣợc trình bày ở phần tổng quan tài liệu.
Chuẩn bị tế bào khả biến: Khuẩn lạc B. subtilis cấy trên đĩa LB qua đêm. Sau đó B. subtilis đƣợc nuôi trong 20 ml spC, lắc 200 vòng/phút ở 37°C trong vòng 4,5- 5 giờ. Nuôi lắc tiếp giống 10% ở 37°C trong 90 phút trong 20 ml môi trƣờng spII. Dịch nuôi cấy đƣợc ly tâm 6000 vòng/phút trong 15 phút để thu tế bào. Sau đó, chỉ giữ lại 1,6 ml dịch nuôi cấy để hòa tan cặn tế bào, bổ sung thêm 0,4 ml 50% glycerol, chia ra 250 µl vào các ống eppendorf và giữ ở tủ -80°C [62].
Cài nhập plasmid vào B. subtilis: Đƣa tế bào khả biến từ -80oC ra xốp đá, để tan nhanh. Cho 250 µl tế bào khả biến và 20 µl dung dịch sau phản ứng nối ghép gen vào một ống eppendorf và nuôi lắc 37°C khoảng 45 phút. Tiếp theo, cấy trải 200 µl dịch nuôi trên đĩa DSM bổ sung chloramphenicol (50 µg/ml) và nuôi ở 37°C qua đêm [51].
35
Điện di DNA
Nguyên tắc: Vì nucleic acid là các đại phân tử sinh học tích điện âm nên khi chịu tác động của điện trƣờng không đổi chúng sẽ di chuyển từ cực âm về cực dƣơng. Tốc độ chuyển động của chúng trong gel phụ thuộc vào kích thƣớc, các phân tử DNA có kích thƣớc lớn thì chạy chậm hơn các phân tử các phân tử có kích thƣớc nhỏ.
Quy trình: Chuẩn bị gel agarose 1% bằng cách cân 1 g agarose trong 100 ml
dung dịch đệm 1x TAE và đun cho agarose tan hoàn toàn, để nguội khoảng 50°C rồi đổ vào khay điện di có cài sẵn lƣợc. Để gel đông khoảng 30 phút sau đó lấy lƣợc ra, cho bản gel vào bể điện di chứa đệm 1x TAE sao cho TAE ngập bản gel. 5 µlmẫu đƣợc trộn với 2 µl đệm 6x tra mẫu DNA (đệm mẫu giúp quan sát sự di chuyển của DNA và làm lắng mẫu xuống) để tra vào giếng. Chạy điện di ở 100 V, 400 mA trong khoảng 30 phút. Quan sát sự di chuyển của bromophenol để biết khi nào ngừng điện di. Nhuộm bản gel trong EtBr khoảng 20 phút. Kết quả đƣợc phân tích trên máy soi Gel Doc.