3. Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn
3.2.Những vector tách dòng và vector biểu hiện trong E coli
Escherichia coli hay còn đƣợc gọi là vi khuẩn đại tràng là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đƣờng ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim và động vật có vú). E. coli là vi khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý và không hình thành bào tử. Các tế bào thƣờng hình que dài khoảng 2,0 µm và đƣờng kính là 0,5 mm. E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae. Ƣu điểm của vi khuẩn E. coli là có tốc độ sinh trƣởng nhanh, khả năng biểu hiện protein mạnh nên giảm đƣợc chi phí công nghệ và hóa chất. Do đó, E. coli đƣợc chọn làm sinh vật mô hình để nghiên cứu trong phòng thí nghiệm trên khắp thế giới [79].
Các plasmid đƣợc sử dụng phổ biến hiện nay là các plasmid đa năng và chuyên dụng thuộc thế hệ thứ ba. Để tiện cho việc sử dụng nhiều enzyme cắt giới hạn, nhiều trình tự của chúng đã đƣợc xếp nối tiếp nhau thành một đoạn dài gọi là multiple cloning site (vị trí đa điểm tách dòng) [2].
Nhiều loại plasmid dùng cho E. coli có nguồn gốc từ thiên nhiên đƣợc thiết kế lại để thuận tiện cho việc sử dụng làm vector nhân dòng (cloning vector) hay để biểu hiện gen ngoại lai (expression vector). Các plasmid dùng để tạo dòng có đặc điểm nhƣ sau:
19
- Kích thƣớc tƣơng đối nhỏ, mang một hay nhiều gen chỉ thị chọn lọc cho phép xác định nhân tố biến nạp và duy trì trong quần thể vi khuẩn
- Chứa các vị trí nhận biết đa điểm tách dòng
- Phải có tâm tái bản cho phép vector tái bản trong tế bào nhận [2].
Để biểu hiện tất cả các gen ngoại lai trong E. coli đoạn gen ngoại lai phải đƣợc gắn vào trong vector biểu hiện (thƣờng là plasmid). Vector này phải có đủ các cấu trúc cần thiết sau [3]:
- Trình tự khởi đầu sao chép (ori) để có thể tạo ra nhiều bản sao trong tế bào vật chủ
- Các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker)
- Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc tac) cho phép sản xuất một lƣợng lớn mRNA từ các gen đƣợc tạo dòng
- Các trình tự kiểm soát dịch mã nhƣ trình tự liên kết ribosome (ribosome binding site) đƣợc bố trí thích hợp cùng với mã khởi đầu AUG và một trong ba mã kết thúc
- Có vị trí cắt đa điểm để đƣa gen ngoại lai vào theo một hƣớng chính xác với promoter (MCS).
Chỉ khi đƣợc cấu trúc đầy đủ nhƣ thế, các vector mới có thể biểu hiện gen ngoại lai trong E. coli [3]. Có nhiều loại vector tách dòng và vector biểu hiện trong
E. coli đƣợc thƣơng mại hóa. Một số vector thƣơng mại dùng tách dòng và biểu hiện trong E. coli đƣợc liệt kê trong bảng 1.2.
20
Bảng 1.2. Một số vector thƣơng mại dùng tách dòng và biểu hiện trong E. coli [75]
Vector Promoter Gen
chọn lọc Tags protease
Nguồn
gốc Hãng
Hệ pBAD/His araBAD Amp N-His Enterokinase pUC Invitrogen
Hệ pCal-c C T7-lac Amp CBP Thrombin ColE1 Stratagene
Hệ pET T7- lac Kan N-His
C-His Thrombin pBR322 Novagen
Hệ pGEX l T tac Amp GST Thrombin pBR322 Pharmacia
Hệ pPROLar lac-ara1 Kan Nc-Myc Enterokinase p15A Clontech
pQE-9 T5-lac Amp N-His ColE1 Qiagen
pTrc99A Trc Amp pBR322 Pharmacia
pTrcHis Trc Amp N-His Enterokinase pUC Invitrogen
Hệ pTriEx T7-lac Amp N-His C-His Thrombin Enterokinase pUC Novagen Hệ pALTER- (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ex1,2 T7 Tet Promega
Hệ pDUAL T7-lac Kan C-CBP Thrombin ColE1 Stratagene
Hệ pHAT lac Amp N-HAT Enterokinase pUC Clontech
Hệ pSE Trc Amp pUC Invitrogen
Tuy nhiên, việc sử dụng E. coli để sản xuất các protein tái tổ hợp phải đối mặt với nhiều vấn đề bất lợi về sinh học nhƣ: E. coli không thể đƣợc sử dụng nhằm sản xuất một số protein phức tạp lớn có chứa cầu nối disulfide hoặc các protein của eukaryote đòi hỏi phải sửa chữa sau phiên mã và sau dịch mã để tạo ra protein hoạt tính [79]. Do đó, muốn phục hồi đƣợc hoạt tính của các protein này đòi hỏi quy trình phức tạp và tốn kém. Protein ngoại tiết của E. coli thƣờng có tính ổn định thấp do nó dễ bị thủy phân. Ngoài ra, E. coli có thể gây bệnh và sinh độc tố đối với con ngƣời [79].
Trong khi đó, các chủng B. subtilis đƣợc sử dụng nhiều nhất vì đã đƣợc nghiên cứu tƣơng đối đầy đủ về đặc tính sinh lý, sinh hóa và di truyền với toàn bộ genome đã đƣợc xác định. B. subtilis nhƣ nhà máy tiềm năng để sản xuất các
21
protein vì nó có khả năng tiết các enzyme ngoại bào trực tiếp vào môi trƣờng nuôi cấy trong khi E. coli thƣờng có khả năng tiết enzyme nội bào nhiều hơn. Do vậy, B. subtilis đƣợc sử dụng để nâng cao chất lƣợng và làm tăng số lƣợng của các protein tiết ra ngoài môi trƣờng nhƣ interferon, hormone tăng trƣởng, pepsinogen và yếu tố tăng trƣởng biểu bì. Hơn nữa, B. subtilis đƣợc xem là sinh vật an toàn, không gây bệnh cho ngƣời và động vật [30]. Tuy nhiên, chúng có nhƣợc điểm là plasmid tái tổ hợp chứa DNA ngoại lai thiếu bền vững nên việc biểu hiện trên B. subtilis thƣờng yêu cầu tái tổ hợp vào nhiễm sắc thể. Do đó, để khảo sát đặc tính một enzyme mới ngƣời ta thƣờng lựa chọn biểu hiện trên E. coli trƣớc. Sau đó, khi sản xuất protein lƣợng lớn thì chuyển sang hệ thống biểu hiện của B. subtilis [65, 17, 55, 35].